Summary
Цель здесь состоит в том, чтобы наметить протокол для исследования механизмов дисбактериоза при сердечно-сосудистых заболеваниях. В этой статье обсуждается, как асептически собирать и пересаживать образцы фекалий мышей, изолировать кишечник и использовать метод «швейцарского рулета» с последующим иммуноокрашиванием для опроса изменений в желудочно-кишечном тракте.
Abstract
Дисбиоз кишечной микробиоты играет роль в патофизиологии сердечно-сосудистых и метаболических нарушений, но механизмы недостаточно изучены. Трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) является ценным подходом к определению прямой роли всей микробиоты или изолированных видов в патофизиологии заболевания. Это безопасный вариант лечения для пациентов с рецидивирующей инфекцией Clostridium difficile . Доклинические исследования показывают, что манипулирование микробиотой кишечника является полезным инструментом для изучения механистической связи между дисбактериозом и заболеванием. Трансплантация фекальной микробиоты может помочь в разработке новых терапевтических средств, нацеленных на микробиоту кишечника, для ведения и лечения кардиометаболических заболеваний. Несмотря на высокий уровень успеха у грызунов, остаются трансляционные изменения, связанные с трансплантацией. Цель здесь состоит в том, чтобы дать рекомендации по изучению влияния микробиома кишечника на экспериментальные сердечно-сосудистые заболевания. В этом исследовании описан подробный протокол сбора, обработки, обработки и трансплантации фекальной микробиоты в исследованиях на мышах. Этапы сбора и обработки описаны как для доноров, так и для доноров грызунов. Наконец, мы описываем использование комбинации методов швейцарского прокатки и иммуноокрашивания для оценки специфических для кишечника изменений морфологии и целостности сердечно-сосудистых заболеваний и связанных с ними механизмов микробиоты кишечника.
Introduction
Кардиометаболические нарушения, включая болезни сердца и инсульт, являются основными глобальными причинами смерти1. Отсутствие физической активности, плохое питание, преклонный возраст и генетика модулируют патофизиологию этих расстройств. Накопленные данные подтверждают концепцию, согласно которой микробиота кишечника влияет на сердечно-сосудистые и метаболические нарушения, включая диабет2 типа, ожирение3 игипертонию 4, что может стать ключом к разработке новых терапевтических подходов к этим заболеваниям.
Точные механизмы, с помощью которых микробиота вызывает заболевания, до сих пор неизвестны, и текущие исследования сильно варьируются, отчасти из-за методологических различий. Трансплантация фекальной микробиоты (ТФМ) является ценным подходом к определению прямой роли всей микробиоты или изолированных видов в патофизиологии заболевания. ТФМ широко используется в исследованиях на животных для индуцирования или подавления фенотипа. Например, потребление калорий и метаболизм глюкозы могут быть модулированы путем переноса фекалий от больного донора к здоровому реципиенту 5,6. Было показано, что у людей ТФМ является безопасным вариантом лечения пациентов с рецидивирующей инфекцией Clostridium difficile 7. Появляются доказательства, подтверждающие его использование в лечении сердечно-сосудистых заболеваний; например, ТФМ у пациентов с постным и метаболическим синдромом улучшает чувствительность к инсулину8. Дисбактериоз кишечника также связан с высоким кровяным давлением как в исследованиях на людях, так и на грызунах 9,10,11. ТФМ от мышей, получавших диету с высоким содержанием соли, у безмикробных мышей предрасполагает реципиентов к воспалению и гипертонии12.
Несмотря на высокий уровень успешности ТФМ у грызунов, проблемы с трансляцией остаются. Клинические испытания с использованием ТФМ для лечения ожирения и метаболического синдрома указывают на минимальное влияние на эти расстройства или их отсутствие13,14,15. Таким образом, необходимы дополнительные исследования для выявления дополнительных терапевтических направлений, нацеленных на микробиоту кишечника для лечения кардиометаболических нарушений. Большинство имеющихся данных о микробиоте кишечника и сердечно-сосудистых заболеваниях являются ассоциативными. В описанном протоколе обсуждается, как использовать комбинацию ТФМ и швейцарского метода прокатки, чтобы показать связь между заболеванием и микробиотой кишечника и непосредственно оценить целостность всех отделов кишечника16,17,18.
