Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Контактная гиперчувствительность как мышиная модель аллергического контактного дерматита

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

Контактная гиперчувствительность (СГС) является мышиной экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (АКД). CHS основан на сенсибилизации реактивным гаптеном путем окрашивания бритой кожи грудной клетки и живота, с последующим вызовом кожи уха с разбавленным гаптеном, вызывая реакцию отека, которая оценивается различными способами.

Abstract

Контактная гиперчувствительность (CHS) является экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (ACD), которая может быть изучена на мышах. Это исследование направлено на представление объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами. Чтобы индуцировать CHS, в день «0» мышей сенсибилизировали на ранее выбритом месте путем окрашивания брюшной кожи гаптеном 2,4,6-тринитрохлорбензолом (TNCB) в смеси ацетона-этанола, тогда как отрицательные контрольные мыши были фиктивно сенсибилизированы смесью транспортного средства-ацетона-этанола. На день «4» базовую толщину уха измеряли микрометром до выявления CHS (вызова) путем окрашивания обоих ушей разбавленным TNCB как в тестовой, так и в контрольной группах. Через 24 ч отек уха измеряли микрометром. CHS является примером Опосредованного Т-клетками иммунного ответа, который вызывает отек в воспаленной ткани, достигая пика через 24 ч после того, как кожа бросает вызов с тем же гаптеном. Увеличение отека уха коррелировало с увеличением веса уха, активностью миелопероксидазы (МПО), провоспалительной концентрацией цитокинов в экстрактах уха, повышенным утолщением отечной дермы при гистологическом исследовании и проницаемостью сосудов уха. Также наблюдалось увеличение концентрации TNP-специфических антител IgG1 в сыворотках тестовой группы по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, CHS может быть успешно передан с CHS-эффекторными клетками, полученными от доноров, ранее сенсибилизированных TNCB. CHS-эффекторные клетки вводили внутривенно наивным мышам-реципиентам, которым впоследствии бросали вызов тем же разбавленным гаптеном. Отек уха измеряли микрометром через 24 часа.

Introduction

Аллергический контактный дерматит (ACD) является распространенным воспалительным заболеванием кожи в промышленно развитых странах, вызванным реакцией гиперчувствительности IV типа, возникающей в результате воздействия низкомолекулярных химических веществ, называемых гаптенами. Вещества, вызывающие контактную сенсибилизацию у людей, включают ионы тяжелых металлов (хром, никель, железо, кобальт), скипидар, ароматизаторы, красители и консерванты, присутствующие в косметике (например,-фенилендиамин), некоторые лекарства (например, неомицин, бензокаин), β-лактамные антибиотики (т.е. пенициллин), химические вещества, производимые растениями (пентадекакатехол, вещество, присутствующее в ядовитом плюще), а также гидрохинон, используемый в фотографической промышленности 1,2 . Этиологические агенты ACD очень высоки, так как более 100 000 химических веществ используются только в промышленности, и 2000 новых синтезируются каждый год. На сегодняшний день идентифицировано более 3 700 молекул, которые могут быть контактными гаптенами/аллергенами3. Реакция контактной гиперчувствительности (CHS) представляет собой экспериментальную модель ACD, которая может быть изучена на мышах, морских свинках и крысах и может быть индуцирована местным применением в кожу реактивных химических гаптенов, растворенных в органических растворителях 4,5,6. Это исследование направлено на описание объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами.

CHS состоит из фаз сенсибилизации (индукции) и эффекторной (вызов). На животных моделях гаптены сначала связываются ковалентно с белками в организме для создания неоантигенов. Во время фазы сенсибилизации активированные кератиноциты способствуют миграции и созреванию дендритных клеток кожи (sDC), продуцируя провоспалительные цитокины-фактор некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкин 1β (IL-1β)7. Эпидермальные клетки Лангерганса (LC) представляют антигены во время индукционной и эффекторной фазCHS 8. ЛК, подвергающиеся воздействию гаптена во время сенсибилизации, способствуют индукции как регуляторных, так и эффекторных клеток9. Растущие данные нескольких исследований свидетельствуют о том, что ответы CHS могут быть опосредованы либо CD4 + MHC клетками Th1 класса II, локально высвобождающими интерферон-γ (IFN-γ) для использования характерного воспалительного инфильтрата, CD8 + MHC класса I-ограниченных лимфоцитов Tc1, которые также могут высвобождать IFN-γ но в основном опосредуют цитотоксическое повреждение кератиноцитов, а теперь также интерлейкин 17 (IL-17), продуцирующие клетки Th1710, 11.

Разработано несколько различных моделей CHS, использующих различные виды1 2,13,14 и гаптены (подробное сравнение различных гаптенов, растворителей и времени применения обобщено в таблице 1). Мышь, часто используемый лабораторный вид, предлагает несколько преимуществ в изучении CHS. Среди мышей больше штаммов, нокаутов (КО) и трансгенных животных по сравнению с другими видами, что делает их очень привлекательным животным15. Кроме того, модель CHS требует много животных, и мыши здесь более экономичны. Животные модели не имитируют ACD во всех аспектах; в частности, они показывают корку и шелушение, что не характерно для человека 16,17. Признаки хронического заболевания сложно воспроизвести, главным образом потому, что описанная модель не предполагает применения гаптена в течение длительного периода времени. Однако здесь было подтверждено, что многие из важных аспектов ACD воспроизводятся. Также было показано, что, как и у человека, эти особенности связаны с местными аллергическими реакциями. Выбор гаптена, его растворителя и его применение, изложенное в этом протоколе, были продиктованы тем фактом, что результаты были подтверждены многочисленными тестами in vitro и что он был протестирован и модифицирован в лаборатории в течение многих лет, пока не была установлена текущая версия. Мышиные модели позволяют анализировать подмножества клеток или цитокины, которые участвуют в развитии ACD и необходимы для доклинических оценок новых методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты, представленные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами 1-го Местного этического комитета по испытаниям на животных в Кракове. Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с местными рекомендациями, особенно в отношении использования кетамина / ксилазина в качестве анестетика, использования обеих сторон ушей для нанесения вещества / гаптена, отрезания уха и сбора крови путем удаления глазного яблока. Для настоящего исследования использовались BALB/c (гаплотип H-2d), CBA/J (H-2k) и C57BL/6 (H-2b) самцы и самки мышей в возрасте 6-12 недель (см. Таблицу материалов). Для статистической значимости лучше всего, если каждая группа мышей состоит из 10-12 животных.

1. Подготовка животных

  1. Очистите операционный стол 70% раствором этанола до и после всех процедур. При использовании мышей, требующих стерильных условий, выполните все операции в шкафу биобезопасности.

2. Маркировка мышей для идентификации

  1. Пометьте мышей, сбрив кожу лезвием бритвы: #0 - без опознавательных знаков, #2 - на правой передней лапе, #3 - на правой стороне, #4 - на правой задней лапе, #5 - у основания хвоста, #6 - на левой задней лапе, #7 - на левой стороне, #8 - на левой передней лапе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за индуцированной реакции мыши не могут быть классически помечены ударами по уху или маркировкой. Мышей не анестезировали во время маркировки.

3. Индукция CHS

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 1.

  1. Выполните сенсибилизацию (индукцию), выполнив следующие действия.
    1. В день «0» побрить мышей на груди и животе (квадрат 2 см х 2 см) нанеся серое мыло с водой и побрив лезвием бритвы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением гаптена подождите 6 ч, чтобы кожа не раздражалась.
    2. Готовят 5% гаптена: 2,4,6-тринитрохлорбензол (TNCB, см. Таблицу материалов) в смеси ацетон-этанол (соотношение 1:3) или только в транспортном средстве (ацетон-этанол). Подготовьте растворы непосредственно перед использованием в стеклянном флаконе и защитите его от света, накрыв флакон алюминиевой фольгой.
    3. В тот же день сенсибилизируйте мышей, нанеся 150 мкл 5% гаптена на ранее выбритое место. В группе контрольных мышей применяют только транспортное средство для оценки неспецифической воспалительной реакции. Прежде чем поместить животное обратно в клетку, подождите 30 секунд, дав гаптену высохнуть.
      ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки; TNCB вызывает тяжелую аллергическую реакцию у большинства людей.
  2. Выполните выявление (вызов) и измерение отека уха.
    1. На день «4» готовят 0,4% гаптена: ТНКБ в ацетон-этаноловой смеси (соотношение 1:1). Подготовьте раствор непосредственно перед использованием в стеклянном флаконе и защитите его от света, накрыв флакон алюминиевой фольгой.
    2. Обезболивают мышей внутрибрюшинной (т..) инъекцией смеси кетамина (90-120 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) (см. Таблицу материалов) для глубокой анестезии. Убедитесь, что мышь полностью обезболена в течение не менее 5 минут.
    3. Измерьте толщину уха (измерение 0 ч, базовая линия) микрометром (см. Таблицу материалов) наблюдателем, не знающим об экспериментальных группах.
    4. Применяют 10 мкл 0,4% гаптена на обе стороны ушей в обеих группах (тестовая и контрольная). Прежде чем поместить животное обратно в клетку, подождите 30 секунд и дайте гаптену высохнуть.
    5. На днем "5", через 24 ч после нанесения гаптена, повторите шаги 3.2.2-3.2.3 для измерения в течение 24 ч.
    6. Оцените реакцию CHS, рассчитав разницу в толщине ушной раковины до и после вызова с гаптеном: толщина уха 24 ч (мкм) - толщина уха 0 ч (мкм). Подсчитывайте каждое ухо как отдельное измерение. Далее выражают отек уха в микрометрах (мкм) ± стандартной погрешности среднего значения (SEM) (таблица 2, рисунок 3).

4. Биопсия уха

  1. Непосредственно после 24-часового измерения толщины уха (когда мышь еще находится под глубоким наркозом) ножницами отрежьте уши как можно ближе к черепу. Соберите биопсию с дистальной стороны ушей, сделав перфоратор диаметром 6 мм с помощью биопсийного перфоратора (см. Таблицу материалов).
    1. Измерить вес уха (этап 4.2) и дополнительно выполнить один из следующих тестов на той же биопсии уха: анализ миелопероксидазы (MPO) (этап 4.3) или измерение in vitro концентрации цитокинов в ушных экстрактах (например, IFN-γ, IL-17A, TNF-α [этап 4.4]).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрежьте уши перед забором крови. После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  2. Измерьте вес каждой биопсии уха на аналитических весах и выразите его в миллиграммах (мг) (рисунок 4).
  3. Выполните анализ MPO, выполнив следующие действия.
    1. Получают буфер гомогенизации путем растворения 0,5% гексадецилтриметиламмония бромида в 50 ммоль фосфоратном буфереKH2PO4/Na2HPO4 и регулировки рН до 6,0 (используют при комнатной температуре, RT).
    2. Гомогенизируйте биопсию в микроцентрифужных пробирках объемом 2 мл с 500 мкл подготовленного буфера в течение 10 мин с помощью гомогенизатора с шариками из нержавеющей стали диаметром 5 мм (добавьте два шарика на флакон) (см. Таблицу материалов). Затем охладите образец в течение 15 мин при 4 °C и гомогенизируйте его еще на 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные трубки имеют круглое дно, так что бусины могут легко двигаться.
    3. Заморозить гомогенаты при −20 °C в течение 30 мин. Оттепель и вихрь (убедитесь, что образцы разморожены). Повторите эту процедуру 3x.
    4. Центрифугировать гомогенаты при 3 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Собирайте супернатанты с помощью пипетки. Экспрессируют активность МПО в единицах (U) на 1 мг белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образцы стабильны при температуре −20 °C в течение 3 месяцев.
    5. Для измерения активности МПО проводят ферментативную реакцию путем смешивания 20 мкл супернатанта и 200 мкл субстрата МПО (0,167 мг/мл орто-дианизина дигидрохлорида в 50 ммоль буфера KH2PO4/Na2HPO4 с 5 x 10−4% H202) и добавляют в 96-луночные плоскодонные пластины. Инкубировать пластины в течение 20 мин на RT.
    6. Подготовьте стандартную кривую, используя 20 мкл стандарта MPO в концентрациях от 0,008 U до 0,5 U в 200 мкл подложки MPO. Подготовьте пустой образец только с помощью подложки MPO.
      ВНИМАНИЕ: Используйте маску во время работы с орто-дианизин дигидрохлоридом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть изготовлены из полипропилена, который имеет более низкую связывающую способность, поэтому белки или ДНК не будут связываться.
    7. Измерьте оптическую плотность (OD) на длине волны λ = 460 нм. Ферментативная реакция стабильна в течение 10 мин. Считывание активности MPO в тестируемых образцах со стандартной кривой.
    8. Чтобы измерить концентрацию белка, используйте 20 мкл надосадочного вещества, выполните тест с набором бицинхониновой кислоты для определения белка (см. Таблицу материалов) и измерьте OD при λ = 562 нм (рисунок 5).
  4. Выполните in vitro измерение цитокинов в экстракте уха.
    1. Гомогенизируйте биопсию уха при RT в микроцентрифужных трубках объемом 2 мл с реагентом экстракции тканевого белка (T-PER) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора с шариками из нержавеющей стали диаметром 5 мм (добавьте две бусины / флакон). Затем охладите образец в течение 15 мин при 4 °C и гомогенизируйте его еще на 10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микроцентрифужные трубки имеют круглое дно, так что бусины могут легко двигаться.
    2. Центрифугировать гомогенаты при 3 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образцы стабильны при −80 °C в течение 6 месяцев.
    3. Оцените уровни цитокинов с помощью коммерчески доступного набора ИФА (например, IFN-γ) (см. Таблицу материалов) следуя инструкциям производителя (рисунок 6).

5. Гистология ткани уха

  1. Непосредственно после 24-часового измерения толщины уха, когда мышь еще глубоко обезболена, ножницами отрезают уши как можно ближе к черепу (шаг 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  2. Выполните парафиновое встраивание тканевых блоков, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Непосредственно после удаления поместите ухо в ~10 мл 10% формалина в течение 24 ч.
    2. Поместите уши в кассету для обработки тканей. Поместите кассеты в автоматизированный процессор (см. Таблицу материалов) для циклов обезвоживания (спирт 70%, 90%, 100%, 30 мин каждый при RT), циклов очистки (ксилол 3x, 30 мин каждый при RT) и циклов инфильтрации воска (парафин 3x, 30 мин каждый при 56 °C).
    3. Извлеките кассеты из автоматизированного процессора и держитесь за нагревательную пластину до тех пор, пока это потребуется. Наполните восковую форму теплым воском (из дозатора).
    4. Снимите секции с кассеты с подогретыми щипцами и поместите их в форму; Затем поместите кассетную основу на верхнюю часть формы, а затем заполните ее большим количеством воска. Поместите его в охлажденную воду на холодную пластину на 30 минут, чтобы парафин затвердел и образовал блок, содержащий образец.
    5. Используйте вращающийся микротом (см. Таблицу материалов) для резки срезов толщиной ~ 5 мкм. Поместите секции в теплую ванну, чтобы выровнять их. Поднимите секции на предметное стекло микроскопа. Дайте им высохнуть в RT, чтобы секции прилипли к слайду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте слайды, которые устраняют необходимость наносить адгезивные материалы или белковые покрытия, чтобы предотвратить потерю участков ткани во время окрашивания.
  3. Выполните окрашивание гематоксилином и эозином (H&E).
    1. Приготовьте 17 окрашивающих блюд следующим: ксилол (четыре блюда), 100% этанол (абсолютный спирт) (четыре блюда), 90% этанол, 80% этанол, 70% этанол, 50% этанол, PBS (три блюда), раствор гематоксилина, раствор эозина. Перенесите слайды с одного блюда на другое в соответствии с приведенными ниже шагами и выполните все на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура в каждом блюде может быть повторена примерно в 10 раз (например, если используется блюдо с 20 слайдами, можно сделать 200 пятен без замены жидкости).
    2. Депарафинизируют срезы путем инкубации при 65 °C в течение 30 мин в инкубаторе. Погрузите слайды в ксилол на 30 мин. Повторите 1 раз в новом ксилоле в течение 30 мин.
    3. Погрузите слайды в 100% этанол на 5 мин. Повторяют 1 раз в новом 100% этаноле в течение 5 мин. Погружайте слайды в ряд этанола, 90%, 80%, 70% и 50%, в течение 2 мин в каждом разведении.
    4. Погрузите слайды в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) на 5 минут. Протрите лишнюю жидкость вокруг ткани и обратной стороны слайдов.
    5. Окрашивают срезы в раствор гематоксилина (см. Таблицу материалов) в течение 7-8 мин. Промывайте в проточной воде в течение 30 с обратной стороны, чтобы не повредить секции. Повторите шаг 5.3.4.
    6. Окрашивают срезы раствором эозина (см. Таблицу материалов) на 30 с. Вымойте, как указано на этапе 5.3.5, а затем повторите этап 5.3.4.
    7. Погрузите слайды в 100% этанол (абсолютный спирт) на 2 мин. Повторяют 1 раз в новом 100% этаноле в течение 2 мин.
    8. Погрузите слайды в ксилол на 5 минут. Повторите 1 раз в новом ксилоле в течение 5 мин.
    9. Дайте секциям высохнуть на воздухе в течение 15 минут на RT. Добавьте каплю монтажного материала (см. Таблицу материалов) на крышку, а затем поместите ее в верхнюю часть секции.
  4. Осмотрите участок под световым микроскопом под увеличением в 20 или 40 раз и захватите изображения (рисунок 7).

6. Тест на проницаемость сосудов

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы измерению толщины уха может быть выполнен тест на проницаемость сосудов.

  1. Сенсибилизируйте мышей в день «0» (шаги 3.1.1-3.1.3), а затем, в день «4», обезболивайте мышей (шаг 3.2.2) и непосредственно наносите гаптен на уши (шаг 3.2.4), пропуская измерение уха за 0 ч.
  2. Через 23 ч после вызова обезболивают мышей (шаг 3.2.2).
  3. Вводят внутривенно (т.е.в.) 8,3 мкл/г массы тела 1% синего красителя Эванса (см. Таблицу материалов) в фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco(DPBS).
  4. Обезболивают мышей снова глубокой анестезией (шаг 3.2.2)-1 ч после синей инъекции Эванса.
  5. Соберите биопсию уха (шаг 4.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  6. Извлеките краситель из ткани, поместите ушные пунши в пробирки, содержащие 1 мл формамида, и инкубируйте при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение 18 ч.
  7. Центрифугируйте биопсию при 3000 х г в течение 3 мин при RT. Соберите супернатанты с помощью пипетки.
  8. Измерьте OD на длине волны λ = 565 нм в 96-луночных плоскодонных пластинах по заготовке, содержащей формамид. Цвет стабилен в течение 24 ч. Считывание концентрации испытуемых образцов со стандартной кривой (используйте концентрации эвансовского синего цвета в диапазоне от 0,2 до 30 мкг красителя/мл формамида) (рисунок 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины должны быть изготовлены из полипропилена, который имеет более низкую связывающую способность, поэтому белки или ДНК не будут связываться.

7. Сывороточный сбор и измерение антител к иммуноглобулину tNP (IgG1)

  1. После сбора биопсии уха (шаг 4.1), когда мышь еще находится под глубоким наркозом, удаляют глазное яблоко пинцетом, мягко давят на мышь, а также собирают кровь из ретроорбитального синуса в трубку (флакон с гелем для получения сыворотки, см. Таблицу материалов). Альтернативным методом сбора крови может быть прокол сердца шприцем и сбор крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь должна быть собрана после удаления ушей. Один и тот же метод кровотечения должен использоваться во всем исследовании из-за потенциальных различий в параметрах крови18. После этой процедуры мышей необходимо усыпить (например, при вывихе шейки матки).
  2. Инвертировать минимум 6x, подождать 30 мин, пока кровь свернется, а затем центрифугировать при 1,300-2,000 x g в течение 10 мин при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Образец стабилен при −20 °C в течение 6 месяцев.
  3. Покрыть 96-луночную плоскодонную пластину 50 мкл бычьего сывороточного альбумина, конъюгированного с 2,4,6-тринитрофенилом (TNP-BSA), растворенным в DPBS при согласовании 10 мкг/мл. Далее покрывают вторую пластинку только бычьим сывороточным альбумином (BSA), растворенным в DPBS (фон) в концентрации 10 мкг/мл. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка мыши содержит антитела (Abs) против BSA, поэтому образцы должны быть проверены на обеих пластинах, а затем должен быть сделан расчет (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Вымойте пластины с 300 мкл DPBS, содержащим 0,05% анимации 20. Повторите 3x.
  5. Приготовьте разбавитель (AD): DPBS, содержащий 1% BSA. Заблокируйте скважины с АД на 1 ч на РТ. Снова промывайте (шаг 7.4).
  6. Подготовьте внутренний стандарт (iSTD): сенсибилизируйте мышей с помощью TNCB (этапы 3.1.1-3.1.3), а через 10 дней после сенсибилизации соберите и опрашивайте сыворотку у всех доноров (этап 7.1 и шаг 7.2).
  7. Добавьте к пластине 50 мкл градуированных концентраций iSTD, разбавленных AD, для получения стандартной кривой (описанной в таблице 3). Добавьте к пластине 50 мкл образцов сыворотки. Протестируйте каждый образец и стандартную кривую на обеих пластинах (с покрытием TNP-BSA и BSA). Инкубировать в течение 2 ч на RT. Промыть пластины (шаг 7.4).
  8. Добавьте 50 мкл биотинилированного антимышечного моноклонального антитела IgG1 (mAb, см. Таблицу материалов), разведенного 1:250 с AD, и инкубируйте в течение 1 ч при RT. Снова промыть (этап 7.4).
  9. Добавьте 50 мкл хрена пероксидазы стрептавидина (HRD стрептавидин, см. Таблицу материалов), разбавленное 1:2000 с AD, и инкубируйте в течение 30 мин при RT в темноте. Вымойте пластину (шаг 7.4).
  10. Добавьте 50 мкл субстрата TMB (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 30 мин при RT в темноте.
  11. Прекращают ферментативную реакцию добавлением 25 мкл 1 МН2SO4; реакция стабильна в течение 30 мин.
  12. Измерьте OD на длине волны λ = 450 нм и фоне 570 нм (фон должен быть вычтен из каждых 450 нм измерения). При представлении результатов вычтите измерения BSA из TNP-BSA для образцов и стандартной кривой. Затем рассчитайте единицу (U) антител согласно стандартной кривой (рисунок 9).

8. Приемный перенос CHS-эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура показана на рисунке 2.

  1. Доноры (в соотношении один донор:1 реципиент): сенсибилизировать мышей с TNCB в день «0» (шаги 3.1.1-3.1.3).
  2. На день «4» обезболивают мышей – глубокой анестезией (шаг 3.2.2).
  3. Изолируют щипцами подмышечные и паховые лимфатические узлы (ALNs) и селезенку (SPLs). Объедините ALN в одном флаконе и SPL в другом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой подмышечной подмышечной мышце есть один подмышечный лимфатический узел. Один паховый лимфатический узел в области тазобедренного сустава расположен рядом с тремя кровеносными сосудами. Селезенка расположена с левой стороны тела за кишечником и желудком19. Работа со стерильными инструментами в шкафу биобезопасности для поддержания стерильных условий. После этой процедуры мыши должны быть усыплены (например, при вывихе шейки матки).
  4. Размять ткань между матовыми концами двух слайдов микроскопа. Пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр с размером пор 70 мкм (см. Таблицу материалов).
  5. Промывайте клетки DPBS, дополненным 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C. Декантировать супернатант и повторно суспендировать оставшуюся клеточную гранулу в 1-5,0 мл DPBS.
  6. Подсчитайте живые клетки с помощью гемоцитометра20 с трипановым синим, и смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 90-990 мкл (в зависимости от количества клеток) трипанового синего. Учитывайте разбавление при вычислении количества клеток (10х-100х).
  7. Приготовьте смесь ALNs и SPLs (соотношение 1:1): от 8,0 x 106 до 7,0 x 107/мышь в 200 мкл DPBS.
  8. Реципиенты (наивные сингенные мыши): обезболивают наивных мышей-реципиентов (этап 3.2.2) и вводят в/в приготовленную смесь CHS-эффекторных клеток (этап 8.7). В контрольную группу мышей не вводят никаких клеток.
  9. Измерьте толщину уха до (0 ч) и после (24 ч) вызова (этапы 3.2.1-3.2.6) (рисунок 10).
  10. Кроме того, проводят тесты на изолированных CHS-эффекторных клетках (например, фенотипирование клеток или измерение продуцируемых цитокинов CHS-эффекторными клетками с помощью проточной цитометрии). Также могут быть установлены клеточные культуры, а способность CHS-эффекторных клеток к пролиферации в присутствии антигена или количества секретируемых цитокинов в культуре супернатантов может быть оценена21,22 (данные не представлены).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение дополнительных тестов требует соответственно большего количества доноров клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для индукции CHS животных сенсибилизировали с помощью окраски кожи (брюшной полости) 150 мкл 5% TNCB или фиктивной сенсибилизации только с помощью транспортного средства. На день «4» реакции на отек ушей обоих ушей были вызваны контактной покраской (вызов) 10 мкл 0,4% TNCB у обеих мышей, ранее контактировавших с TNCB (тестовая группа), и у мышей контрольной группы (фиктивная сенсибилизированная). Представленные данные показывают, что у мышей, сенсибилизированных tNCB и испытанных через 4 дня, развился значительно увеличенный отек уха по сравнению с фиктивно-сенсибилизированными сенсибилизированными с аналогичными проблемами (рисунок 3, таблица 2, тест против контрольной группы). Результаты отека уха были полностью подтверждены в дальнейших исследованиях, подчеркнув, что увеличение отека уха, определяемое с помощью микрометра, согласуется с увеличением веса уха (рисунок 4), активностью MPO (рисунок 5), концентрацией IFN-γ в ушных экстрактах (рисунок 6), увеличением утолщения отечной дермы при гистологическом исследовании (рисунок 7) и проницаемостью сосудов уха (рисунок 8) ). Увеличение концентрации TNP-специфических антител IgG1 также было обнаружено в сыворотках испытуемых мышей по сравнению с контрольными животными (рисунок 9).

В качестве примера Опосредованного Т-клетками иммунного ответа, CHS также может быть передан наивным сингенным мышам-реципиентам. Доноры были сенсибилизированы применением TNCB, и впоследствии CHS-эффекторные клетки вводили в/в в наивных мышах-реципиентах, которым бросали вызов с помощью гаптена и тестировали на CHS через 24 ч (рисунок 10). Животные, которые получали CHS-эффекторные клетки от доноров, ранее сенсибилизированных TNCB, показали значительно увеличенный отек уха по сравнению с животными, которые были только поражены (не получили никаких клеток).

Реакция CHS имеет сложный механизм и включает в себя различные клетки. Презентация антигена и активация Т/В-клеток происходят в периферических лимфатических органах (например, ALNs и SPL). Было установлено, что CHS-эффекторные клетки, истощенные CD4+, но не CD8+ клетками до переноса приемных клеток, приводили к отсутствию реакции CHS у мышей-реципиентов. Было обнаружено, что эти клетки являются положительными для IFN-γ (фактор транскрипции T-box TBX21, Tbet+) и IL-17A (связанный с рецептором ретиноевой кислоты орфанный ядерный рецептор гамма, RORγT+) (дополнительный рисунок 1).

Представленные результаты репрезентативных экспериментов проводили на C57BL/6 и CBA/J самцах и самках мышей в возрасте 8-12 недель. Следуя правилам 3R в использовании животных23, особенно редукционных, для целей настоящей статьи показаны результаты экспериментов на небольших группах животных. Данные на графиках показаны как среднее ± SEM. Статистическая значимость была установлена на уровне p < 0,05. Графики были нарисованы с помощью программного обеспечения Prism (см. Таблицу материалов).

Figure 1
Рисунок 1: Индукция CHS. Сенсибилизация, вызов и измерение уха. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Приемный перенос CHS-эффекторных клеток. Сокращения: ALNs = подмышечные и паховые лимфатические узлы; CHS = реакция контактной гиперчувствительности; i.v. = внутривенно; SPL = селезенка; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативная оценка CHS для TNCB путем измерения отека уха микрометром. Мышей сенсибилизировали tNCB (тестовая группа) или фиктивную (контрольная группа) и впоследствии оспаривали. Толщина ушной раковины была измерена до и после вызова, а различия в отеке уха были рассчитаны путем вычитания толщины уха 0 ч (мкм) из толщины уха 24 ч (мкм). Отек уха выражался как среднее ± SEM, ****p < 0,0001, n = 10 мышей на группу (данные из таблицы 2). Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Репрезентативная оценка CHS путем измерения веса уха. Вес уха является одним из параметров, который соответствует отеку уха. Мышей сенсибилизировали tNCB (тестовая группа) или фиктивную (контрольная группа) и впоследствии оспаривали. Через 24 ч после вызова из удаленных ушей были взяты удары диаметром 6 мм. Удары взвешивались на аналитических лабораторных весах. Вес уха выражали в миллиграммах (мг) как среднее ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 мышей на группу. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативная оценка деятельности МПО. Повышенная активность MPO в тканевых экстрактах коррелирует с воспалением уха. Мышам, сенсибилизированным tNCB (тестовая группа) и фиктивно-сенсибилизированным мышам (контрольная группа), был брошен вызов. Через 24 часа после вызова уши были удалены, а удары уха диаметром 6 мм были извлечены и обработаны. Активность МПО выражается в U на содержание белка (U/г белка). Результаты отображаются как среднее ± SEM, **p < 0,01, n = 5-6 мышей / группа. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; МПО = миелопероксидаза; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол; U = единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативная оценка концентрации продукции цитокинов IFN-γ в ушных экстрактах. Мышей сенсибилизировали tNCB (тестовая группа) или фиктивную (контрольная группа) и впоследствии оспаривали. Через 24 часа после вызова уши были удалены, и были сделаны удары уха диаметром 6 мм. Концентрацию ИФН-γ определяли в тканевых гомогенатах методом ИФА. Результаты показаны как среднее ± SEM, *p < 0,05, n = 5 мышей на группу. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; IFN-γ = интерферон гамма; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Репрезентативная гистология ткани уха. Окрашивание гематоксилином и эозином. Мышей сенсибилизировали tNCB (тестовая группа) или фиктивную (контрольная группа) и впоследствии оспаривали. (А-С) Гистологическое исследование в исследуемой группе проявлялось в значительно повышенной концентрации воспалительных клеток (мононуклеарных и полиморфноядерных клеток), преимущественно в дерме, с образованием микроабцессов в эпидермисе. Также было замечено утолщение отечной дермы и утолщенный, гиперпластический эпидермис. (Д-Е) Контрольная группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Репрезентативный тест на проницаемость сосудов. Наблюдаемый отек ткани уха является результатом повышенной проницаемости сосудов. Чтобы определить изменения проницаемости сосудов, мышей сенсибилизировали TNCB (тестовая группа) или фиктивную (контрольная группа), а затем бросили вызов через 4 дня. Через 23 ч после вызова Эвансу ввели синюю инъекцию, а через 1 ч после синей инъекции Эванса животных усыпили, и были сделаны удары по уху диаметром 6 мм. Результаты показаны как среднее ± SEM, **p < 0,01, n = 5 мышей на группу. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Репрезентативное измерение антител tNP IgG1. Концентрацию антител против TNP IgG1 в сыворотке крови измеряли через 24 ч после испытания гаптеном TNCB у фиктивных сенсибилизированных (контроль) и у TNCB-сенсибилизированных (тестовая группа) мышей. Собранные сыворотки были протестированы на концентрацию антител с помощью ИФА. Результаты показаны как среднее ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 мышей на группу. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; IgG1 = иммуноглобулин G подкласса 1; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 10
Рисунок 10: Репрезентативный приемный перенос CHS-эффекторных клеток. CHS-эффекторные клетки были получены от доноров, которые были сенсибилизированы TNCB. Затем собранные иммунные клетки вводили, в т.в., наивным сингенным реципиентам, которым бросали вызов для выявления эффекторной фазы CHS. Контрольная группа мышей не получала никаких клеток до вызова. Толщина ушной раковины измерялась до и после вызова. Результаты показаны как среднее ± SEM, ***p < 0,001, n = 7 мышей на группу. Сокращения: CHS = реакция контактной гиперчувствительности; SEM = стандартная погрешность среднего значения; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Штамм мыши Сенсибилизирующий раствор (доза)
на бритом животе		 Элицитирующий раствор (доза)
с обеих сторон уха/ов		 День сенсибилизации / выявления Ссылки
БАЛБ/с (Н-2д); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (фон H-2u )		 25 мкл 0,5 % DNFB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 5 мкл 0,1 % DNFB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 мкл 0,5 % DNFB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 25 мкл 0,2 % DNFB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); Ил-17А-/- (C57BL/6 фон) 150 мкл 5% TNCB в смеси ацетон-этанол (соотношение 1:3) 10 мкл 0,4 % TNCB в смеси оливкового масла и ацетона (соотношение 1:1) 0 / 4 33
АЗВ/Дж (Н-2к); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/6 фон)		 150 мкл 5 % TNP-Cl (TNCB) в смеси ацетон-этанол (соотношение 1:3) 10 мкл 0,4 % TNP-Cl (TNCB) в смеси оливкового масла и ацетона (соотношение 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); БАЛБ/с (Н-2г) 25 мкл 1 % TNCB в ацетоне 10 мкл 0,1 или 0,2 % TNCB в ацетоне (и выше до 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); ТЛР2-/-/ ТЛР4-/-
(мыши с двойным нокаутом на фоне C57BL/6)		 100 мкл 3 % TNCB в ацетоне 20 мкл 1 % TNCB в ацетоне (только на задней стороне ушей) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
Мыши с дефицитом MHC класса II (фон C57BL/6)		 100 мкл 3 % TNCB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 20 мкл 0,5 или 1 % TNCB в смеси ацетона и оливкового масла (соотношение 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 мкл 7 % TNCB в ацетоне 20 мкл 1 % TNCB в ацетоне 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 мкл 3 % OX в этаноле 20 мкл 1 % OX в этаноле 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 фон) 25 мкл 0,5 % DNFB в ацетон-оливковом масле (соотношение 4:1) 10 мкл 0,2 % DNFB в ацетон-оливковом масле (соотношение 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 фон) 150 мкл 3 % OX в спирте-ацетоне (соотношение 3:1) 10 мкл 1% OX в спирте-ацетоне (соотношение 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (фон C3H/HeJ); MyD88-/- (фон C57BL/6) 100 мг/ухо 10%NiCl2 в белом вазелине на спинной стороне обоих ушей 10 % NiCl2 в белом вазелине 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (фон NOD) 400 мкл 0,5 % FITC в ацетоне и дибутилфталате 10 мкл 0,1 % FITC в ацетоне и дибутилфталате 0 / 5 25

Таблица 1: Сравнение модели CHS в различных исследованиях. Сокращения: DNFB = 1-фтор-2,4-динитробензол; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; NiCl2 = хлорид никеля (II); TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол; TNP-Cl = тринитрофенилхлорид; OX = оксазолон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Контрольная группа (отрицательная) Испытательная группа (реакция CHS)
Мышь # ухо: L, R Толщина уха 0 ч [мкм] Толщина уха 24 ч [мкм] 24 ч – 0 ч толщина уха [мкм] Мышь # ухо: L, R Толщина уха 0 ч [мкм] Толщина уха 24 ч [мкм] 24 ч – 0 ч толщина уха [мкм]
1 л 365 380 15 1 л 345 427.5 82.5
1 Р 335 380 45 1 Р 340 455 115
2 л 345 355 10 2 л 355 475 120
2 Р 327.5 352.5 25 2 Р 342.5 457.5 115
3 л 340 370 30 3 л 340 460 120
3 Р 325 355 30 3 Р 345 495 150
4 л 335 380 45 4 л 357.5 432.5 75
4 Р 340 350 10 4 Р 335 402.5 67.5
5 л 350 380 30 5 л 335 387.5 52.5
5 Р 337.5 360 22.5 5 Р 335 425 90
6 л 335 365 30 6 л 350 430 80
6 Р 340 375 35 6 Р 342.5 405 62.5
7 л 345 337.5 0 7 л 340 502.5 162.5
7 Р 345 335 0 7 Р 327.5 447.5 120
8 л 370 380 10 8 л 327.5 515 187.5
8 Р 375 355 0 8 Р 327.5 540 212.5
9 л 385 370 0 9 л 330 415 85
9 Р 342.5 362.5 20 9 Р 327.5 390 62.5
10 л 307.5 340 32.5 10 л 337.5 445 107.5
10 Р 325 350 25 10 Р 352.5 455 102.5
Значить 20.75 Значить 108.5
± СЭМ 3.245 ± СЭМ 9.565

Таблица 2: Репрезентативный пример расчета разницы в толщине уха в эффекторной фазе CHS. Расчет разницы в толщине ушной раковины до и после вызова с гаптеном: 24 ч толщина уха (мкм) - 0 ч толщина уха (мкм). Каждое ухо считается отдельным измерением. Отек уха выражается в микрометрах (мкм) ± SEM, n=20. Сокращения: L = слева; R = справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Разбавление iSTD с AD анти-TNP IgG1 Ab (U/mL)
в 100 раз 250
в 200х 125
в 400 раз 62.5
в 800х 31.25
в 1600х 15.63
в 3200х 7.8
только AD 0

Таблица 3: Подготовка различных концентраций iSTD для стандартной кривой измерения анти-TNP IgG1 Ab. Предполагалось, что 100-кратное разведение iSTD составляет 250 ЕД анти-TNP IgG1 Ab. Сокращения: Ab = антитело; AD = разбавитель анализа; iSTD = внутренний стандарт; IgG1 = иммуноглобулин G подкласса 1; TNP = 2,4,6-тринитрофенил; U = единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Фенотип CHS-эффекторных клеток. CHS-эффекторные клетки были получены из ALN и SPL доноров, которые ранее были сенсибилизированы TNCB. (A) Используя технику MACS, CHS-эффекторные клетки (целые ALN и SPL) были истощены либо CD4+, либо CD8+ клетками. Впоследствии перенос адоптивных клеток проводился до возникновения эффекторной фазы CHS. ± При использовании метода проточной цитометрии CHS-эффекторные и наивные (полученные от наивных мышей) клетки окрашивали для IFN-γ, Tbet, IL-17A и RORγt перед анализом. Клетки были закрыты для популяции TCRβ + CD4 + . Результаты показаны как среднее ± SEM, ***p < 0,001, **p < 0,01, * p < 0,05, n = 4-6 мышей на группу. Сокращения: ALNs = подмышечные и паховые лимфатические узлы; CD4 = кластер дифференциации 4; CHS = реакция контактной гиперчувствительности; IFN-γ = интерферон гамма; IL = интерлейкин; MACS = магнитно-активированная сортировка ячеек; ns = незначимый; RORγt = гамма-рецептор, связанный с рецепторами ретиноевой кислоты; SEM = стандартная погрешность среднего значения; SPL = селезенка; Tbet = фактор транскрипции T-box TBX21; TCRβ = бета-рецептор Т-клеток; TNCB = 2,4,6-тринитрохлорбензол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CHS индуцируется через гаптены, которые связываются с собственными белковыми антигенами в коже, создавая неоантигены. CHS опосредован локальным внесосудистым рекрутированием циркулирующих антиген-специфических CHS-эффекторных Т-клеток, что приводит к отеку в проблемной ткани, достигающему пика через 24 ч после воздействия на вторичную кожу того же гаптена6. Отек ткани в основном вызван инфильтрацией лейкоцитов и лейкоцитарно-зависимым отложением фибрина24. Эти изменения могут быть обнаружены с помощью микрометра, измеряющего отек у гаптен-сенсибилизированных и оспариваемых по сравнению с фиктивно-сенсибилизированными и проблемными мышами.

CHS также может быть определен путем сравнения веса уха. Затем ушные перфораторы, используемые для определения веса уха, могут быть использованы для дальнейших испытаний. Клеточные инфильтраты в воспаленных ушах состоят из цитокин-продуцирующих Т-лимфоцитов и МПО-положительных нейтрофилов. В гомогенатах ткани уха могут быть измерены различные параметры, такие как активность MPO или концентрация провоспалительных цитокинов (например, TNF-α, IFN-γ, IL-17A или другие) с использованием ИФА-теста или экспрессии цитокиновой мРНК в коже с использованием теста qPCR25. Кроме того, изменения проницаемости сосудов могут быть оценены с помощью синего теста Эванса21,26.

В воспаленной ткани уха наблюдаемые изменения также могут быть дополнены тестами in vitro, подчеркивающими пролиферацию Т-клеток и выработку цитокинов. Это может быть легко достигнуто путем культивирования ALN в присутствии гаптен-конъюгированных белковых антигенов22,27. Оценка секреции цитокинов ALN, выделенными у сенсибилизированных, но не оспариваемых мышей, дает подробную информацию о производстве цитокинов CHS-эффекторными клетками в месте их индукции.

Ограничения
Многие микрометры измеряют отек ушей с разной точностью. Например, самое низкое давление оказывает пружинный суппорт, поэтому кажется, что результаты лучше всего отражают фактическое измерение толщины уха. Однако микрометры, которые оказывают большее давление, такие как Mitutoyo, вероятно, будут более плотно сжимать жидкость, которая накапливается в ушах на ранней стадии образования отеков. Двухфазная природа CHS может быть визуализирована более четко с помощью таких микрометров, потому что оказывается большее давление. Это сложнее при использовании пружинного суппорта с легким давлением28. Тем не менее, в некоторых исследованиях толщину ушей измеряли с помощью суппорта29. Кроме того, опыт наблюдателя обеспечивает точные измерения, на которые могут влиять субъективные ощущения, даже если наблюдатель не знает об экспериментальных группах.

Здесь были описаны альтернативные методы, которые могут помочь подтвердить измерения отека уха микрометром, что делает представленные данные более надежными и менее субъективными. Однако эти альтернативные стратегии оценки CHS могут быть использованы только в один момент времени. Микрометрические измерения могут повторяться в различные моменты времени, что позволяет изучать кинетику CHS.

Изменения
Протокол изучения реакции CHS, который мы используем в нашей лаборатории, значительно отличается от тех, которые используются в других лабораториях, включая дозу гаптена и состав растворителя, используемый как для выявления, так и для сенсибилизации, а также момент времени, в который оценивается реакция. Толщина уха может быть измерена в различные моменты времени (например, 2 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч после вызова)10,30. В таблице 1 показаны различные экспериментальные модели, в частности различия в штамме животных, гаптене и времени сенсибилизации/вызова, используемых в различных исследованиях 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . Протокол CHS также может проводиться без предварительного бритья брюшной полости мышей.

Следующее различие касается выполнения самого выявления (вызова). Как обычно, сенсибилизация выполняется путем окрашивания кожи живота бритых мышей только гаптеном или транспортным средством. Впоследствии, в обеих группах, одно ухо оспаривается с разбавленным гаптеном на каждой стороне уха. В качестве контроля противоположное ухо окрашено одинаковым количеством одного только транспортного средства10,31.

Критические шаги
Наиболее критическим моментом является срабатывание CHS, так как от этого зависят результаты испытаний. (1) Раствор гаптена очень летучий и светочувствительный, поэтому он должен быть плотно закрыт и защищен от света, а при использовании его необходимо быстро наносить на кожу животных, чтобы он не испарялся. (2) После нанесения гаптена на кожу брюшка его необходимо высушить до того, как животное вернется в клетку, потому что мыши могут размазывать его по подстилке или прикладывать лапами к ушам (тогда измерение толщины ушной раковины может быть недостаточным). (3) Также известны различные методы маркировки животных, такие как маркировка хвостов мыши маркером, устойчивым к растворителям. Тем не менее, красители, присутствующие в маркере, могут (не изучены) стать гаптеном и вызвать CHS. Поэтому в данном исследовании был выбран метод маркировки, который не влияет на реакцию. (4) Выбор метода бритья очень важен, так как он может раздражать кожу. В этом протоколе использовалось серое мыло, поскольку оно обладает успокаивающими свойствами; ускоряет лечение незначительных порезов и гнойных ран, чему способствует его антибактериальное действие. Успокаивает отечность и воспаление кожи.

Дальнейшие исследования и стандартизация экспериментальных процедур, включая использование животных (штамм и пол), необходимы для сравнения результатов различных исследований.

Множество различных факторов окружающей среды и новых веществ с биологическими функциями могут быть протестированы в модели CHS. Эта модель может быть полезна, если исследователи хотят показать, модулируют ли тестируемые факторы зависящие от Т-клеток иммунные реакции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано субвенцией SUBZ. A020.22.060 Медицинского университета во Вроцлаве, Польша, и по грантам Министерства науки и высшего образования N N401 545940 для MS и IP2012 0443 72 для MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 187 мышиная модель аллергический контактный дерматит (ACD) контактная гиперчувствительность (CHS) отек уха проницаемость сосудов миелопероксидаза (MPO) цитокины 2,4,6-тринитрохлорбензол (TNCB) гаптен

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Контактная гиперчувствительность как мышиная модель аллергического контактного дерматита
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter