Summary
Le présent protocole décrit une procédure de radiologie interventionnelle établie pour l’injection intrathymique chez la souris afin d’éviter le risque de chirurgie ouverte et d’améliorer la précision des injections percutanées à l’aveugle.
Abstract
L’injection intrathymique dans des modèles murins est une technique importante pour étudier la fonction thymique et immunitaire, y compris les troubles génétiques et les troubles des lymphocytes T acquis. Cela nécessite des méthodes pour le dépôt direct de réactifs et / ou de cellules dans le thymus de souris vivantes. Les méthodes traditionnelles d’injection intrathymique comprennent la chirurgie thoracique ou les injections percutanées à l’aveugle mini-invasives, qui ont toutes deux des limites importantes. Les appareils d’imagerie par ultrasons à ultra-haute fréquence ont rendu possibles les injections percutanées guidées par l’image chez la souris, améliorant considérablement la précision d’injection de l’approche d’injection percutanée et permettant l’injection de cibles plus petites. Cependant, les injections guidées par l’image reposent sur l’utilisation d’un système ferroviaire intégré, ce qui en fait une procédure rigide et longue. Une méthode unique, sûre et efficace pour les injections intrathymiques percutanées chez la souris est présentée ici, éliminant ainsi la dépendance au système de rail pour les injections. La technique repose sur l’utilisation d’une unité de micro-échographie à haute résolution pour imager le thymus de la souris de manière non invasive. En utilisant une technique à main levée, un radiologue peut placer une pointe d’aiguille directement dans le thymus de la souris sous guidage échographique. Les souris sont nettoyées et anesthésiées avant l’imagerie. Pour un radiologue expérimenté adepte des procédures guidées par ultrasons, la période d’apprentissage de la technique énoncée est assez courte, généralement en une séance. La méthode a un faible taux de morbidité et de mortalité pour les souris et est beaucoup plus rapide que les techniques assistées mécaniques actuelles pour l’injection percutanée. Il permet à l’investigateur d’effectuer efficacement des injections percutanées précises et fiables de thymus de toute taille (y compris de très petits organes tels que le thymus de souris âgées ou immunodéficientes) avec un stress minimal sur l’animal. Cette méthode permet l’injection de lobes individuels si désiré et facilite les expériences à grande échelle en raison de la nature rapide de la procédure.
Introduction
Le thymus joue un rôle essentiel dans le développement et l’immunité des lymphocytes T. La carence en lymphocytes T, qui peut être causée par l’involution thymique, les troubles génétiques, les infections et les traitements contre le cancer, entre autres facteurs, entraîne une mortalité et une morbidité élevées 1,2. Les modèles murins sont indispensables dans la recherche en immunologie fondamentale et translationnelle et sont utilisés depuis des décennies pour étudier la biologie thymique et le développement des lymphocytes T, ainsi que pour développer des traitements pour les personnes souffrant de dysfonction thymique et de déficit en lymphocytes T 3,4,5.
Une partie centrale des recherches thymiques a été l’injection intrathymique de matériel biologique tel que des cellules, des gènes ou des protéines dans les modèles murins 6,7,8,9,10,11,12. Les méthodes conventionnelles d’injection intrathymique utilisent la thoracotomie suivie d’une injection intrathymique sous visualisation directe ou d’une injection percutanée « aveugle » dans le médiastin. L’approche chirurgicale augmente considérablement le risque de pneumothorax, entre autres. De plus, le stress élevé pendant cette chirurgie entraîne une immunosuppression, compromettant ainsi potentiellement les données immunologiques13. Des chercheurs expérimentés, après un peu de pratique, peuvent effectuer la technique d’injection à l’aveugle, mais cette approche est moins précise et limite donc les sujets expérimentaux aux jeunes souris avec un gros thymus.
L’utilisation du guidage échographique a été introduite comme une alternative précise et peu invasive aux approches traditionnelles d’injection intrathymique14. Cependant, cette procédure prend beaucoup de temps lors de l’utilisation du système ferroviaire intégré au lieu de la technique à main levée. L’exécution d’injections avec le support d’injection nécessite une optimisation minutieuse de l’imagerie et le positionnement du transducteur à l’aide des différents accessoires tels que le support et le support du transducteur, le système de positionnement X, Y et Z, ainsi qu’un fonctionnement efficace des commandes de micro-manipulation et des extensions du système de rail. Une technique alternative simple, l’injection thymique guidée par ultrasons, est présentée ici par un radiologue utilisant une approche à main levée15, qui est à la fois une alternative mini-invasive rapide et précise aux méthodes décrites ci-dessus. Il est important de noter que l’approche actuelle peut être réalisée avec n’importe quel système d’imagerie par ultrasons haute résolution sans avoir besoin d’un support d’injection et d’un système de rail intégré. Il est particulièrement utile pour les études nécessitant l’injection d’un grand nombre de souris11, pour les expériences impliquant l’injection des deux lobes thymiques ou pour l’injection précise de petits thymus chez des souris âgées, irradiées ou immunodéprimées12.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives de soins aux animaux du Center for Discovery and Innovation (protocole IACUC 290). Pour la présente étude, souris C57BL/6 (femelles, 4-6 semaines), souris C57BL/6 (femelles, 6 mois), souris femelles J:NU, souris femelles NOD scid gamma (NSG) et B6; Les souris CAG-luc, -GFP ont été utilisées comme modèle de jeune souris, modèle de souris âgée, modèle nu athymique, modèle immunodéficient et source cellulaire de bioluminescence, respectivement. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Cette procédure nécessitera généralement deux personnes (une pour rester stérile pendant les injections et une autre pour manipuler les souris).
1. Préparation des animaux
- Induire l’anesthésie chez les souris en utilisant 3% -4% de gaz isoflurane et maintenir l’anesthésie en utilisant 1% -3% de gaz isoflurane administré via un cône nasal et un vaporisateur étalonné avec précision (voir le tableau des matériaux).
- Confirmer la profondeur anesthésique appropriée / l’inconscience en ne répondant pas au pincement de la patte postérieure.
- Retirez la fourrure de la poitrine antérieure des souris en appliquant une fine couche de crème dépilatoire pendant moins de 1 min. Utilisez une serviette en papier humide pour enlever complètement la crème avec la fourrure lâche.
REMARQUE: L’application d’une trop grande quantité de crème entraînera une inflammation de la peau de la poitrine. - Placer une souris à la fois, couchée sur le dos, sur la plate-forme chauffée de la station d’imagerie par ultrasons pour petits animaux (voir le tableau des matériaux) avec le cône nasal en place (figure 1).
- Fixez la souris à la scène à l’aide d’un ruban adhésif médical au niveau de l’arrière et des membres antérieurs (Figure 1).
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.
- Désinfecter la peau supérieure du thorax sans fourrure à l’aide d’un applicateur de gluconate de chlorhexidine (voir le tableau des matières).
2. Préparation de l’appareil à ultrasons et du champ stérile
- Activez la sonde linéaire la plus haute fréquence disponible, généralement la sonde avec la résolution spatiale la plus élevée pour la taille de l’animal photographié. Activez la sonde en appuyant sur le bouton correspondant après l’écran de démarrage.
REMARQUE: Pour cette application avec des souris, la sonde utilisée est conçue spécifiquement pour être utilisée avec des souris et de petits rats (voir le tableau des matériaux). - Optimisez les paramètres d’échographie pour l’imagerie et l’injection en suivant les étapes ci-dessous.
- Ajustez la profondeur du champ de vision à une taille appropriée pour l’animal cible en ajustant les curseurs orientés verticalement sur le côté droit de l’écran (Figure 2). La profondeur maximale sera généralement d’environ 6 à 8 mm pour les jeunes souris.
- Réglez le gain en niveaux de gris en faisant glisser le bouton le long de la barre horizontale en bas de l’écran (Figure 2). L’objectif est de commencer avec une image légèrement plus sombre qu’une apparence « grise » typique.
- Ajustez la zone focale (flèche bleue à droite de l’écran, Figure 2) au niveau prévu du thymus. Pour les jeunes souris, ce sera autour d’une profondeur de 4 mm.
- Si vous souhaitez capturer une image, testez la fonctionnalité de l’image de magasin et des boutons de clip de stockage pour vous assurer que les images peuvent être enregistrées de manière appropriée tout au long de la procédure. Pour ce faire, appuyez sur le bouton Enregistrer le clip en bas à droite de l’écran ou sur le bouton Figer , puis sur Enregistrer l’image (Figure 2).
- Appliquez une petite quantité (~ 1 mL) de gel à ultrasons sur la surface du transducteur (voir le tableau des matériaux) pendant qu’il est debout, soit dans le support de l’appareil à ultrasons, soit dans les mains d’un assistant.
- Préparez un petit champ stérile à côté de la plate-forme chauffée. Le positionnement optimal pour cela est généralement entre la plate-forme et l’appareil à ultrasons.
- Videz ces articles sur le champ stérile : un couvercle de sonde stérile, un élastique, des gants stériles et un gel à ultrasons stérile (voir le tableau des matériaux).
- Une fois le champ stérile installé et les articles en place, mettez les gants stériles.
- Placez soigneusement le couvercle de la sonde stérile sur le transducteur à ultrasons (ainsi que sur le gel initialement placé sur la sonde). Maintenez la stérilité et ne touchez que la couverture stérile, rien d’autre. Faites glisser l’élastique stérile sur le couvercle de la sonde stérile pour le maintenir en place.
REMARQUE: Les foyers d’air, quelle que soit leur taille, peuvent interférer avec l’imagerie par ultrasons. Par conséquent, il est essentiel d’appliquer le gel à ultrasons entre le transducteur et le couvercle de la sonde stérile, et sur le dessus du couvercle de la sonde pour assurer une interface sans air entre la sonde à ultrasons et l’animal. - Placer une quantité modérée (2-3 mL) de gel à ultrasons stérile sur le transducteur.
REMARQUE: L’utilisateur est maintenant prêt à imager une souris anesthésiée.
3. Imagerie et localisation du thymus
- Tout en maintenant la stérilité, placez la sonde à ultrasons surmontée d’un gel verticalement sur la partie désinfectée de la paroi thoracique antérieure de la souris pour l’imagerie initiale.
- Prenez un moment pour regarder l’image échographique et optimisez-la davantage. Revenez à l’étape 2.2 et ajustez pour obtenir une apparence similaire à celle de la figure 3.
- Scannez la poitrine antérieure de la souris dans un plan transversal. Pour ce faire, tenez le transducteur verticalement et déplacez-le de haut en bas du cou vers l’abdomen dans un mouvement semblable à un pinceau ou « balayage ».
REMARQUE: Le cœur sera la structure la plus reconnaissable dans la poitrine en raison de son mouvement rapide et de son apparence « chambrée ». Une fois le cœur localisé, il peut être utilisé comme point de référence pour acquérir une image du thymus. - Avec le cœur centré dans le champ de vision, balayez légèrement le transducteur vers le cou. Juste supérieur au cœur, le thymus est généralement rencontré.
- Visualisez le thymus comme une structure bilobée, pyramidale, hypoéchogène (« sombre » ou « noire » apparaissant à l’écran) centrée dans la ligne médiane, antérieure à l’aorte et postérieure au sternum (figure 3A).
- Notez les deux structures noires rondes appariées (c.-à-d. « hypoéchoïques ») de chaque côté du haut de la poitrine.
NOTE: Ce sont les veines caves bilatérales. L’aorte est une structure hypoéchogène curviligne similaire dans la ligne médiane entre les deux veines caves. Ceux-ci sont facilement reconnaissables par leur mouvement pulsatile.
4. Injection du thymus
- Si nécessaire, appliquez plus (2-3 ml) de gel à ultrasons stérile sur le transducteur.
REMARQUE: Une quantité relativement importante de gel stérile sur le transducteur (par rapport à la taille du thorax de la souris) agira comme un « tampon de gel » autour de la paroi thoracique de la souris. Cela réduira le nombre d’artefacts échographiques fabriqués par l’air dans le champ de vision. - À l’aide de la sonde à ultrasons, localisez la partie la plus large du thymus, qui est généralement le site cible idéal pour l’injection. Anticipez une trajectoire horizontale de l’aiguille à l’endroit choisi.
- Notez où se trouvent les principaux vaisseaux sanguins (SVC et aorte) sur ce site. Évitez-les pendant l’injection.
- Les vaisseaux sanguins seront des structures hypoéchogènes et pulsatiles, comme décrit à l’étape 3.7. En cas de doute, utilisez le mode Doppler couleur pour vérifier l’écoulement dans les vaisseaux (Figure 4A). Activez le mode Doppler couleur en appuyant sur le bouton Couleur à l’écran.
- Si l’on prévoit que l’un des principaux vaisseaux sanguins (ou le cœur) se trouve le long de la trajectoire prévue de l’aiguille, choisissez une nouvelle zone cible ou trouvez une approche ou une trajectoire différente.
- Tenez le transducteur dans une main et une aiguille à insuline de 30 G (voir le tableau des matériaux) avec 10 μL d’injecter dans l’autre.
REMARQUE : L’injection varie en fonction de la conception expérimentale. La présente étude a utilisé une solution saline tamponnée au phosphate, du bleu de trypan ou de la D-luciférine (0,1 μg/10 μL). - Pour commencer le processus d’injection, déplacez le transducteur latéralement de sorte que le thymus soit décentré dans le champ de vision de l’échographie. Assurez-vous que l’autre côté du champ de vision se compose principalement de gel à ultrasons et de rien d’autre.
- Placez l’extrémité de l’aiguille dans le gel sous le transducteur et déplacez lentement l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit visualisée à côté de la surface de la peau (Figure 4B).
- Tout en visualisant continuellement l’aiguille sous échographie, insérez l’aiguille dans le thymus avec une trajectoire percutanée, loin des vaisseaux sanguins.
- Utilisez une trajectoire horizontale « thymus croisé » pour placer l’extrémité de l’aiguille dans le lobe thymique controlatéral au site d’entrée. Cela explique les fuites potentielles le long du tractus de l’aiguille (figure 5A).
- Une fois que l’extrémité de l’aiguille est à l’intérieur de la partie souhaitée du thymus, injectez rapidement le contenu (comme 10 μL de bleu de trypan ou de D-luciférine, 0,1 μg/10 μL) de la seringue de 30 G tout en utilisant la visualisation échographique.
- Pour stabiliser la seringue pendant l’insertion et l’injection de l’aiguille, tenez la seringue entre le pouce et le troisième doigt et contrôlez le piston de la seringue avec l’index.
- Retirez l’aiguille une fois que tout le contenu a été déposé.
5. Surveillance post-injection des animaux
- Transférez l’animal dans une cage vide et observez-le jusqu’à ce qu’il retrouve suffisamment de conscience pour maintenir une position couchée sternale.
REMARQUE: Le rétablissement complet de l’anesthésie devrait se produire dans les 2 minutes. - Surveillez l’animal pendant 10 minutes supplémentaires pour détecter tout signe de détresse, de respiration laborieuse ou de saignement.
REMARQUE: La douleur post-injection n’est pas attendue et il n’est généralement pas nécessaire d’analgésie post-injection. - Une fois complètement rétabli et après une période d’observation post-injection sans incident, remettre l’animal injecté en compagnie d’autres animaux.
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Representative Results
La mise en œuvre réussie de cette technique repose sur quelques étapes clés à suivre. Tout d’abord, une identification fiable du thymus lui-même doit être assurée. Chez les jeunes souris, cela est simple en raison de la grande taille de la glande (Figure 3A). Chez les souris plus âgées ou immunodéficientes, cela peut être plus difficile; cependant, il est encore très faisable avec un équipement à ultrasons moderne (figure 3B, C). Deuxièmement, il est extrêmement important de définir la trajectoire de l’aiguille de manière à ce qu’elle soit visualisée en continu pendant l’avancement de la pointe de l’aiguille à travers les couches de la paroi thoracique et dans le thymus. Une injection réussie aura l’aiguille entièrement visualisée pendant qu’elle est avancée. Cela garantit à l’opérateur que l’aiguille n’a pas traversé une structure critique, telle que le cœur, l’aorte ou l’une des veines inférieures (Figure 4). Cela s’applique également à l’injection elle-même. La pointe de l’aiguille doit toujours être visualisée à son emplacement cible pendant l’injection afin que le dépôt intrathymique soit confirmé (Figure 5).
Il existe certains pièges mineurs qui, s’ils sont reconnus, peuvent être atténués relativement facilement. Lors de la fixation de la souris à la scène et au cône nasal, le thorax de la souris doit être rendu aussi neutre que possible (c’est-à-dire sans rotation significative vers la gauche ou la droite). S’il y a trop de rotation du thorax, l’angle d’approche correct de l’aiguille peut ne pas être facilement réalisable. De plus, si la souris n’est pas suffisamment bien fixée, elle peut bouger ou glisser en essayant d’avancer l’aiguille, déformant l’anatomie et rendant la visualisation difficile. Cependant, avec une technique et une préparation appropriées, une injection intrathymique réussie peut être obtenue avec cohérence, fiabilité et reproductibilité.
Une fois l’injection terminée, il existe plusieurs façons de confirmer l’emplacement intrathymique de l’injection. La présente étude a utilisé la luciférine comme injecter à des souris transgéniques luciférase. Ceux-ci peuvent ensuite être évalués immédiatement après l’injection avec l’imagerie par bioluminescence, confirmant l’emplacement correct de l’injection sans sacrifier l’animal (Figure 6A). Cette technique présente l’avantage supplémentaire que les cellules marquées à la luciférine injectées peuvent être imagées à plusieurs moments, assurant ainsi la persistance de l’activité dans le thymus. Alternativement, le bleu de trypan peut être injecté comme marqueur visuel du site d’injection, et la précision de l’injection peut ensuite être confirmée ex vivo avec la nécropsie16 (Figure 6B).
Figure 1 : Souris anesthésiée positionnée sur la scène d’imagerie pour l’échographie du thymus. Une souris C57BL/6 femelle de 6 semaines avec une poitrine épilée a été anesthésiée et transférée à la station d’imagerie. La souris est en décubitus dorsal, les pattes tendues étant fixées par du ruban adhésif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Paramètres de l’appareil à ultrasons. Image du panneau de commande de l’appareil à ultrasons (écran tactile). Les principaux réglages pour optimiser l’imagerie seront l’ajustement de la profondeur (flèche rouge), de la zone focale (entourée en jaune) et des gains (astérisque rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Imagerie échographique du thymus chez des souris jeunes et âgées immunocompétentes et immunodéficientes. (A) Jeune souris immunocompétente (C57BL/6, femelle, 4 semaines, n = 5). La vue échographique transversale montre les lobes droit et gauche du thymus (astérisques). (B) Souris âgée immunocompétente (C57BL/6, femelle, 6 mois, n = 5). Le thymus (astérisque) est plus petit mais conserve son emplacement typique et sa forme pyramidale. (C) Jeune souris immunodéficiente (NOD scid gamma, femelle, 4 semaines, n = 5). Notez la taille beaucoup plus petite du thymus (astérisque) par rapport à la jeune souris normale. (D) Souris nue athymique (femelle, 8 semaines, n = 1). Il y a une absence totale de tissu thymique. Il est à noter que la ligne verticale sombre (hypoéchoïque) au milieu de l’image (astérisque) est un artefact d’ombrage du sternum, sans véritable tissu thymique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Préparation à l’injection. (A) L’image Doppler couleur du thorax antérieur montre la relation du thymus avec les vaisseaux médiastinaux. Le centre inférieur est l’arc aortique (flèche rouge), et les vaisseaux arrondis de chaque côté sont les veines supérieures droite et gauche cavae (pointes de flèches jaunes). Le sang circulant vers la sonde d’imagerie est codé en rouge, et le sang qui s’éloigne du transducteur est codé en bleu. (B) Mise en place de l’aiguille avant l’avancement dans la poitrine à partir d’une approche du côté gauche. L’extrémité de l’aiguille (flèche jaune) doit être alignée avec le transducteur à ultrasons et la pointe avec la partie médiane du thymus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Technique d’injection. (A) Mise en place de l’aiguille pour injection du lobe thymique droit d’une jeune souris immunocompétente. L’extrémité de l’aiguille (flèche jaune) se trouve dans la partie centrale du lobe droit. (B) Image post-injection du lobe droit montrant une collection de liquide sombre (hypoéchogénique) et de petites bulles d’air brillantes (échogènes) au site d’injection (ligne rouge pointillée). La flèche jaune indique la pointe de l’aiguille. (C) Mise en place de l’aiguille (flèche jaune à l’extrémité de l’aiguille) pour injection du lobe thymique gauche d’une jeune souris immunocompétente. (D) Mise en place de l’aiguille (flèche jaune) pour injection du lobe droit d’une jeune souris immunocompétente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Vérification in vivo et ex vivo de l’exactitude. (A) Injection de D-luciférine (0,1 μg/10 μL) dans le thymus d’une souris transgénique luciférase âgée de 8 semaines, suivie de 1 s d’imagerie par bioluminescence in vivo à l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence in vivo (n = 3). Le code couleur montre l’éclat total de la bioluminescence (photons·s−1·cm−2·stéradian−1) comme indiqué par la barre de couleur à droite. (B) Le thymus de deux souris C57BL/6 âgées de 5 semaines a été injecté avec du bleu de trypan, et la précision de l’injection a été démontrée par nécropsie (n = 3). Panneau supérieur : Surface dorsale d’un thymus injecté coloré en bleu trypan in situ. Panneau inférieur: surface ventrale d’un thymus coloré en bleu de trypan ex situ après injection du lobe gauche. Reproduit avec la permission de Tuckett et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Une injection à main levée guidée par ultrasons est une technique très précise pour administrer du matériel d’étude au thymus de manière efficace et aseptique. Après la stérilisation initiale de la peau au site d’injection, la stérilité est maintenue pendant la procédure grâce à l’utilisation de gants stériles, de couvercles de sonde à ultrasons stériles et de gel à ultrasons stérile. Contrairement à l’approche percutanée aveugle 10,17 ou au recours à des incisions chirurgicales pour la visualisation directe du thymus18,19, qui sont les méthodes couramment utilisées pour les injections intrathymiques chez la souris, l’utilisation du guidage échographique à main levée combine un haut degré de sécurité et de rapidité avec une précision considérable de la procédure. La réalisation d’injections guidées par ultrasons à l’aide de la plate-forme ferroviaire14 offre un niveau de sécurité et de précision similaire, mais cette approche lourde prend généralement au moins 5 minutes par injection à partir du moment où la souris a été anesthésiée et positionnée sur la plate-forme d’imagerie, par rapport à la technique à main levée qui permet à un expert de compléter les injections en environ 20-30 s par souris15.
Une expérience et une formation significatives sont des conditions préalables pour atteindre un niveau de compétence élevé dans toutes les différentes méthodes d’injection intrathymique, y compris la technique d’injection à main levée guidée par ultrasons. Cependant, un radiologue ayant une expérience clinique dans les procédures guidées par ultrasons peut devenir compétent dans l’injection intrathymique de souris dans une séance de pratique de 1 heure.
La flexibilité de la méthode d’injection à main levée permet à l’investigateur d’injecter soit un lobe thymique, les deux lobes thymiques en une seule passe d’injection, soit les deux lobes thymiques en deux injections distinctes, selon les besoins expérimentaux spécifiques de l’étude. Il convient de noter que l’injection de lobes thymiques individuels avec un placebo par rapport au matériel d’étude peut être utilisée comme stratégie pour réduire le nombre de sujets de l’étude nécessaires en utilisant le lobe injecté par placebo comme contrôle interne. En revanche, la configuration rigide du système de rail intégré permet l’injection dans un lobe thymique par période d’injection. L’injection d’un deuxième lobe nécessiterait de démonter la fixation du porte-seringue, de l’installer au verso de la souris et d’ajuster soigneusement les commandes de micromanipulation jusqu’à ce que la trajectoire de l’aiguille soit correcte avant que la prochaine injection puisse avoir lieu. Ces problèmes augmentent considérablement l’exposition à l’anesthésie et le temps nécessaire pour terminer l’expérience.
Un avantage unique de la méthode intrathymique par ultrasons à main levée par rapport à la procédure d’injection intrathymique aveugle est la facilité relative d’injection précise de petits thymus tels que les thymus de souris plus âgées (6 mois ou plus), qui sont beaucoup plus petits que ceux des souris plus jeunes (4-10 semaines). Cet avantage, combiné à la facilité de mise à l’échelle, permet aux immunologistes de mener des études basées sur l’injection intrathymique dans un large éventail de modèles murins précliniques.
En conclusion, les observations fournissent de nombreuses preuves à l’appui de la technique à main levée pour des injections sûres, rapides et précises ciblant des lobes thymiques individuels. Cette méthode mini-invasive représente donc une option très efficace et précise pour la recherche sur le thymus, facilitant les investigations précliniques à grande échelle chez les souris présentant des thymus allant de gros à extrêmement petits.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Raymond H. Thornton pour ses premiers travaux perspicaces et complets sur cette technique. Cette étude a été financée par des subventions du National Cancer Institute (NCI 1R37CA250661-01A1), de la Children’s Leukemia Research Association, de la Hackensack Meridian School of Medicine et de la HUMC Foundation / Tackle Kids Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
References
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