Общая цель этого метода состоит в том, чтобы дать рекомендации по изучению влияния микробиома кишечника на экспериментальные сердечно-сосудистые заболевания. Этот протокол предоставляет более подробную информацию и ключевые соображения в дизайне эксперимента, чтобы способствовать физиологической трансляции и повысить строгость и воспроизводимость результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными и их использованию Университета Вандербильта одобрил все процедуры, описанные в этой рукописи. Самцов мышей C57B1/6 в возрасте 3 месяцев, приобретенных в Лаборатории Джексона, содержали и ухаживали за ними в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Сбор, хранение и обработка образцов фекалий человека
- Соберите образец стула, используя стерильный контейнер, если субъект находится в клинике. Охладите образцы стула при температуре 4 °C в течение 36 часов после сбора до готовности к обработке. В качестве альтернативы можно собрать образцы стула с помощью коммерчески доступного инструмента для легкой и расширенной стабильности ДНК при температуре окружающей среды, особенно для домашнего использования.
- Продезинфицируйте вытяжной шкаф уровня биобезопасности 10% раствором отбеливателя или другим дезинфицирующим средством, одобренным Агентством по охране окружающей среды.
- Достаньте табурет из прохладного хранилища и занесите в вытяжной шкаф; используйте одноразовый шпатель, чтобы сделать ~ 1 г аликвот и хранить в морозильной камере с температурой -80 ° C до полной готовности к обработке.
- Выбросьте все одноразовые предметы в мусорное ведро биологической опасности. Продезинфицируйте все поверхности (вытяжку и любые поверхности, к которым прикасается процессор) и предметы, извлекаемые из вытяжки.
2. Асептический сбор образцов фекалий мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте асептические методы, включая стерилизованные инструменты.
- Усыпить мышь удушьем CO2 . Опрыскайте грудь и бока мыши 70% этанолом и осторожно вскройте кожу и брюшную полость, чтобы обнажить желудочно-кишечный тракт.
- Изолируйте слепую кишку и используйте стерильные хирургические ножницы, чтобы разрезать ее пополам. Вкратце обнажите слепую кишку и отрежьте 0,5 см проксимально от подвздошной кишки и 0,5 см дистально на ее стыке с толстой кишкой. Переложите изолированную слепую кишку на стерильную чашку Петри.
- Используйте стерильный шпатель для переноса содержимого слепой кишки в стерильные пробирки и храните аликвоты в морозильной камере при температуре -80 °C19.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку большинство бактерий в кишечнике являются анаэробами, воздействие кислорода может повредить или убить организмы во время процедуры изоляции в комнатной атмосфере. Таким образом, образцы фекалий должны быть изолированы в анаэробных камерах для поддержания жизнеспособности бактерий.
3. Трансплантация фекалий
- Ресуспендируют свежие или ранее замороженные фекальные гранулы в стерильном физиологическом растворе в пропорции 1:20 (мас.:об.) и перемешивают до гомогенизации.
- Пропустите гомогенат через нейлоновый фильтр с порами 30 мкм, чтобы удалить крупные твердые частицы. Центрифугу при 79 × г в течение 5 мин и собирают надосадочную жидкость для использования для трансплантации.
- Пероральный зонд 100 мкл суспензии на мышь-реципиент без микробов в течение 3 дней подряд, а затем зонд каждые 3 дня в течение 2 недель. Используйте обычных мышей для изучения механизмов кишечной микробиоты, если они были сначала обработаны антибиотиками для устранения собственной эндемичной микробиоты реципиента. Например, вводят цефтриаксон (400 мг / кг) ежедневно мышам-реципиентам в течение 5 дней подряд через пероральный зонд перед зондом фекальной суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования показывают, что для выявления сердечно-сосудистых изменений, включая артериальное давление20, необходимо как минимум 2 недели этого лечения. - Убедитесь, что мыши-реципиенты без микробов содержатся в одиночестве в изоляторах гнотобиотической пленки и питаются стерильной пищей и водой.
4. Измерение систолического артериального давления
ПРИМЕЧАНИЕ: Гнотобиотическим мышам, получавшим ТФМ от 3-месячных мышей C57Bl/6, содержавшихся в обычном состоянии, имплантировали осмотических мини-насосов (Alzet, модель 2002 г.) для инфузии низких доз ангиотензина II (140 нг/кг/мин) в течение 2 недель. Артериальное давление контролировалось еженедельно с помощью хвостовой манжеты. Ранее сообщалось о протоколе имплантации осмотических мини-насосов21. Фрак-манжета была выполнена, как кратко изложено ниже. Неинвазивный метод измерения артериального давления, такой как хвостовая манжета, подходит для исследований ТФМ на гнотобиотических мышах. Подробные шаги о том, как выполнить заднюю манжету, были описаны ранее22.
- Вкратце, извлеките мышей из изоляторов гнотобиотиков и предварительно нагрейте платформу машины с хвостовой манжетой и держатель мыши.
- Поместите находящихся в сознании мышей в удерживающие устройства на подогреваемой платформе и соберите не менее трех раундов измерений систолического давления с помощью плетизмографии хвостовой манжеты. Выполните следующие шаги ниже за 3 дня подряд до соответствующих дней измерения, чтобы научить мышей сдерживаться, чтобы уменьшить стресс.
- Аккуратно поместите мышь в предварительно разогретый держатель и оставьте хвост снаружи. Аккуратно заклейте верхнюю часть, не зажимая ее, чтобы не напрягать мышь.
- Дайте мыши отдохнуть в держателе; Поместите на платформу на 3-5 минут, накрыв простыней для акклиматизации.
- Усредните измерения из всех раундов для среднего систолического давления для каждого животного.
5. Оценка ТФМ сердечно-сосудистых изменений
- После измерения артериального давления усыпьте мышей и асептически соберите содержимое слепой кишки, как описано в разделе 2.
- Соберите кишечник и другие ткани, включая сердце, аорту, печень, брыжеечные артерии и почки, чтобы изучить роль микробиоты кишечника в кардиометаболическом здоровье. Чтобы собрать ткани, найдите ткань в мыши и используйте ножницы, чтобы удалить их.
- Проведите анализ метагеномного секвенирования образцов фекалий/содержимого слепой кишки, собранных у мышей-доноров и мышей-реципиентов, чтобы подтвердить приживление микробиоты кишечника после ТФМ23. Первым доказательством успешной колонизации микробиоты является подтверждение того, что микробиота донора и реципиента схожа.
- Используйте метод швейцарского рулета (см. раздел 6) на собранной ткани кишечника в сочетании с иммуноокрашиванием и гистологией для изучения морфологических изменений и изменений клеточной экспрессии24.
6. Приготовление швейцарских роллов для кишечника
- День 1
- У правильно усыпленной мыши, опрысканной 70% этанолом, рассекают кишечник мыши с анальной стороны (зафиксированной в забрюшинном пространстве) на сторону желудка. Поместите весь изолированный желудочно-кишечный тракт в чашку Петри, содержащую фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS). Осторожно удерживайте проксимальный конец от конца желудка и удалите окружающий жир и соединительную ткань рукой.
- Изолируйте тонкую кишку (голову от аппендикса) и сделайте зигзаг Z-типа с каждой длиной. Затем разрезают, чтобы получить двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку последовательно, как описано ранее25. Изолируйте толстую кишку, разрезав участок кишечника ниже слепой кишки.
- Разрежьте двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, подвздошную кишку и толстую кишку.
- Промыть и промыть кишечник внутрь с помощью ПБС с помощью шприца и иглы с шариковым наконечником, чтобы не порвать кишечник.
- Положите кишку на фильтровальную бумагу. Пометьте бумагу названием сечения (например, двенадцатиперстной кишки), а затем «P» в правом верхнем углу для проксимального или «D» для дистального отдела в правом нижнем углу.
- Разрежьте кишку в продольном направлении шариковыми ножницами. Откройте кишку на фильтровальной бумаге. При необходимости мойте с большим количеством PBS.
- Поместите кишку между двумя фильтровальными бумагами. Скрепите фильтровальную бумагу в четырех точках/углах рядом с кишечником.
- Замочить в 10% нейтральном буферном растворе формалина (4,0 г фосфата натрия, одноосновного, 6,5 г фосфата натрия, двухосновного, 100 мл 37% формальдегида, 900 мл дистиллированной воды). Встряхните с помощью качалки платформы при 5 об/мин при комнатной температуре в течение ночи.
- День 2
- Приготовьте 2% агарозы в дистиллированной воде и нагрейте мешалкой в стакане, застеленном алюминиевой фольгой.
- Извлеките салфетки; Зачистите верхнюю фильтровальную бумагу. Сверните кишку с проксимальной стороны так, чтобы проксимальная сторона сначала вошла внутрь, и сверните внутрь, чтобы просвет оказался внутри и на горке. Прикалывайте иглой 30 G или двумя, по мере необходимости.
- Аспирируйте 1 мл агарозы с помощью одноразовых пипеток для переноса и вылейте агарозу на свернутый срез кишки на плоской поверхности, избегая пузырьков воздуха в тканях.
- Дайте агарозе остыть и застыть. Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать лишнюю агарозу вокруг участка ткани.
- Поместите срезы кишечника в кассеты для обработки / встраивания тканей (больше, чем обычные, чтобы приспособиться к увеличенной высоте из-за агарозы). Замочите в 70% этаноле при 4 °C.
- Подготовьте залитые парафином предметные стекла для тканей и приступайте к иммуноокрашиванию, как описано ниже.
7. Иммуноокрашивание кишечника, кишечного тракта
- Депарафинизация
- Пройдите через следующие ванны с горками в стойке: ксилол в течение 3 мин, свежий ксилол снова в течение 3 мин, ксилол со 100% этанолом (1:1) в течение 3 мин, 95% этанол в течение 3 мин, 70% этанол в течение 3 мин и 50% этанол в течение 3 мин.
- Аккуратно смойте холодной проточной водой из-под крана. Хранить в ванне с водопроводной водой.
- Извлечение антигена
- После депарафинизации прокипятите предметные стекла на решетке в ванне с буфером для извлечения антигена (0,01 М дигидрат тринатрийцитрата при pH 6 и 0,05% Tween-20) при 100 ° C в течение 20 мин.
- Пропустить под холодной водой из-под крана.
- Окрашивание
- Снимите предметные стекла с ванны и поместите салфетку лицевой стороной вверх в коробку для слайдов с влажными лабораторными салфетками / бумажными полотенцами на дне. Нарисуйте контур вокруг ткани гидрофобным маркером.
- Капните трис-буферный физиологический раствор (TBS) + 0,025% Triton X-100 на ткань и инкубируйте в течение 5 минут. Повторите этот шаг.
- Блок TBS + 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 2 ч при комнатной температуре. Переверните предметные стекла на бок и снимите блокирующий буфер на лабораторной салфетке.
- Добавьте первичный раствор антител и инкубируйте при 4 °C не менее 2 ч или на ночь. Аккуратно вымойте TBS + 0,025% Triton X-100, аккуратно пипетировав ~ 200 мкл на срез.
- Добавить раствор вторичных антител и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Промойте предметные стекла 3 раза 5 мин с помощью TBS, промыв пипеткой, как описано на шаге 7.3.4.
- Крепление с монтажным носителем и покровным стеклом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Шаги, описанные выше, обобщены на рисунке 1. Содержимое слепой кишки мыши или фекалии человека ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе для приготовления суспензии для введения мышам без микробов (100 мкл) через зонд, сначала в течение 3 дней подряд, затем один раз в 3 дня. В конце протокола измеряется артериальное давление методом хвостовой манжеты, мышей усыпляют, а ткани собирают для оценки изменений в микробиоте кишечника, сердечно-сосудистых и метаболических изменений.
Ключевым шагом при выборе микробиоты является обеспечение того, чтобы интересующий фенотип заболевания присутствовал у донора и ассоциировался с дисбиотическими изменениями. Например, диета с высоким содержанием соли тесно связана с дисбактериозом и сердечно-сосудистой дисфункцией. В этом исследовании использовался донор мышей, которых кормили 8% диетой NaCl. Изменения в микробиоте кишечника в ответ на высокое содержание соли включали снижение биоразнообразия бактерий (рис. 2A), которое группировалось отдельно от нормальной солевой микробиоты (рис. 2B). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes также было увеличено (рис. 2C), что свидетельствует о высоких изменениях микробиоты, вызванных солью (с изменениями в Ferguson et al.12).
Чтобы определить роль дисбиоза с высоким содержанием соли, индуцированного солью, в предрасположенности к гипертонии, проводили ТФМ от мышей с высоким содержанием соли до мышей без микробов и оценивали реакцию артериального давления на низкую субпрессорную дозу ангиотензина II (Ang II). В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL / 6 в возрасте 3 месяцев. Мышам-реципиентам имплантировали осмотические мини-насосы для введения непрерывной низкой дозы Ang II (140 нг / кг /) в течение 2 недель мышам. У мышей, получавших ТФМ от доноров с высоким содержанием соли, наблюдалось значительное повышение артериального давления при лечении Ang II по сравнению с нормальными реципиентами солевой микробиоты (рис. 3). Это открытие указывает на то, что ТФМ подтолкнул мышей-реципиентов к развитию гипертонии12. Подробности о протоколе хвостовой манжеты у грызунов сообщалось ранее12,26.
Дисбиотическая микробиота кишечника способствует заболеванию отчасти из-за воспаленной и негерметичной стенки кишечника. Таким образом, исследование кишечной стенки с помощью иммуногистохимии может быть использовано для опроса изменений в конкретных областях кишечника при любом болезненном состоянии, даже за пределами ТФМ. На рисунке 4 показано, что мы можем проводить иммуногистохимию на подвздошной кишке, используя технику Swiss-roll и различные маркеры окрашивания, такие как гематоксилин и эозин (H & E), трихром Массона и маркеры иммунных клеток, такие как анти-CD3 и анти-CD68., как описано ранее 12, и аполипопротеин AI (AI), который накапливался в подвздошной кишке протеинурических мышей (рис. 4).
Рисунок 1: Диаграмма, обобщающая структуру протокола. Образцы фекалий, собранные у человека или обычной мыши, используются для трансплантации безмикробным мышам. Сокращения: ТФМ = трансплантация фекальной микробиоты; АД = артериальное давление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: У мышей, соблюдающих диету с высоким содержанием соли, наблюдается дисбактериоз кишечной микробиоты. А) Оценка биоразнообразия видов в содержании слепой кишки, полученных от мышей, получавших нормальную соли (черную) и с высоким содержанием соли (красную) диету. (B) Неметрическое многомерное масштабирование показывает, что бактерии мышей с нормальной солью и мышами с высоким содержанием соли образуют отдельные кластеры. (C) Высокое содержание соли связано с повышенным соотношением Firmicutes/Bacteroidetes. (***p < 0,0001, используя двусторонние непарные t-критерии Стьюдента). Этот рисунок адаптирован из Ferguson et al.12. Сокращения: NMDS = неметрическое многомерное масштабирование; NS = нормальная соль; HS = высокое содержание соли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: ТФМ у мышей, которых кормили высоким содержанием соли, предрасполагает безмикробных мышей к гипертонии, вызванной ангиотензином II. Перенос дисбиотической микробиоты кишечника с высоким содержанием соли ассоциировался со значительным повышением систолического давления у безмикробных мышей по сравнению с мышами, получавшими нормальную солевую микробиоту кишечника. Этот рисунок адаптирован из Ferguson et al.12. Сокращения: ТФМ = трансплантация фекальной микробиоты; АД = артериальное давление; Ang II = ангиотензин II; NS = нормальная соль; HS = высокое содержание соли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммуногистохимическое изображение, иллюстрирующее, как оценить изменения маркеров заболевания в кишечнике. Репрезентативные изображения, показывающие окрашивание аполипопротеином AI в подвздошной кишке, полученные от мышей с гиперлипидемией без (А) или с (В) протеинурией. Увеличение: 5x в масштабе 200 мкм (A, B, слева); 10x в масштабе 100 мкм (A, B, справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ценным подходом к изучению причинно-следственной роли микробиоты кишечника при сердечно-сосудистых и метаболических заболеваниях является перенос всей микробиоты или отдельных видов, представляющих интерес, на безмикробных мышей. Здесь мы описываем протоколы сбора образцов фекалий от людей и мышей, обычно размещенных в мышах без микробов, для изучения роли микробиоты кишечника в гипертонических расстройствах.
У мышей мы используем асептически собранное содержимое слепой кишки, обработанное в аэробной камере, а у людей — фекалии. ТФМ можно проводить немедленно, пока образец еще свежий или замороженный в жидком азоте, и выдерживать при -80 °C до готовности к использованию. Если образец не может быть немедленно заморожен, например, в случае людей, собирающих свои образцы дома, важно использовать консервант для нуклеиновых кислот, таких как этанол. Большинство бактерий в кишечнике являются анаэробами; При подготовке образцов фекалий к трансплантации это необходимо делать быстро, чтобы избежать воздействия аэробных сред на бактерии, так как это может снизить эффективность из-за уменьшения количества анаэробов в смеси27. Для лонгитюдного исследования метагеномное секвенирование образцов следует проводить вместе, чтобы избежать пакетных эффектов. Образцы для ТФМ могут поступать от одного или нескольких доноров, объединенных вместе, а затем распределяться среди нескольких реципиентов в экспериментальных группах.
Чрезвычайно важно, чтобы успех ТФМ был подтвержден экспериментально до изучения механистических последствий. Содержимое фекалий или слепой кишки может быть проанализировано с помощью метагеномики и оценки сходства между донорами и реципиентами. Ожидаемые результаты будут аналогичными микробным разнообразием с помощью индексов альфа-разнообразия, анализа главных координат и функциональных профилей. Только тогда можно сделать вывод о том, что микробиота кишечника играет важную роль в этиологии заболевания. Этот шаг еще более важен, если в исследовании используются мыши, содержащиеся в обычном помещении, которые были предварительно обработаны антибиотиками для истощения их эндемичной микробиоты. Это связано с тем, что, если этот шаг не увенчался успехом, бактерии выживших реципиентов могут повлиять на исход заболевания. Однако успешная ТФМ, особенно в доклинических исследованиях, не всегда приводит к клиническому переводу. Таким образом, необходимы дополнительные подтверждающие шаги, чтобы вовлечь прямые механизмы, связанные с кишечником, в патофизиологию заболевания, включая изменения в морфологии кишечника с использованием описанной здесь техники швейцарского ролла.
Установлена прямая роль активации иммунных клеток в развитии артериальной гипертензии, продемонстрированная в исследованиях адоптивного переноса28,29,30. Хотя безмикробные мыши являются золотым стандартом в определении причинной роли микробиоты в заболевании, модель может быть ограничена в изучении воспалительных механизмов кардиометаболических заболеваний. У безмикробных мышей неразвитая иммунная система, что снижает их трансляционную значимость в изучении взаимодействия между микробиотой кишечника и воспалением. В качестве альтернативы, этот протокол может быть модифицирован для трансплантации образцов фекалий обычным мышам после истощения их микробиоты с помощью антибиотиков или очищения кишечника полиэтиленгликолем31,32. ТФМ у мышей, содержащихся в обычном помещении, предварительно обработанных антибиотиками, устраняет необходимость в строго контролируемой и дорогостоящей среде, которая необходима для содержания мышей, свободных от микробов. Современные данные показывают, что выбор антибиотиков, будь то один или комбинация, и протокол лечения варьируются в разных исследованиях33,34,35. Выбор антибиотиков определит типы бактерий, которые будут истощаться из-за вариаций механизмов действия и, следовательно, влиять на фенотип. Таким образом, дизайн эксперимента должен учитывать типы бактерий, которые, как известно, опосредуют фенотип, и соответственно должны быть выбраны антибиотики широкого спектра действия, способ введения и схема.
Этот протокол имеет свои ограничения. Безмикробные мыши содержатся в гнотобиотических установках, что затрудняет экспериментальные процедуры, связанные с изучением сердечно-сосудистых заболеваний. Например, радиотелеметрия является золотым стандартом измерения артериального давления, но включает в себя очень инвазивные хирургические процедуры. Это непрактично для иммунных, наивных безмикробных мышей. Таким образом, для этой цели используется неинвазивная задняя манжета, чтобы избежать микробного загрязнения12. Как правило, для получения относительно точных измерений с помощью плетизмографии с хвостовой манжетой животных обучают и акклиматизируют к платформе перед измерениями систолического давления. В исследованиях ТФМ без микробов исследователям следует рассмотреть возможность сбора и усреднения нескольких измерений36.
Эти проблемы могут проявляться и в других конечных точках, помимо артериального давления. Например, исследования, изучающие поведенческие аспекты сердечно-сосудистых заболеваний, часто требуют частого обращения и внешнего воздействия. Исследование, изучающее влияние диеты с высоким содержанием клетчатки на когнитивную и социальную дисфункцию, вызванную ожирением у матерей, продемонстрировало успешную ТФМ у обычных мышей, которых предварительно лечили антибиотиками37. Исследования, изучающие продольные сердечно-сосудистые реакции, могут рассматривать ТФМ у мышей, содержащихся в обычном состоянии.
В дополнение к измерению артериального давления, животные могут быть усыплены, а ткани собраны для дальнейшего исследования. Примечательно, что содержимое слепой кишки должно быть собрано для оценки успешного приживления трансплантированной микробиоты. Этот подробный протокол поможет исследователям изучить механизм кишечного микробиома от ТФМ до тканевых уровней и применим к функциональным исследованиям. Это важно, потому что существует огромное количество методической и доступной в настоящее время литературы. В механистических целях плазма, кишечник, почки, сердца и другие ткани могут быть собраны для исследования вовлеченных путей. Причинно-следственные эффекты кишечной микробиоты при заболевании связаны с метаболитами, которые они продуцируют, и их высвобождением в систему из-за негерметичности кишечника. Здоровье всего кишечника можно оценить с помощью гистологических и иммуноокрашивающих подходов. Метод Swiss-roll был использован для демонстрации эффекта болезни FMT у мышей12,24.
Вклад микробиоты кишечника в сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония, остается ассоциативным. Здесь мы представили методологические подходы к сбору, обработке и трансплантации фекалий от людей или обычных мышей к безмикробным мышам. В протоколе обобщены дополнительные экспериментальные методы и параметры, которые необходимо изучить для определения причины и/или следствия микробиоты кишечника в кардиометаболическом здоровье. Исследования должны быть повторены, чтобы обеспечить воспроизводимость и строгость желаемого фенотипа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конфликтах интересов, финансовых или иных.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом Вандербильта на премию в области клинических и трансляционных наук UL1TR002243 (А.К.) от Национального центра развития трансляционных наук; Грант Американской кардиологической ассоциации POST903428 (для J.A.I.); и гранты Национального института сердца, легких и крови K01HL13049, R03HL155041, R01HL144941 (А.К.) и грант NIH 1P01HL116263 (В.К.). Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Anaerobic chamber | COY | 7150220 | |
| Apolipoprotein AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Bleach solution | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 antibody | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| CD68 monoclonal antibody | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| CODA high throughput monitor | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Disposable graduate transfer pipettes | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Feeding Needle | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Filter paper sheet | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalin (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| High salt diet | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Osmotic mini-pumps | Alzet | MODEL 2002 | |
| PAP Pen | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Petri dish | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Smart spatula | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Stool collection device | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 |
|
| Varimix platform rocker | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes: a population-based cross-sectional study. Cell Metabolism. 32 (3), 379-390 (2020).
- Crovesy, L., Masterson, D., Rosado, E. L. Profile of the gut microbiota of adults with obesity: a systematic review. European Journal of Clinical Nutrition. 74 (9), 1251-1262 (2020).
- Avery, E. G., et al. The gut microbiome in hypertension: recent advances and future perspectives. Circulation Research. 128 (7), 934-950 (2021).
- Perez-Matute, P., Iniguez, M., de Toro, M., Recio-Fernandez, E., Oteo, J. A. Autologous fecal transplantation from a lean state potentiates caloric restriction effects on body weight and adiposity in obese mice. Scientific Reports. 10 (1), 9388 (2020).
- Zoll, J., et al. Fecal microbiota transplantation from high caloric-fed donors alters glucose metabolism in recipient mice, independently of adiposity or exercise status. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 319 (1), 203-216 (2020).
- Hvas, C. L., et al. Fecal microbiota transplantation is superior to fidaxomicin for treatment of recurrent Clostridium difficile infection. Gastroenterology. 156 (5), 1324-1332 (2019).
- Kootte, R. S., et al. Improvement of insulin sensitivity after lean donor feces in metabolic syndrome is driven by baseline intestinal microbiota composition. Cell Metabolism. 26 (4), 611-619 (2017).
- Li, J., et al. Gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension. Microbiome. 5 (1), 14 (2017).
- Shi, H., et al. Restructuring the gut microbiota by intermittent fasting lowers blood pressure. Circulation Research. 128 (9), 1240-1254 (2021).
- Zhong, H. J., et al. Washed microbiota transplantation lowers blood pressure in patients with hypertension. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 679624 (2021).
- Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
- Yu, E. W., et al. Fecal microbiota transplantation for the improvement of metabolism in obesity: The FMT-TRIM double-blind placebo-controlled pilot trial. PLoS Medicine. 17 (3), 1003051 (2020).
- Leong, K. S. W., et al. Effects of fecal microbiome transfer in adolescents with obesity: the gut bugs randomized controlled trial. JAMA Network Open. 3 (12), 2030415 (2020).
- Zhang, Z., et al. Impact of fecal microbiota transplantation on obesity and metabolic syndrome-a systematic review. Nutrients. 11 (10), 2291 (2019).
- Laubitz, D., et al. Dynamics of gut microbiota recovery after antibiotic exposure in young and old mice (a pilot study). Microorganisms. 9 (3), 647 (2021).
- Xiao, L., et al. High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice. Microbiome. 5 (1), 43 (2017).
- Brunt, V. E., et al. Suppression of the gut microbiome ameliorates age-related arterial dysfunction and oxidative stress in mice. The Journal of Physiology. 597 (9), 2361-2378 (2019).
- Choo, J. M., Rogers, G. B. Gut microbiota transplantation for colonization of germ-free mice. STAR Protocols. 2 (3), 100610 (2021).
- Kim, T. T., et al. Fecal transplant from resveratrol-fed donors improves glycaemia and cardiovascular features of the metabolic syndrome in mice. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 511-519 (2018).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Wang, Y., Thatcher, S. E., Cassis, L. A. Measuring blood pressure using a noninvasive tail cuff method in mice. Methods in Molecular Biology. 1614, 69-73 (2017).
- Ishimwe, J. A., et al. The gut microbiota and short-chain fatty acids profile in postural orthostatic tachycardia syndrome. Frontiers in Physiology. 13, 879012 (2022).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. Journal of Visualized Experiments. (113), e54161 (2016).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Laboratory Animals. 15 (1), 57-59 (1981).
- Ishimwe, J. A., Garrett, M. R., Sasser, J. M. 1,3-Butanediol attenuates hypertension and suppresses kidney injury in female rats. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 319 (1), 106-114 (2020).
- Bokoliya, S. C., Dorsett, Y., Panier, H., Zhou, Y. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711055 (2021).
- Van Beusecum, J. P., Xiao, L., Barbaro, N. R., Patrick, D. M., Kirabo, A. Isolation and adoptive transfer of high salt treated antigen-presenting dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (145), e59124 (2019).
- Harrison, D. G., Marvar, P. J., Titze, J. M.
- Sylvester, M. A., et al. Splenocyte transfer from hypertensive donors eliminates premenopausal female protection from ANG II-induced hypertension. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (3), 245-257 (2022).
- Reikvam, D. H., et al. Depletion of murine intestinal microbiota: effects on gut mucosa and epithelial gene expression. PLoS One. 6 (3), 17996 (2011).
- Le Roy, T., et al. Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter. Frontiers in Microbiology. 9, 3289 (2019).
- Sun, J., et al. Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice. Translation Psychiatry. 9 (1), 189 (2019).
- Kim, M., et al. Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses. Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Wilde, E., et al. Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse. Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204 (2017).
- Liu, X., et al. High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis. Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).
