Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Forberedelse, egenskaber, toksicitet og effektivitetsevaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64299
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Centre of Immunological Products, Department of Microbiology and Biochemical Pharmacy, College of Pharmacy, Third Military Medical University of Chinese PLA

Summary

Her præsenterer vi detaljerede metoder til fremstilling og evaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine in vitro og in vivo.

Abstract

Epitoppeptider har tiltrukket sig udbredt opmærksomhed inden for tumorvacciner på grund af deres sikkerhed, høje specificitet og bekvemme produktion; især kan nogle MHC I-begrænsede epitoper inducere effektiv cytotoksisk T-lymfocytaktivitet for at rydde tumorceller. Derudover er nasal administration en effektiv og sikker leveringsteknik til tumorvacciner på grund af dens bekvemmelighed og forbedrede patientoverholdelse. Imidlertid er epitoppeptider uegnede til nasal levering på grund af deres dårlige immunogenicitet og manglende leveringseffektivitet. Nanoemulsioner (NE'er) er termodynamisk stabile systemer, der kan fyldes med antigener og leveres direkte til næseslimhindens overflade. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) er kernen pentapeptid af laminin, et integrinbindende peptid udtrykt af humane respiratoriske epitelceller. I denne undersøgelse blev en intranasal selvmonteret epitoppeptid NE tumorvaccine indeholdende det syntetiske peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) fremstillet ved en lavenergiemulgeringsmetode. Kombinationen af IKVAV og OVA257-264 kan øge antigenoptagelsen i næseslimhindeepitelceller. Her etablerer vi en protokol til undersøgelse af de fysisk-kemiske egenskaber ved transmissionselektronmikroskopi (TEM), atomkraftmikroskopi (AFM) og dynamisk lysspredning (DLS); stabilitet i nærvær af mucinprotein; toksicitet ved undersøgelse af cellelevedygtigheden af BEAS-2B-celler og næse- og lungevæv hos C57BL/6-mus cellulær optagelse ved konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM); frigivelsesprofiler ved at afbilde små dyr in vivo og vaccinens beskyttende og terapeutiske virkning ved hjælp af en E.G7 tumorbærende model. Vi forventer, at protokollen vil give tekniske og teoretiske fingerpeg om den fremtidige udvikling af nye T-celleepitoppeptidslimhindevacciner.

Introduction

Som en af de mest kritiske innovationer inden for folkesundhed spiller vacciner en central rolle i bekæmpelsen af den globale byrde af sygdommehos mennesker 1. F.eks. testes der i øjeblikket mere end 120 kandidatvacciner mod covid-19-sygdomme, hvoraf nogle er blevet godkendt i mange lande2. Nylige rapporter siger, at kræftvacciner effektivt har forbedret fremskridtene med kliniske kræftbehandlinger, fordi de leder kræftpatienters immunsystem til at genkende antigener som fremmede for kroppen3. Desuden kan flere T-celleepitoper placeret inden for eller uden for tumorceller bruges til at designe peptidvacciner, som har vist fordele ved behandling af metastatiske kræftformer på grund af manglen på den signifikante toksicitet forbundet med strålebehandling og kemoterapi 4,5. Siden midten af 1990'erne er prækliniske og kliniske forsøg med tumorbehandling hovedsageligt blevet udført ved hjælp af antigenpeptidvacciner, men få vacciner udviser en tilstrækkelig terapeutisk effekt på kræftpatienter6. Desuden har kræftvacciner med peptidepitoper dårlig immunogenicitet og utilstrækkelig leveringseffektivitet, hvilket kan skyldes den hurtige nedbrydning af ekstracellulære peptider, der diffunderer hurtigt fra administrationsstedet, hvilket fører til utilstrækkelig antigenoptagelse af immunceller7. Derfor er det nødvendigt at overvinde disse hindringer med vaccineleveringsteknologi.

OVA 257-264, MHC klasse I-bindende257-264 epitop udtrykt som et fusionsprotein, er en hyppigt anvendt model epitop8. Derudover er OVA257-264 afgørende for det adaptive immunrespons mod tumorer, som afhænger af det cytotoksiske T-lymfocytrespons (CTL). Det medieres af antigenspecifikke CD8 + T-celler i tumoren, som induceres af OVA257-264-peptidet . Det er kendetegnet ved utilstrækkelig granzym B, som frigives af cytotoksiske T-celler, hvilket fører til apoptose af målceller8. Imidlertid kan fri OVA257-264 peptidadministration inducere lidt CTL-aktivitet, fordi optagelsen af disse antigener forekommer i uspecifikke celler snarere end antigenpræsenterende celler (APC'er). Manglen på passende immunstimulering resulterer i CTL-aktivitet5. Derfor kræver induktion af effektiv CTL-aktivitet betydelige fremskridt.

På grund af barrieren fra epitelceller og den kontinuerlige udskillelse af slim fjernes vaccineantigener hurtigt fra næseslimhinden 9,10. Udvikling af en effektiv vaccinevektor, der kan passere gennem slimhindevævet, er afgørende, fordi de antigenpræsenterende celler er placeret under slimhindepitelet9. Intranasal injektion af vacciner inducerer teoretisk slimhindeimmunitet for at bekæmpe slimhindeinfektion11. Derudover er nasal levering en effektiv og sikker administrationsmetode til vacciner på grund af dens bekvemmelighed, undgåelse af tarmadministration og forbedret patientoverensstemmelse7. Derfor er nasal levering et godt administrationsmiddel til den nye peptidepitop nanovaccine.

