Summary
Bu protokol, bozulmamış soya fasulyesi nodüllerinden ökaryotik polizom saflaştırma için bir yöntemi açıklar. Dizilemeden sonra, transkriptom ve translatom seviyelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genleri tanımlamak için gen ekspresyon analizi için standart boru hatları kullanılabilir.
Abstract
Bu protokolün amacı, soya fasulyesi (Glycine max) simbiyotik nodülün ökaryotik translatomunu incelemek için bir strateji sağlamaktır. Bu yazıda, RNA dizilimi kullanılarak analiz edilecek bitki kaynaklı poliribozomları ve bunlarla ilişkili mRNA'ları izole etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır. İlk olarak, sitoplazmik lizatlar, bütün, dondurulmuş soya fasulyesi nodüllerinden polizom ve RNA koruyucu koşullarda homojenizasyon yoluyla elde edilir. Daha sonra, lizatlar düşük hızlı santrifüjleme ile temizlenir ve süpernatantın% 15'i toplam RNA (TOTAL) izolasyonu için kullanılır. Kalan temizlenmiş lizat, iki katmanlı bir sakkaroz yastığı (% 12 ve% 33.5) aracılığıyla ultrasantrifüjleme yoluyla polizomları izole etmek için kullanılır. Polizom ile ilişkili mRNA (PAR), yeniden süspansiyondan sonra polisomal peletlerden saflaştırılır. Hem TOTAL hem de PAR, RNA-seks için dizileme kütüphanelerinin kalite standartlarını karşılamak için oldukça hassas kılcal elektroforez ile değerlendirilir. Bir aşağı akış uygulamasına örnek olarak, dizilemeden sonra, transkriptom ve translatom seviyelerinde diferansiyel olarak eksprese edilen genleri elde etmek için gen ekspresyon analizi için standart boru hatları kullanılabilir. Özetle, bu yöntem, RNA-sek ile kombinasyon halinde, simbiyotik nodül gibi karmaşık bir dokuda ökaryotik mRNA'ların translasyonel regülasyonunun incelenmesine izin verir.
Introduction
Soya fasulyesi (Glycine max) gibi baklagil bitkileri, rizobia adı verilen spesifik toprak bakterileri ile simbiyoz oluşturabilir. Bu karşılıklı ilişki, bitki kökleri üzerinde yeni organların, simbiyotik nodüllerin oluşumunu ortaya çıkarır. Nodüller, bakterileri barındıran bitki organlarıdır ve sitoplazması bakterioidler adı verilen özel bir rizobya formu ile kolonize edilen konakçı hücrelerden oluşur. Bu bakterioidler, atmosferik azotun (N2) amonyağa indirgenmesini katalize eder ve bu da karbonhidratlar karşılığında bitkiye aktarılır 1,2.
Bu azot sabitleyici simbiyoz, en iyi çalışılmış bitki-mikrop simbiyozlarından biri olmasına rağmen, farklı abiyotik stres koşullarına maruz kalan bitkilerin simbiyotik partnerleriyle etkileşimlerini nasıl modüle ettikleri ve bunun nodül metabolizmasını nasıl etkilediği gibi birçok yönün daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Bu süreçler, nodül translatomunu (yani, aktif olarak çevrilen mesajcı RNA'ların [mRNA'lar] alt kümesini) analiz ederek daha iyi anlaşılabilir. Poliribozomlar veya polizomlar, translasyon3'ü incelemek için yaygın olarak kullanılan, mRNA ile ilişkili çoklu ribozomların kompleksleridir. Polizom profilleme yöntemi, polizomlarla ilişkili mRNA'ların analizinden oluşur ve çeşitli biyolojik süreçlerde meydana gelen gen ekspresyonunu kontrol eden posttranskripsiyonel mekanizmaları incelemek için başarıyla kullanılmıştır 4,5.
Tarihsel olarak, genom ekspresyon analizi öncelikle mRNA bolluğunu belirlemeye odaklanmıştır 6,7,8,9. Bununla birlikte, gen ekspresyonunun posttranskripsiyonel düzenlemesinin farklı aşamaları, özellikle de translasyon10,11,12 nedeniyle transkript ve protein seviyeleri arasında korelasyon eksikliği vardır. Ayrıca, transkriptom seviyesindeki değişiklikler ile translatom13 seviyesinde meydana gelenler arasında herhangi bir bağımlılık gözlenmemiştir. Çevrilmekte olan mRNA setinin doğrudan analizi, hücre gen ekspresyonunun (son noktası protein bolluğu olan) sadece mRNA seviyeleri analiz edildiğinde elde edilenden daha doğru ve eksiksiz bir ölçümünü sağlar14,15,16.
Bu protokol, bitki kaynaklı polizomların, iki katmanlı bir sakkaroz yastığı aracılığıyla diferansiyel santrifüjleme ile bozulmamış soya fasulyesi nodüllerinden nasıl saflaştırıldığını açıklar (Şekil 1). Bununla birlikte, nodüllerde bakterioid kaynaklı ribozomlar da bulunduğundan, ökaryotik olanlar ana fraksiyonu (% 90 -% 95) temsil etse de, ribozomların ve RNA türlerinin bir karışımı saflaştırılır. Sonraki RNA izolasyonu, nicelleştirme ve kalite kontrolü de tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu protokol, RNA-sek ile kombinasyon halinde, simbiyotik nodül gibi karmaşık bir dokudaki ökaryotik mRNA'ların translasyonel regülasyonu hakkında deneysel sonuçlar sağlamalıdır.
Şekil 1: Simbiyotik nodüllerden ökaryotik polizom saflaştırma için önerilen metodolojiye şematik genel bakış. Şema, (1) bitki büyümesi ve (2) nodül hasadından (3) sitozolik ekstraktların hazırlanmasına, (3) TOTAL numunelerinin ve (4) PAR numunelerinin elde edilmesine ve (5) RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolüne kadar protokolde izlenen adımlara genel bir bakış sunmaktadır. Kısaltmalar: PEB = polizom ekstraksiyon tamponu; RB = süspansiyon tamponu; TOPLAM = toplam RNA; PAR = polizomla ilişkili mRNA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bitki büyümesi ve rizobya aşılaması
- Gerekli nodülleri üretmek için, seçilen soya fasulyesi tohumlarını seçilen substratta kontrollü koşullar altında bir büyüme odasına ekin.
NOT: Bu protokolde, tohumlar kum: vermikülit karışımı ile doldurulmuş 0.5 L'lik plastik bir şişeye ekildi (1: 1). Büyüme odası, sırasıyla 28 °C / 20 °C gündüz / gece döngüsü sıcaklığı ve sırasıyla 16 saat / 8 saat açık / karanlık fotoperiyodu ile ayarlandı. Fotosentetik olarak aktif radyasyon yoğunluğu 620 μmol · m − 2 · s − 1 idi. - Önceden sıvı Maya-Ekstrakt Mannitol (YEM)-ortam hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ortamı otoklav edin.
- Tohum ekiminin aynı gününde, 100 mL YEM içeren bir şişeyi Bradyrhizobium elkanii U1302 suşu ile aşılayın. Şişeyi 28 ° C'de 100 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Rizobia'nın 2 gün boyunca büyümesine izin verin ve fideleri 2 mL kültür ile aşılayın.
2. Su açığı arıtma (isteğe bağlı)
NOT: Bu protokol, soya fasulyesi bitkilerinin su açığı arıtımını özetlemektedir. Bu bölüm, eldeki deneysel soruya bağlı olarak tamamen değiştirilebilir veya atlanabilir.
- Soya fasulyesi fidelerini su kısıtlaması olmadan 19 gün boyunca (V2-3 gelişim aşaması) büyütün. 0,5 mM KNO3 ile desteklenen B&D-orta17 ile substratı saha kapasitesinde tutun.
- 20. günde, sulamayı çekin.
NOT: Burada, su içeriği büyüme ve su açığı dönemlerinde günlük olarak gravimetri (su gravimetrik içeriği) ile ölçülmüştür. - 20. günden su açığı süresinin sonuna kadar, üretici tarafından talimat verildiği gibi ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir porometre ile abeksenel yaprak yüzeyinde günde üç kat stoma iletkenliğini ölçün.
NOT: Su açığı periyodunun sonu, stoma iletkenlik değerinin ekimden 20. günde elde edilenin yaklaşık% 50'si olduğu her bitki için ayrı ayrı belirlenmiştir.
3. Nodül hasadı
- Sıvı azotu temiz bir kapta toplayın ve 15 mL tüpleri etiketleyin (her bitki için bir tane).
DİKKAT: Sıvı nitrojeni kriyo eldivenler, yüz siperlikleri ve güvenlik gözlükleri giyerek kullanın. - Her bitkiyi ayrı ayrı alın. Hava kısmını kesin ve atın. Kalan substratı çıkarmak için kökü suyla iyice yıkayın.
- Her nodülü kökten ayırın ve önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Tüpleri çıtçıtla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
4. Sitozolik ekstraktların hazırlanması
NOT: Bu protokolün nihai amacı, yüksek kaliteli toplam RNA (TOTAL) ve polizomla ilişkili RNA (PAR) elde etmektir. Bu nedenle, RNA bozulmasını önleyen, numuneleri daima 4 ° C'de tutan ve RNaz içermeyen laboratuvar ekipmanı ve çözeltileri kullanan koşullar altında çalışın. Belirtilmediği sürece, tüm çözeltiler steril ultra saf su ile hazırlanır.
- Tampon stok çözeltilerinin hazırlanması
- Tablo 1'de listelenen otoklavlanabilir stok çözeltilerini hazırlayın, 15 dakika otoklav yapın ve RT'de tutun.
- Tablo 1'de listelenen filtreyle sterilize edilebilir stok çözeltilerini hazırlayın, filtreleyerek sterilize edin ve -20 °C'de tutun.
- Polizom ekstraksiyon tamponunu hazırlayın (PEB, bakınız Tablo 1) ve buz üzerinde tutun.
NOT: Verilen hacimler altı örnek içindir. - Santrifüjü 4 °C'ye soğutun ve buzun üzerine 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin.
- Bir tartım kabında yaklaşık 0,2 g bozulmamış nodülü tartın ve bunları önceden soğutulmuş 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: Numunelerin çözülmesini önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Alternatif olarak, 0.2 g yerine tahmini 0.4-0.5 mL'lik bir nodül hacmi kullanılabilir. - 1,2 mL PEB ekleyin, numunenin 2 dakika boyunca çözülmesine izin verin ve nodüllerin tamamen bozulmasına ve homojenizasyonuna kadar bir doku öğütücü ile homojenize edin.
NOT: Nodülleri çözüldükten sonra öğüttüğünüzden emin olun, çünkü mikrosantrifüj tüplerinde doku öğütücülerle kolayca bozulabilecek kadar yumuşak olacaklardır (Malzeme Tablosuna bakınız). Dondurulmuş nodüllerin öğütülmesi zordur. Ayrıca, numuneleri serin tutarken uygun homojenizasyon için tüplerin bir tezgah üstü soğutucuya (0 °C) yerleştirilmesi önerilir. - Numuneleri buz üzerinde 10 dakika boyunca veya tüm numuneler işlenene kadar nazik bir ajitasyonla inkübe edin.
- Enkazı pelet etmek için 16.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı kurtarın ve santrifüj adımını tekrarlayın.
- Berraklaştırılmış sitozolik ekstraktı dikkatlice geri kazanın ve 200 μL'lik bir alikotu TOTAL izolasyonu için temiz bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (TOTAL örnekleri; bakınız bölüm 7).
5. Sakkaroz minderlerinin hazırlanması
NOT: Bu protokol, 13,2 mL ultrasantrifüj tüplerde iki katmanlı bir sakkaroz yastığı (%12 ve %33,5) kullanır ( bkz. Tüm çözeltiler steril ultra saf su ile hazırlanır.
- Sakkaroz ve tuz stok çözeltilerini hazırlayın.
- 100 mL'lik 2 M sakkaroz çözeltisi hazırlayın (%68,5, Tablo 1).
- 10x tuz çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
- Sakkaroz yastığının iki katmanını Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın. Antibiyotik (CHX ve CHL) stok çözeltilerinin bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
NOT: Verilen hacimler altı minder içindir. - %33,5 sakkaroz tabakasının 4,5 mL'sini santrifüj tüplerine dökün. Ardından, %12'lik tabakanın 4,5 mL'sini bir P1000 mikropipetle dikkatlice ve yavaşça ekleyin. Berraklaştırılmış sitozolik ekstraktın eklenmesine kadar tüpleri buz üzerine koyun.
6. Polizom saflaştırma
- Arıtılmış sitozolik ekstraktın 1 mL'sini (adım 4.8) tüpün yan duvarına dikkatlice pipetleyerek sakkaroz yastığının üzerine yükleyin.
- Ultra santrifüj borularını önceden soğutulmuş kovalara aktarın ve 4 ° C'de 2 saat boyunca 217.874 × g'de (referans verilen rotorda 35.000 rpm [ Malzeme Tablosuna bakınız]) santrifüj yapın.
- Kalan sitozolik ekstraktı ve sakkaroz yastığını atın ve polizomal peleti 200 μL önceden soğutulmuş RB (daha önce Tablo 1'e göre hazırlanmış) ile yeniden askıya alın.
- Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve ardından polisomal resüsitasyonu 1,5 mL önceden soğutulmuş tüplere aktarın. RNA ekstraksiyonuna (PAR örnekleri) devam edin.
7. RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolü
NOT: Bu adım, TOTAL (adım 4.8) ve PAR örnekleri (adım 6.4) için gerçekleştirilir.
- Steril ultra saf su ile %75 EtOH hazırlayın ve -20 °C'ye soğutun. Ek olarak, kloroform ve izopropanolü -20 ° C'ye kadar soğutun.
- Numuneleri 750 μL RNA izolasyon reaktifi ile homojenize edin ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
- 200 μL soğuk kloroform ekleyin ve tüpleri 15 saniye boyunca kuvvetlice sallayın. RT'de 10 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Faz ayrımı için 12.000 × g'da 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj. Üst sulu fazın 500 μL'sini pembe organik fazı bozmadan temiz bir tüpe aktarın ve 375 μL soğuk izopropanol ve 0.5 μL RNaz içermeyen glikojen ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice karıştırın.
NOT: Glikojen alkol çökelmesinden nükleik asit geri kazanımını arttırmak için ko-çökeltici olarak kullanılan bir taşıyıcıdır. - Karışımı 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve 15 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj yapın. Süper natantı atın.
- RNA çökeltiyi 1 mL soğuk% 75 EtOH ile yıkayın. Kısa girdapla karıştırın.
NOT: Bu noktada, numuneler gece boyunca -20 ° C'de saklanabilir. - 4 °C'de 5 dakika boyunca 7.500 × g'da santrifüj yapın, süpernatantı bir mikropipetle dikkatlice çıkarın ve RNA peletini havayla kurutun.
- Peleti 50 μL RNaz içermeyen suda çözün ve 5 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
- RNA konsantrasyonunu ve bütünlüğünü, son derece hassas kılcal elektroforez18 (Malzeme Tablosuna bakınız) ve/veya %2 RNaz içermeyen agaroz jeli19 üzerindeki elektroforez ile değerlendirin (bakınız Malzeme Tablosu).
NOT: RNA örnekleri hemen kullanılmayacaksa veya RNA-seq kütüphanesi hazırlığı için dizileme tesisine gönderilecekse, bunları çökeltmek için EtOH kullanılması önerilir.
8. RNA çökelmesi
- Santrifüjü ve EtOH'yi 4 °C'ye soğutun.
- 3 M sodyum asetat hazırlayın.
- Steril ultra saf su ile %70 EtOH hazırlayın ve -20 °C'ye soğutun.
- Örnek hacmini tahmin edin. 0.1 hacim 3 M sodyum asetat, 3 hacim soğuk EtOH ve 0.5 μL RNaz içermeyen glikojen ekleyin. İyice karıştırın.
- Gerekene kadar -20 °C'de bırakın.
NOT: RNA çökeltilmiş numuneler -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir.
9. Gen ekspresyon analizi için standart boru hattı
- Kendinden emin transkriptom ve translatom veri analizi için okuma uzunluğu >100 bp olan ortalama 40M Illumina çift uçlu okumalar gerçekleştirin.
NOT: Standart RNA-seq veri analizi aşağıdaki 9.2-9.5 adımlarını içerir. - FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) veya çok örnekli MultiQC20'yi kullanarak okuma kalitesi kontrolü gerçekleştirin.
- Adaptörü ve düşük kaliteli dizileri diğerlerinin yanı sıra Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt 22, orak23 veya Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) kullanarak kaldırın.
- Türler için bir referans genom mevcutsa, referansa karşı okuma haritalaması yapın, ardından diğer açık kaynaklı araçların yanı sıra Bowtie2 24, TopHat225 veya Salmon26 ve featureCounts27 kullanarak bolluk ölçümü yapın.
- Diğerlerinin yanı sıra edgeR28, DESeq229 veya limma30 kullanarak diferansiyel eksprese genlerin tanımlanması için istatistiksel analiz yapın.
NOT: Bu açık kaynaklı yazılımlar komut satırı aracılığıyla yerel olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, grafik bir kullanıcı arayüzü sunan Galaxy31 veya GEOexplorer32 gibi genel bir sunucudaki bir web tarayıcısı aracılığıyla çalıştırılabilirler, böylece kullanımları için komut satırı bilgisi gerekmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda belirtilen prosedürle saflaştırılan TOTAL ve PAR fraksiyonlarının miktar ve kalite değerlendirmesi, başarısını belirlemenin anahtarıdır, çünkü RNA dizilimi gibi çoğu aşağı akış uygulaması için, yüksek kaliteli numuneler kütüphane hazırlama ve dizileme için temeldir. Dahası, RNA moleküllerinin bütünlüğü, numune toplama anında gen ekspresyon profilinin anlık görüntüsünün yakalanmasına izin verir18. Bu bağlamda, bu ölçümler bir Biyoanalizör kullanılarak gerçekleştirilirken bir RNA bütünlük numarası (RIN) elde edilir. RIN, bütünlük değerlerini sağlam, güvenilir ve kullanıcıdan bağımsız bir şekilde, 10 (bozulmamış) ile 1 (tamamen bozuk)18 arasında değişen bir şekilde atamak için kullanılır.
Şekil 2A,B, birkaç TOTAL ve PAR numune fraksiyonu için yüksek hassasiyetli kılcal elektroforez sisteminin (Biyoanalizör) standart çıktısını göstermektedir. Keskin ribozomal RNA (rRNA) bantları herhangi bir lekeli görünüm olmadan görselleştirilebildiği için tüm örnekler için çok iyi kalite gözlenir. Ancak bu, bozulmamış örneklere karşılık gelen 5,9 ile 7,5 arasında değiştiğinden RIN değerlerine yansıtılmaz. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, Şekil 2C'de görülebileceği gibi, numune bozulmasının görsel bir işareti yoktur. Şekil 2D, karşılaştırma için neredeyse tamamen bozulmuş bir numunenin biyoanalizör sonucunun bir örneğini göstermektedir. Ekipman ayrıca, hem TOTAL hem de PAR numuneleri için elektroferogramlarda görüldüğü gibi 18S ve 25S zirvelerini tanımlayamadı (Şekil 2B). Sonuç olarak, ribozomal bantların oranı (25S: 18S; RNA bütünlüğünün bir başka göstergesi) hesaplanamadı. Yüksek kaliteli RNA genellikle 25S: 18S 2: 1 oranı33 sergiler.
Şekil 2: Toplam RNA ve polisom ile ilişkili mRNA miktarı ve kalite değerlendirmesi . (A) Yüksek hassasiyetli kılcal elektroforezin (Biyoanalizör) temsili sanal jel rekonstrüksiyonu, ilgili RIN ve konsantrasyon değerleri ile 12 numuneden elde edilen sonuçlardır. Şerit 1'den şerit 6'ya kadar altı nodül örneğinin toplam RNA (TOTAL) fraksiyonlarına karşılık gelir ve şerit 7'den şerit 12'ye kadar aynı numunelerin polizomla ilişkili mRNA (PAR) fraksiyonlarına karşılık gelir. Yeşil çizgi: Tüm şeritlerde bulunan alt işaretleyici. (B) Elektroferogram gösterimi, numune 4 (TOTAL örneği olarak) ve numune 10 (PAR örneği olarak) için gösterilmiştir. 18S ve 25S zirveleri belirtilmiştir. Muhtemelen 16S ve 23S'ye (prokaryotik rRNA'lar) karşılık gelen zirveler * ile gösterilir. Bu zirvelerdeki yakınlaştırmalar gösterilir (B1 ve B2). Ökaryot Total RNA Nano testi Biyoanalizörde kullanıldı. (C) Altı numuneden elde edilen temsili agaroz jeli elektroforezi sonuçları (solda): 10 μL TOTAL ve PAR fraksiyonları% 2'lik bir agaroz jeli üzerine yüklendi ve ayrıldı (35 dakika boyunca 80 V). Sağda, prokaryotik rRNA'ların daha net bir şekilde görselleştirilebileceği sadece örnek 2'nin başka bir jeli vardır. Ökaryotik rRNA (18S ve 25S) siyah ok uçları ve prokaryotik rRNA'lar (16S ve 23S) gri ok uçları ile gösterilir. (D) Bozulmuş bir numunenin Biyoanalizör sonucu örneği. L: standart merdiven. Yeşil çizgi: Tüm şeritlerde bulunan alt işaretleyici. Kısaltmalar: RIN = RNA bütünlük numarası; PAR = polisom ile ilişkili mRNA; nt = nükleotidler; L = standart merdiven. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bu örnekler ökaryotik ve prokaryotik RNA'ların bir arada bulunduğu simbiyotik nodüllerden geldiğinden, saflaştırılmış RNA her iki türün bir karışımıdır (ökaryotik olanlar çoğunlukta olmasına rağmen). Bu nedenle, elektroferogramlarda 16S ve 23S rRNA'ya karşılık gelen zirveleri gözlemlemesi beklenmektedir (Şekil 2B ve yakınlaştırma B1 ve B2). Bu "ekstra" zirveler, elde edilen düşük RIN değerlerini açıklayabilir.
Ekipman ayrıca referans olarak 1. şeritteki standart merdiveni dikkate alarak numune konsantrasyonlarını hesaplar. Beklendiği gibi, TOTAL numuneleri PAR numunelerinden daha yüksek konsantrasyon değerleri sunar. Yine de, bunlar için bile, kütüphane hazırlığı ve RNA-seq ile devam etmek için yeterli RNA vardır, çünkü numune miktarı gereksinimleri tipik olarak en az 1.0 μg önermektedir.
| Oda sıcaklığında saklanacak otoklavlanabilir çözeltiler |
| 2 M Tris-HCl pH 9,0 |
| 2 M KCl |
| 0,5 m EGTA pH 8,0 (10 m NaOH ile ayarlanır) |
| 1 M MgCl2 |
| %20 (v/d) PTE (çözeltiyi pipetlemeden önce şişeyi çalkalayın) |
| %10 DOKÜMAN |
| %20 Deterjan karışımı: %20 (w/v) Brij L23, %20 (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, %20 (v/v) Ara 20 (60 °C'de ısıtılırken çözünür) |
| -20 °C'de dondurulacak filtre sterilize edilebilir çözeltiler |
| 0,5 milyon DTT |
| 0,5 milyon PMSF |
| 50 mg.mL-1 sikloheksimid (CHX) (EtOH'de) |
| 50 mg.mL-1 kloranfenikol (CHL) (EtOH cinsinden) |
| Stok çözümü | 10 mL PEB için hacim (μL) | 2 mL RB için hacim (μL) |
| 2 M KCl | 1,000 | 200 |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 M MgCl2 | 356 | 70 |
| %20 (d/d) PTE | 500 | - |
| %10 DOKÜMAN | 1,000 | - |
| %20 Deterjan karışımı | 500 | - |
| 0,5 milyon DTT | 100 | 20 |
| 0,5 milyon PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M sakkaroz çözeltisi (% 68.5): Suda 68.5 g sakkaroz. Oda sıcaklığında (RT) tutun. | ||
| 10x tuz çözeltisi: 0,4 M Tris-HCl pH 8,4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; 15 dakika otoklav, -20 °C'de dondurun. | ||
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponlar ve çözeltiler. Verilen hacimler altı örnek içindir. Kısaltmalar: EGTA = etilen glikol-bis (2-aminoetilet) -N,N,N',N'-tetraasetik asit; PTE = polioksietilen (10) tridesil eter; DOC = sodyum deoksikolat; DTT = ditiyotreitol; PMSF = fenilmetansülfonil florür.
| Sakkaroz tabakası (%) | Sakkaroz 2 M (mL) | Tuz çözeltisi 10x (mL) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (mL) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tablo 2: İki sakkaroz tabakasının bileşimi (%12 ve %33,5). Verilen ciltler altı minderin hazırlanması içindir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gen ekspresyonu regülasyonunu translasyonel düzeyde incelemek, farklı biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir, çünkü hücre gen ekspresyonunun son noktası protein bolluğudur13,14. Bu, polisomal fraksiyonun saflaştırılması gereken ilgili doku veya organizmanın translatomunu analiz ederek ve ilişkili mRNA'larıanaliz ederek değerlendirilebilir 3,4,34,35,36.
Burada soya fasulyesi simbiyotik nodül polizomlarını sakkaroz yastıklarından arındırmak için bir yöntem sunulmuş, bunu TOTAL ve PAR ekstraksiyonu izlemiştir. Her iki RNA fraksiyonunun elde edilmesi, bu protokolün ilgili bir noktasıdır, çünkü RNA-seq ve gen ekspresyonu için standart boru hatları daha sonra uygulanabilir. Böylece, nodülün transkriptomu ve translatomu incelenebilir.
Polizom saflaştırma için alternatif bir yöntem, ribozom afinite saflaştırma (TRAP) yöntemidir; burada ribozomal protein L18'in epitop etiketli bir versiyonunun ekspresyonu, ribozomların immünopresipitasyonuna izin verir37,38. Bununla birlikte, bu yöntem, soya fasulyesi gibi bazı türler için zor olabilecek transgenik bitkilerin üretilmesini gerektirir. Dahası, polizom saflaştırmadan sonra ribozom korumalı mRNA fragmanlarının derin dizilimini içeren ribozom profillemesi veya Ribo-seq yöntemi 15,39,40,41, translatomun polizom profillemesinden daha yüksek çözünürlükte incelenmesi için bir alternatiftir, çünkü ribozomların bireysel mRNA'lar üzerindeki kesin sayısı ve konumu değerlendirilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha zahmetlidir, daha yüksek miktarda numune gerektirir ve küçük RNA parçaları geri kazanıldığı için hesaplama açısından yoğundur.
Bu protokolde olduğu gibi, özellikle dondurulmuş doku kullanılıyorsa, polizomların saflaştırılacağı numunenin kalitesi gibi dikkate alınması gereken birkaç kritik deneysel husus vardır. Sağlam nodüller kökten ayrılmalı ve -80 ° C'de depolanmadan önce derhal sıvı azotta dondurulmalıdır. Deneyimlerimize göre, polizomlar ve bunlarla ilişkili mRNA'lar, depolamadan sonraki birkaç ay içinde nodüllerden başarıyla saflaştırılabilir. Ayrıca, tüm protokol, cDNA sentezi ve yüksek verimli dizileme gibi aşağı akış uygulamaları için kritik olan yüksek kaliteli TOTAL ve PAR elde etmek için RNA bozulmasını önleyen koşullar altında uygulanmalıdır.
Yöntemin önemli bir sınırlaması ultrasantrifüjleme adımıdır, çünkü ultrasantrifüjler birçok laboratuvarda yaygın olarak bulunmaz. Ayrıca, santrifüjleme adımından sonra elde edilen peletin, polizomların yanı sıra, translasyonel olarak aktif olmayan diğer ribonükleoprotein komplekslerini içerebileceğini belirtmek önemlidir. Ayrıca, burada sunulan protokolün başka bir soya fasulyesi dokusu ile gerçekleştirilmesi durumunda göz önünde bulundurulması gereken bir husus, muhtemelen numune miktarının, numune: PEB oranının ve homojenizasyon prosedürünün optimize edilmesini gerektireceğidir.
Bu protokolde kullanılan numunenin, bir bitki kök hücresi ile bir bakteri arasındaki simbiyotik bir etkileşim nedeniyle oluşan bir organ olduğu göz önüne alındığında, her iki organizmadan gelen transkripsiyonel ve translasyonel yanıtların incelenmesine izin vereceği için bir Çift RNA-sekq analizi42 (TOTAL ve PAR örnekleri ile) yapmak ilginç olacaktır. Burada açıklanan yöntem, bakteriyel RNA'ların ekstraksiyonu optimize edilirse bu konuda yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma CSIC I + D 2020 hibe No. 282, FVF 2017 hibe No. 210 ve PEDECIBA (María Martha Sainz) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