Flere syntetiske biomaterialer er blevet udtænkt til at kombinere epitoper af celle-væv og celle-celle interaktioner. Visse bioaktive proteiner, såsom Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), er blevet introduceret som en del af hydrogelens struktur for at give bioaktivitet12. Dette peptid bidrager sandsynligvis til cellebinding, migration og udvækst13 og binder integriner α 3β1 ogα 6β1 til at interagere med forskellige kræftcelletyper. IKVAV er et celleadhæsionspeptid afledt af lamininkældermembranproteinet α1-kæden, der oprindeligt blev brugt til at modellere det neurale mikromiljø og forårsage neuronal differentiering14. Derfor er det vigtigt at finde et effektivt leveringsmiddel til denne nye vaccine for sygdomsbekæmpelse.

Nyligt rapporterede emulsionssystemer, såsom W805EC og MF59, er også blevet sammensat til levering af næsehulen af inaktiveret influenzavaccine eller rekombinant hepatitis B-overfladeantigen og illustreret til at udløse både slimhinde og systemisk immunitet15. Nanoemulsioner (NE'er) har fordelene ved nem administration og bekvem co-formation med effektive adjuvanser sammenlignet med partikelslimhindeafgivelsessystemer16. Nanoemulsionsvacciner er blevet rapporteret at ændre den allergiske fænotype på en vedvarende måde, der adskiller sig fra traditionel desensibilisering, hvilket resulterer i langsigtede undertrykkende virkninger17. Andre rapporterede, at nanoemulsioner kombineret med Mtb-specifikke immunodominant antigener kunne inducere potente slimhindecelleresponser og give betydelig beskyttelse18. Derfor blev en ny intranasal selvsamlet nanovaccine med det syntetiske peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, peptidet bestående af IKVAV bundet til OVA257-264) designet. Det er vigtigt at vurdere denne nye nanovaccine systematisk.

Formålet med denne protokol er systematisk at evaluere nanovaccinens fysisk-kemiske egenskaber, toksicitet og stabilitet, påvise, om antigenoptagelse og beskyttende og terapeutiske virkninger forbedres ved hjælp af tekniske midler, og uddybe det vigtigste eksperimentelle indhold. I denne undersøgelse etablerede vi en række protokoller til at studere de fysisk-kemiske egenskaber og stabilitet, bestemme størrelsen af toksiciteten af I-OVA NE til BEAS-2B-celler af CCK-8 og observere BEAS-2B-cellernes antigenpræsenterende evne til vaccinen ved hjælp af konfokal mikroskopi, evaluere frigivelsesprofilerne for denne nye nanovaccine in vivo og in vitroog detektere den beskyttende og terapeutiske virkning af denne vaccine ved hjælp af en E.G7-OVA tumorbærende musemodel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreforsøgene blev udført i overensstemmelse med Laboratory Animal-Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) og blev godkendt af Laboratory Animal Welfare and Ethics Committee ved Third Military Medical University. Musene blev aflivet ved en intraperitoneal injektion af 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital.

1. Forberedelse af I-OVA NE

  1. Bland 1 mg monophosphoryllipid A (MPLA) med 100 μL DMSO, hvirvel i 5 minutter, og lad det stå i 4 timer ved stuetemperatur (RT) for at opløses fuldstændigt.
  2. Der tilsættes kvantitativt Tween 80 og I-OVA, og blandes.
    BEMÆRK: Tween 80 og I-OVA blev blandet i et masseforhold på 25:119.
  3. Der tilsættes squalen i blandingen fremstillet i trin 1.2 (7:3, Smix: squalen).
  4. Der tilsættes 100 μl MPLA-opløsning (10 mg/ml) til blandingen fremstillet i trin 1.3.
  5. Forbered nanoemulsionsvaccinen ved hjælp af lavenergiemulgeringsmetoder19: Tilsæt den blandede opløsning til vanddråber ved ca. 70% af det samlede volumen og rør forsigtigt for at opnå en gennemsigtig og let flydende blanding.
    BEMÆRK: BNE-kontrollen (blindprøveemulsion) blev fremstillet ved samme metode og erstattede vand med I-OVA.

2. Fysisk-kemisk karakterisering og stabilitet

BEMÆRK: Vurder dråbestørrelsesfordelingen, zetapotentialet og andre fysisk-kemiske data for I-OVA NE-vaccinen efter trin 2.1-2.3; udføre morfologisk karakterisering af I-OVA NE-vaccinen efter trin 2.4-2.7 og undersøge 3D-strukturen af I-OVA NE-vaccinen efter trin 2.8-2.9.

  1. Bland 50 mg mucinprotein med 100 ml vand til injektion for at fremstille en 0,05% mucinopløsning.
  2. 4 mg/mL I-OVA NE fortyndes 200 gange med 0,05 mg/ml mucinprotein eller deioniseret vand.
  3. Overhold partikelstørrelser, zetapotentiale, polydispersitetsindeks (PDI) og elektroforetisk mobilitet ved 25 °C ved hjælp af en nanoanalysator19.
  4. 10 μL I-OVA NE fortyndes 200 gange med 2 ml deioniseret vand.
  5. 5 μL forfortyndet I-OVA NE-vaccine (trin 2.4) anbringes på et kulstofbelagt kobbergitter, og det dækkes med 10 μL 1 % phosphowolframsyre i 3 min.
  6. Fjern overskydende phosphowolframsyre med filterpapir.
  7. Hent billeder ved hjælp af TEM. En 10 μL prøve fortyndet 50 gange anbringes på et 100-mesh kulstofkobbergitter, og lad det stå ved stuetemperatur (RT) i 5 minutter, før der tilsættes 10 μL phosphowolframsyre (1%, pH 7,4). Alle prøveemner undersøges med TEM ved en spænding på 120 kV.
  8. Karakteriser den molekylære morfologi af I-OVA NEved hjælp af et højopløsnings atomkraftmikroskop. Få farvebillederne af I-OVA NE under følgende betingelser: for wolframsonder (kraftkonstant: 0,06 N·m-1); Scanningsområde: 450 nm x 450 nm; tappetilstand: billedtilstand; og scanningsmetode: punkt-for-punkt scanning ved RT.

3. In vitro- og in vivo-toksicitetsassays

BEMÆRK: In vitro-toksiciteten af I-OVA NE-vaccinen blev vurderet efter trin 3.1-3.9, og in vivo-toksiciteten af I-OVA NE-vaccinen blev vurderet efter trin 3.10-3.13.

  1. Humane BEAS-2B-epitelceller genoplives efter trin 3.1.1-3.1.4 og dyrkes i et komplet vækstmedium ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
    BEMÆRK: For at forberede det komplette vækstmedium tilsættes føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin til RPMI-1640-substratet ved endelige koncentrationer på henholdsvis 10% og 1%.
    1. Tænd for vandbadet og juster temperaturen til 37 °C. Fjern hætteglassene med celler, der er frosset i flydende nitrogen, og tø hurtigt op i et 37 °C vandbad.
    2. Efter optøning pipetteres cellerne hurtigt i et 15 ml sterilt centrifugeglas, tilsættes 2 ml af hele vækstmediet, og centrifugeres ved 129 x g i 5 min.
    3. Supernatanten fjernes, tilsættes 2 ml af hele vækstsubstratet for at resuspendere cellerne, og der centrifugeres ved 129 x g i 5 minutter.
    4. Supernatanten fjernes, der tilsættes 6 ml komplet vækstmedium for at genopslæmme cellerne, og cellerne overføres til en T25-dyrkningskolbe for at dyrke cellerne ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
  2. Når celletætheden når 80% -90%, kasseres dyrkningsmediet og vaskes cellerne to gange med 2 ml PBS. Tilsæt 1 ml 0,25% trypsin for at fordøje cellerne i 1-2 min. Når afrunding af cellerne observeres, tilsættes straks 4 ml af det komplette vækstmedium for at neutralisere trypsinet.
  3. Bland og aspirer prøverne til et 15 ml sterilt centrifugeglas og centrifuger ved 129 x g i 5 min.
  4. Supernatanten fjernes og cellerne resuspenderes i 1 ml RPMI-1640 komplet substrat. Brug 20 μL til celletælling, og fortynd cellerne til 1 x 105 celler/ml.
  5. BEAS-2B-cellerne beas-2B-cellerne begives med en massefylde på 1 x 104 celler/hul i plader med 96 brønde i 100 μL RPMI-1640-komplet, og pladerne præinkuberes i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
  6. Supernatanten kasseres, og der tilsættes 100 μL I-OVA NE, 100 μL I-OVA+BNE (fysisk blandet) og 100 μL I-OVA forfortyndet med et komplet vækstmedium ved forskellige endelige koncentrationer (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml) med BNE som kontrol. Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C.
    BEMÆRK: Der tilsættes 100 μL komplet vækstmedium til de negative kontrolgrupper og 100 μL cellesuspension (1 x 105/ml) til de positive kontrolgrupper.
  7. Mediet fjernes, og der tilsættes 90 μL komplet vækstmedium og 10 μL CCK-8-opløsning til hvert hul på pladen.
  8. Pladen inkuberes i 2 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator.
  9. Absorbansen af hvert hul måles ved 450 nm ved hjælp af en enzymmærket pladelæser.
  10. Beregn overlevelsesforholdet mellem BEAS-2B-celler som angivet i følgende ligning:
    (OD450 prøve − OD450 negativ kontrol / OD450 positiv kontrol − OD450 negativ kontrol) × 100%
  11. Del tilfældigt 6 uger gamle C57BL/6 mus i fem grupper (n = 5 i hver gruppe) og bedøm dem med 4% isofluran til induktion. Oprethold anæstesi med 2% isofluran. Brug neomycinsulfatsalve på musenes øjne for at forhindre tørhed.
  12. Brug 10 μL pipettespidser til at udføre nasal immunisering af mus med 10 μL/næsebor af I-OVA, I-OVA+BNE og IOVA NE ved 4 mg/ml i alle 3 dage. Brug BNE og PBS som eksperimentel kontrol.
    BEMÆRK: Giv termisk støtte, indtil dyret kommer sig efter anæstesi.
  13. Aflive alle musene ved en intraperitoneal injektion på 100 mg/kg 1% natriumpentobarbital på dag 4.
  14. Skær ca. 3 mm tykke prøver af næsevæv med en saks, og fjern lungevævet.
  15. Fastgør næsevævet og hele lungevævet i 4% paraformaldehyd i 24 timer. Dehydrer vævene gennem en seriel alkohol- og xylengradient og indlejres derefter i paraffin. Skær de færdige voksblokke på en paraffinskiver i en tykkelse på 4 μm.
  16. Plet sektionerne med hæmatoxylin og eosin (H&E). Derefter observeres slimhindetoksiciteten, herunder hyperæmi, ødem, neutrofil infiltration og strukturel skade i næseslimhinden og lungevævet under et mikroskop (100x og 200x)7.

4. In vitro cellulær optagelse

  1. Plade BEAS-2B-celler med en densitet på 5 x 10 5 celler/brønd i plader med 12 brønde med dæksedler i 2 ml af det komplette vækstmedium og præinkuber pladerne natten over ved 37 °C i en5 % CO2 inkubator.
  2. Der tilsættes 100 μL FITC-mærket I-OVA NE (renhed: 98,3 %, produceret af virksomheden, 4 mg/ml) eller I-OVA (4 mg/ml) til 900 μL cellesuspension og anbringes ved 37 °C i 90 minutter.
    BEMÆRK: Forbered FITC-mærket I-OVA NE som beskrevet i trin 4.1. Der tilsættes 1 ml komplet vækstmedium til kontrolgrupperne.
  3. Vask tre gange med 0,1 M PBS (1 ml/hul) i 30 minutter ved 37 °C efter behandlingen.
  4. Fastgør disse prøver med 4% paraformaldehyd i 20 minutter i mørke. Efter fiksering fjernes paraformaldehydet, og der vaskes 3 gange med 0,1 M PBS (1 ml/hul) i 30 minutter ved 37 °C.
  5. Prøverne præinkuberes med DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindol) i en slutkoncentration på 10 μg/ml i 10 minutter i mørke, og vask derefter 5 gange med 0,1 M PBS (1 ml/hul) i 30 minutter ved 37 °C efter behandlingen.
  6. Hent den cellulære optagelse af CLSM med følgende parameterindstillinger: Rammestørrelse: 512 px x 512 px, Scanningshastighed: 8; Linje trin: 1; Gennemsnit: 2.

5. In vivo-frigivelse

  1. Bedøv nøgne mus med 4% isoflurangas og hold bedøvelse ved 2% isofluran. Immuniser nøgne mus intranasalt med 10 μL PE-mærket I-OVA ved 4 mg / ml eller PE-mærket I-OVA NE ved 4 mg / ml i hvert næsebor.
  2. Ved 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h og 24 timer skal du fange alle musene under anæstesi af IVIS-systemet.
  3. Udfør en baggrundsscanning umiddelbart før intranasal administration for at give en tærskelværdi (Min = 1,06 x 106) for at justere de billeder, der er indsamlet på alle tidspunkter.
  4. Klik på Living Image-softwaren for at starte sekvensen, og klik på Initialiser for at initialisere IVIS-systemet
  5. Når den initialiseres, lyser temperaturstatuslampen i IVIS-anskaffelseskontrolpanelet rødt. Når temperaturstatuslampen skifter til grøn, kan der udføres billeddannelse.
  6. Klik på Guiden Billedbehandling , og vælg derefter Fluorescens i den dialogboks, der vises.
  7. Juster følgende parametre: Eksponeringstid: automatisk sek., Binning: 8, F/Stop: 2, Synsfelt: D.
  8. Vælg 620 nm excitationsfilter og 670 nm emissionsfilter. Klik på Hent sekvens for at hente billedet.
  9. Behandl live-billederne af alle musene og udstrålingsdataene med Living Image-softwaren.
    1. Når du har hentet billedet, skal du klikke på ROI-værktøjer i værktøjspaletten, vælge Cirkel og lave en ROI-cirkel .
    2. Klik på Mål ROI'er for at få en kvantitativ værdi for ROI-området.

6. In vivo antitumor effektivitet

  1. Opfrisk og dyrk muselymfomets E.G7-OVA-celler fra EL4 med et komplet vækstmedium efter trin 2.1.1-2.1.4.
    BEMÆRK: For at forberede E.G7-OVA-celle komplet vækstmedium blandes RPMI 1640-medium med 2 mM L-glutamin justeret til at indeholde 1,5 g / L natriumbicarbonat, 4,5 g / L glucose, 10 mM HEPES og 1,0 mM natriumpyruvat og suppleret med 0,05 mM 2-mercaptoethanol og 0,4 mg / ml G418, 90% og føtalt bovint serum, 10%.
  2. Subkultur cellerne i et forhold på 1:2, når cellerne når en densitet mellem 1 x 106 celler/ml og 1 x 107 celler/ml.
  3. Evaluer den forebyggende beskyttende virkning på mus som beskrevet i trin 6.3.1-6.3.4.
    1. Del tilfældigt 6 uger gamle C57BL/6 mus op i fem grupper (n = 8 i hver gruppe). Bedøv nøgne mus med 4% isoflurangas og oprethold anæstesi med 2% isofluran. Barber delvist ryghåret og neomycinsulfatsalven på musenes øjne for at forhindre tørhed.
    2. Intranasalt immunisere musene med 10 μL 1 mg / mL I-OVA, BNE + I-OVA eller I-OVA NE i hvert næsebor, BNE (fortyndet fire gange med PBS) eller en PBS-kontrol 3 gange med et 7-dages interval mellem hver immunisering.
    3. Pod alle musene hypodermisk i højre ryg med 5 x 105 E. G7-OVA-celler på den 7. dag efter den endelige immunisering.
    4. Ved 0, 6, 9, 12, 15 og 18 dage efter den endelige immunisering skal du overvåge tumorvolumenerne ved at måle to akser af tumoren ved hjælp af digitale kalibre og registrere musenes 30-dages (efter den endelige immunisering) overlevelse.
  4. Den terapeutiske beskyttende virkning på mus vurderes efter podning af E.G7-OVA-celler som beskrevet i trin 6.4.1-6.4.3. Med hensyn til gruppering og håndtering af mus henvises til trin 6.3.1.
    1. På dag 0 injiceres C57BL/6-musene subkutant i højre ryg med E.G7-OVA-celler (5 x 105 celler/mus).
    2. 0, 7 og 14 dage efter injektion immuniseres alle mus intranasalt immuniseret med 10 μL I-OVA, BNE + I-OVA, I-OVA NE (alle i koncentrationer på 1 mg / ml), BNE eller PBS tre gange i hvert næsebor.
    3. Ved 0, 6, 9, 12, 15 og 18 dage efter injektion skal du overvåge tumorvolumenet og registrere musenes 30-dages overlevelse.
      BEMÆRK: Hvis tumorvolumenet overstiger 3.000 mm3, skal musene aflives af humane grunde, og disse mus betragtes som døde i overlevelseskurven. Tumorvolumen beregnes ved hjælp af en modificeret ellipsoid formel som angivet i følgende ligning:
      Volumen = π/6 x L x B2
      hvor L repræsenterer tumorlængden, og W repræsenterer tumorbredden (længdeenhed: mm, volumenenhed: mm3).

7. Statistisk analyse

  1. Analyser forskellene i data mellem de forskellige grupper ved hjælp af passende statistisk software med envejs ANOVA, Tukeys flere sammenligninger eller en studerendes t-test. Brug Kaplan-Meier-metoden til at estimere overlevelsesresultaterne og sammenligne grupperne med log-rank-statistikker. Udtryk alle resultaterne som middel ± SD. Betydningen af P-værdierne P < 0, 05, P < 0, 01 og P < 0 , 001 er repræsenteret ved hjælp af henholdsvis *, ** og *** på plottene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I henhold til protokollen afsluttede vi forberedelsen og in vitro og in vivo eksperimentel evaluering af nasal tumor nanovaccine levering. TEM, AFM og DLS er effektive midler til vurdering af de grundlæggende egenskaber ved overfladezetapotentialet og nanovaccinens partikelstørrelse (figur 1). BEAS-2B epitelceller er en nyttig screeningsmodel til in vitro toksicitetstest af nasale vacciner (figur 2A). Mikrofotografierne farvet med H&E illustrerer, at I-OVA NE ikke havde nogen åbenlys slimhindetoksicitet, herunder vævsskade, blødning eller inflammatorisk celleinfiltration (figur 2B). Effektiv optagelse af antigenet af BEAS-2B-celler i næsehulen er en forudsætning for, at antigenpræsentationen kan fremkalde efterfølgende immunresponser (figur 3). IVIS-systemet hjælper med at belyse den vedvarende frigivelseseffekt af I-OVA NE in vitro og antyder, at denne nanovaccine kan forsinke hurtig frigivelse, forlænge tiden i næseområdet og forbedre optagelsen af peptider i celler (figur 4). De forebyggende beskyttelsesmodeller og de terapeutiske beskyttelsesmodeller afspejler direkte den beskyttende virkning af I-OVA NE-vaccinen og I-OVA NE-vaccinens evne til at hæmme tumorvækst og forlænge medianoverlevelsestiden hos mus (figur 5). Ovenstående eksperimentelle resultater er blevet offentliggjort af Yang et al.7.

Figure 1
Figur 1: Fysiske egenskaber og stabilitet af I-OVA NE . (A) Transmissionselektronmikrografi (TEM), skalastang = 100 nm. (B) Atomic force mikroskopi (AFM) mikrografi. X- og Y-akserne har begge en samlet længde på 450 nm. (C) Størrelse, diameter og fordeling. D) Zeta-potentiale og -fordeling af I-OVA NE-analyser udført ved hjælp af Nano ZS. (E) Partikelstørrelser, (F) polydispersitetsindekser, (G) zetapotentialer og (H) elektroforesemobilitet af I-OVA NE i mucinstabilitetsanalyser udført ved hjælp af Nano ZS. Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Yang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: In vitro- og in vivo-toksicitet af I-OVA NE. (a) Relativ levedygtighed af BEAS-2B-celler i kultur eksponeret for forskellige peptidkoncentrationer af I-OVA, BNE+I-OVA og I-OVA NE i 24 timer. BNE blev anvendt som kontrol. Dataene udtrykkes som gennemsnittet ± SD (n = 3). B) Mikroskopisk undersøgelse af patologiske sektioner af næseslimhinden og lungevævet, der er fikseret 5 timer efter belastningen. Billeder blev taget ved 100x og 200x forstørrelse. Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Yang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Cellulær optagelse af I-OVA NE. In vitro konfokal fluorescensbilleddannelse af BEAS-2B-celler behandlet i 1 time med I-OVA eller I-OVA NE. PBS blev brugt som kontrol, I-OVA blev mærket med FITC (grøn fluorescens), og kernerne blev farvet med DAPI (blå fluorescens) (skalabjælke = 50 μm). Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Yang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro-frigivelse af I-OVA NE . (A) In vivo fluorescensbilleddannelse af PE-mærket I-OVA i musens næsehule. Relativ fluorescensintensitet registreret ved 0 timer, 0,5 timer, 1,5 timer, 3 timer, 6 timer, 9 timer, 12 timer og 24 timer efter nasal administration af I-OVA eller I-OVA NE. (B) Kvantificering af fluorescensintensitet. Dataene udtrykkes som gennemsnittet ± SD (n = 5). *: P < 0,05; **: P <0,01; og ***: P < 0,001. Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Yang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: In vivo antitumoreffekt af I-OVA NE . (A) Gennemsnitlige tumorvækstkurver for de vaccinerede mus i de forebyggende beskyttelsesmodeller. (B) Procent overlevelsesrate for de vaccinerede mus i de forebyggende beskyttelsesmodeller. (C) Gennemsnitlige tumorvækstkurver for de vaccinerede mus i de terapeutiske beskyttelsesmodeller. (D) Procent overlevelsesrate for de vaccinerede mus i de terapeutiske beskyttelsesmodeller. *: P < 0,05; **: P < 0,01; og ***: P < 0,001. Denne figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Yang et al.7. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanovacciner funktionaliseret med immunocytmembraner har store fordele ved sygdomsmålrettet terapi, og bivirkningerne minimeres af egenskaber som unik tumortropisme, identifikation af specifikke mål, langvarig cirkulation, forbedrede intercellulære interaktioner og lav systemisk toksicitet. De kan også let integreres med andre behandlingsmoduler til behandling af kræft i samarbejde16,20. Ønskelige egenskaber kan opnås ved at kontrollerefysiske og kemiske egenskaber såsom måling, form og elektrisk ladning. Derfor er nanovacciner blevet vigtige i en lang række anvendelsesområder21. Disse egenskaber er vigtige afgørende faktorer med hensyn til optagelse og toksicitet, og nanovacciner kan kun gøres ugiftige ved manipulation22. Derfor er denne protokol til undersøgelse af fysisk-kemiske egenskaber, herunder form, størrelse og ladning, afgørende. TEM er et meget præcist instrument, der har været meget udbredt i det videnskabelige samfund i mange år23. Det er blevet et vigtigt redskab til at forstå egenskaberne ved nanostrukturerede materialer og manipulere deres adfærd. Derudover har atomkraftmikroskopi (AFM) vist sig som en kraftfuld teknik til nanomekanisk karakterisering af biologiske prøver24. Det kan give 3D- og nanoskalainformation i høj opløsning, samtidig med at overfladedetaljer analyseres på atomniveau. Ud over at bestemme ændringer i partikelstørrelsesfordeling kan DLS måle både størrelse og ladning for at give information om aggregeringstilstanden for nanopartikler i opløsning25.

Det er blevet rapporteret, at høje zetapotentialværdier er afgørende for kolloide suspensioners gode stabilitet26. I denne undersøgelse brugte vi disse protokoller til at vurdere de fysisk-kemiske egenskaber ved nanovacciner med TEM, AFM og DLS. Desuden indeholder overfladen af næseslimhinden en stor mængde slim, som giver smøring, fugt og en kemisk beskyttende barriere. Dette kan skyldes interaktionen mellem slim og nogle antigener eller leveringssystemer, hvilket resulterer i akkumulering og "indfangning" af antigener eller leveringssystemer og deres efterfølgende fjernelse, hvilket reducerer leveringseffektiviteten enormt7. Det er velkendt, at stabiliteten af nanovacciner er afgørende for nasal administration. Derfor brugte vi Nano ZS til at bestemme en række stabilitetsparametre, herunder partikelstørrelse, polydispersitetsindekser, zetapotentialer og elektroforesemobilitet efter behandling med 0,5% mucinprotein.

In vivo-histokompatibilitets- og in vitro-cellelevedygtighedsassays viste, at denne nye nanovaccine var utoksisk i området for de testede koncentrationer27. Humane normale bronchiale epitelceller (BEAS-2B) er standardcellelinjer, der bruges til at studere det menneskelige luftveje28. På grund af de lavere omkostninger, hurtigheden og de minimale etiske betænkeligheder er in vitro-toksicitetsvurdering en vigtig metode. I dette studie blev in vitro-cellelevedygtighedsanalysen bestemt ved et CCK8-assay. Derudover udføres in vivo toksicitetsvurdering normalt i dyremodeller såsom mus og rotter. Histopatologisk undersøgelse udføres ofte på væv udsat for nanopartikler, såsom hjerte, øje, hjerne, lever, nyre, lunge og milt29. Derfor brugte vi disse metoder til at vurdere toksiciteten af denne nye nanovaccine in vitro og in vivo.

Antigenoptagelse og -forlængelse er forudsætninger for, at antigenindsendelse kan udløse et efterfølgende immunrespons30. Det er nødvendigt at bestemme den cellulære optagelse af BEAS-2B og frigivelsesprofilerne for den nye nanovaccine in vivo og in vitro. CLSM er den mest almindelige kommercielle implementering af den relevante teknologi, som findes i langt de fleste billedbehandlingslaboratorier og har en bred vifte af anvendelser. Disse instrumenter er meget udbredte og relativt nemme at bruge; De er dog normalt ikke optimale til kvantitativ dataindsamling.

I vores protokol blev cellulær optagelse detekteret af CLSM på grund af den klare opløsning, optiske sektionskapacitet og alsidighed med 3D-billeddannelse31. Desuden blev IVIS anvendt til at opnå in vivo-frigivelsesprofilerne for det nye nanomateriale, fordi det kan tilvejebringe et billeddannelseskammer med udvendigt lys, der er udelukket til kvantitativ bioluminescens- og fluorescensbilleddannelse in vivo og in vitro. Derfor brugte vi i denne protokol disse metoder til at bestemme de cellulære optagelses- og frigivelsesprofiler for nye nanovacciner in vivo og in vitro.

Det er også vigtigt at vurdere tumoreffektiviteten af den nye nanovaccine. I vores undersøgelse blev E.G7 tumorbærende model brugt til at bestemme vaccinens terapeutiske og beskyttende virkninger. EL4-celler stammer fra T-lymfocytterne hos C57BL/6-mus med malignitet af høj kvalitet. E.G7-celler stammer fra EL4-lymfomceller transfekteret ved elektroporation32. I vores undersøgelse inducerede denne nanovaccine beskyttende immunitet hos E.G7-OVA tumorbærende mus. Sammenfattende er det nødvendigt at etablere en række protokoller til undersøgelse af de fysisk-kemiske egenskaber, stabilitet, toksicitet, frigivelsesprofiler, cellulær optagelse og antitumorvirkninger af nanovacciner in vitro og in vivo. Disse protokoller vil give nyttige resultater for den nye nasale nanovaccine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have syntes at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af nr. 31670938, 32070924, 32000651 af National Natural Science Foundation Program of China, nr. 2014jcyjA0107 og nr. 2019jcyjA-msxmx0159 fra Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, nr. 2020XBK24 og nr. 2020XBK26 fra Army Medical University Special projekter og nr. 202090031021 og nr. 202090031035 af National Innovation and Entrepreneurship Program for universitetsstuderende.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA  Bio-Rad 6.0
CCK-8 kits Dojindo, Japan CK04
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D9542
fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Life Technology, USA) SH30088.03
FITC-labeled I-OVA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
HF 90/240 Incubator Heal Force, Switzerland NA
HPLC  Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd. E2695
Inverted Microscope Nikon,Japan DSZ5000X
IPC-208 Chong Qing University, China NA
IVIS system  Caliper Life Science Limited Company NA
JEM-1230 TEM JEOL Limited Company of Japan 1230 TEM
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK NA
MPLA  Invivogen
Lit. Co.		 tlrl-mpla
Neomycin Sulfate Ointment Shanghai CP General Pharmaceutical Co. , Ltd. H31022262
OVA257–264 Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
RPMI 1640 medium Hyclone (Life Technology, USA) SH30809.01
Synthetic peptide (I-OVA) conjugation of IKVAV-PA Shanghai Botai
Biotechnology Co., Ltd.		 NA
Zeiss LSM800 laser scanning confocal fluorescence microscope Zeiss, Germany Zeiss LSM800

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Mohammed, I., et al. The efficacy and effectiveness of the COVID-19 vaccines in reducing infection, severity, hospitalization, and mortality: A systematic review. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 18 (1), 2027160 (2022).
  3. Tsung, K., Norton, J. A. In situ vaccine, immunological memory and cancer cure. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (1), 117-119 (2016).
  4. Abd-Aziz, N., Poh, C. L., Ding, X. Development of peptide-based vaccines for cancer. Journal of Oncology. 2022, 9749363 (2022).
  5. Mochizuki, S., et al. Immunization with antigenic peptides complexed with beta-glucan induces potent cytotoxic T-lymphocyte activity in combination with CpG-ODNs. Journal of Controlled Release. 220, 495-502 (2015).
  6. Kalita, P., Tripathi, T. Methodological advances in the design of peptide-based vaccines. Drug Discovery Today. 27 (5), 1367-1380 (2022).
  7. Yang, Y., et al. A novel self-assembled epitope peptide nanoemulsion vaccine targeting nasal mucosal epithelial cell for reinvigorating CD8(+) T cell immune activity and inhibiting tumor progression. International Journal of Biological Macromolecules. 183, 1891-1902 (2021).
  8. Ren, Y., et al. OVA-specific CD8+ T cells do not express granzyme B during anterior chamber associated immune deviation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 244 (10), 1315-1321 (2006).
  9. Suzuki, K., et al. Preparation of hyaluronic acid-coated polymeric micelles for nasal vaccine delivery. Biomaterials Science. 10 (8), 1920-1928 (2022).
  10. Georas, S. N., Rezaee, F. Epithelial barrier function: at the front line of asthma immunology and allergic airway inflammation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 509-520 (2014).
  11. Lam, J. Y., et al. A nasal omicron vaccine booster elicits potent neutralizing antibody response against emerging SARS-CoV-2 variants. Emerging Microbes & Infections. 11 (1), 964-967 (2022).
  12. Chai, Y., et al. Improved functional recovery of rat transected spinal cord by peptide-grafted PNIPAM based hydrogel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 210, 112220 (2022).
  13. Paiva Dos Santos, B., et al. Production, purification and characterization of an elastin-like polypeptide containing the Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) peptide for tissue engineering applications. Journal of Biotechnology. 298, 35-44 (2019).
  14. Okur, A. C., Erkoc, P., Kizilel, S. Targeting cancer cells via tumor-homing peptide CREKA functional PEG nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 147, 191-200 (2016).
  15. Makidon, P. E., et al. Pre-clinical evaluation of a novel nanoemulsion-based hepatitis B mucosal vaccine. PLoS One. 3 (8), 2954 (2008).
  16. Lin, X., et al. Oil-in-ionic liquid nanoemulsion-based intranasal delivery system for influenza split-virus vaccine. Journal of Controlled Release. 346, 380-391 (2022).
  17. O'Konek, J. J., et al. Intranasal nanoemulsion vaccine confers long-lasting immunomodulation and sustained unresponsiveness in a murine model of milk allergy. Allergy. 75 (4), 872-881 (2020).
  18. Ahmed, M., et al. A novel nanoemulsion vaccine induces mucosal Interleukin-17 responses and confers protection upon Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. Vaccine. 35 (37), 4983-4989 (2017).
  19. Sun, H., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
  20. Chen, C., et al. Tumor-associated-macrophage-membrane-coated nanoparticles for improved photodynamic immunotherapy. Nano Letters. 21 (13), 5522-5531 (2021).
  21. Prasanna, P., et al. Current status of nanoscale drug delivery and the future of nano-vaccine development for leishmaniasis - A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 141, 111920 (2021).
  22. George, S., et al. Surface defects on plate-shaped silver nanoparticles contribute to its hazard potential in a fish gill cell line and zebrafish embryos. ACS Nano. 6 (5), 3745-3759 (2012).
  23. Jafari Eskandari, M., Gostariani, R., Asadi Asadabad, M. Transmission Electron Microscopy of Nanomaterials. Electron Crystallography. Singh, D., Condurache-Bota, S. , IntechOpen. London, UK. (2020).
  24. Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
  25. Zielinska, A., et al. Polymeric nanoparticles: Production, characterization, toxicology and ecotoxicology. Molecules. 25 (16), 3731 (2020).
  26. Doncom, K. E. B., Blackman, L. D., Wright, D. B., Gibson, M. I., O'Reilly, R. K. Dispersity effects in polymer self-assemblies: A matter of hierarchical control. Chemical Society Reviews. 46 (14), 4119-4134 (2017).
  27. Pei, M., Li, H., Zhu, Y., Lu, J., Zhang, C. In vitro evidence of oncofetal antigen and TLR-9 agonist co-delivery by alginate nanovaccines for liver cancer immunotherapy. Biomaterials Science. 10 (11), 2865-2876 (2022).
  28. Zhang, J., et al. Titanium dioxide nanoparticles induced reactive oxygen species (ROS) related changes of metabolomics signatures in human normal bronchial epithelial (BEAS-2B) cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 444, 116020 (2022).
  29. Kumar, V., Sharma, N., Maitra, S. S. In vitro and in vivo toxicity assessment of nanoparticles. International Nano Letters. 7 (4), 243-256 (2017).
  30. Tong, Y. N., et al. An immunopotentiator, ophiopogonin D, encapsulated in a nanoemulsion as a robust adjuvant to improve vaccine efficacy. Acta Biomaterialia. 77, 255-267 (2018).
  31. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  32. Huang, Y., Zou, Y., Lin, L., Zheng, R. Ginsenoside Rg1 activates dendritic cells and acts as a vaccine adjuvant inducing protective cellular responses against lymphomas. DNA and Cell Biology. 36 (12), 1168-1177 (2017).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 187
Forberedelse, egenskaber, toksicitet og effektivitetsevaluering af den nasale selvmonterede nanoemulsionstumorvaccine <em>in vitro</em> og <em>in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., … More

Zhang, Z., Cai, D., Ge, S., Luo, X., Zeng, X., Ye, Y., Song, Z., Peng, L., Li, H., Zou, Q., Zeng, H., Sun, H., Yang, Y. Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (187), e64299, doi:10.3791/64299 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter