Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En metode til at studere sammenhængen mellem lokal kollagenstruktur og mekaniske egenskaber af aterosklerotisk plaque-fibrøst væv

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64334
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 4, 1,3, 1,2, 1,3
1Department of Biomedical Engineering, Erasmus Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology, 3Department of Biomechanical Engineering, Delft University of Technology, 4Erasmus Optical Imaging Center, Erasmus Medical Center

Summary

Vi har udviklet en mekano-billeddannelse pipeline til at studere de heterogene strukturelle og mekaniske aterosklerotiske plaque egenskaber. Denne rørledning muliggør korrelation af den lokale fremherskende vinkel og spredning af kollagenfiberorientering, brudadfærden og belastningsfingeraftrykkene af det fibrøse plakvæv.

Abstract

Brud på aterosklerotiske plaques i koronar- og halspulsårer er den primære årsag til dødelige kardiovaskulære hændelser. Imidlertid er brudmekanikken i det heterogene, stærkt kollagenøse plakvæv, og hvordan dette er relateret til vævets fibrøse struktur, endnu ikke kendt. Eksisterende rørledninger til undersøgelse af plakmekanik er begrænset til kun at opnå grove mekaniske egenskaber ved plakvævet baseret på antagelsen om vævets strukturelle homogenitet. Imidlertid er fibrøst plakvæv strukturelt heterogent, uden tvivl hovedsageligt på grund af lokal variation i kollagenfiberarkitekturen.

Den mekano-billeddannende rørledning, der er beskrevet her, er udviklet til at studere de heterogene strukturelle og mekaniske plakegenskaber. I denne pipeline karakteriseres vævets lokale kollagenarkitektur ved hjælp af multifotonmikroskopi (MPM) med anden harmonisk generation (SHG), og vævets svigtadfærd karakteriseres under uniaxiale træktestbetingelser ved hjælp af digital billedkorrelation (DIC) analyse. Denne eksperimentelle pipeline muliggør korrelation af den lokale fremherskende vinkel og spredning af kollagenfiberorientering, brudadfærden og stammefingeraftrykkene af det fibrøse plakvæv. Den opnåede viden er nøglen til bedre at forstå, forudsige og forhindre aterosklerotiske plaque rupture begivenheder.

Introduction

Iskæmisk slagtilfælde, ofte udløst af aterosklerotisk plaquebrud i halspulsårerne, er en af de førende årsager til dødelighed og sygelighed på verdensplan1. Imidlertid inkluderer de nuværende kirurgiske behandlingsplanlægningsstrategier til forebyggelse af carotis aterosklerose-relateret slagtilfælde ikke risikovurdering af plaquebrud2. Dette skyldes hovedsageligt, at de tidligere foreslåede risikobiomarkører, såsom plaque cap tykkelse3 og lipidkernestørrelse4, har vist sig at have suboptimal prædiktiv værdi for fremtidige kliniske hændelser 5,6. En bedre forståelse af plakmekanik og brudmekanismer er nødvendig for at optimere risikovurdering af plakbrud og identificere nye risikomarkører for aterosklerotiske plaques.

Plakbrud er en lokal mekanisk begivenhed, hvor det meget fibrøse plakvæv ikke modstår den mekaniske belastning, der udøves på det af blodtrykket og mister sin strukturelle integritet7. På trods afdette forstås mekanikken i plaquebrudsbegivenheden og dens forbindelse til den underliggende mikrostruktur dårligt 8. De få eksperimentelle undersøgelser, der karakteriserede plakvævssvigt, indeholder 9,10,11,12,13 rapporterede grove mekaniske brudegenskaber (dvs. ultimativ træksvigtsbelastning og styrke), afledt med antagelsen om vævets strukturelle homogenitet. Imidlertid er det fibrøse plakvæv strukturelt heterogent, uden tvivl hovedsageligt på grund af lokal variation i kollagenfiberarkitekturen14. Desuden blev forbindelsen mellem plaquevævets mekaniske svigtegenskaber og kollagenarkitekturen kun undersøgt i en nylig undersøgelse af Johnston et al. Forfatterne viste en interplaqueforskel i den dominerende fiberorientering og rapporterede højere ultimative spændinger og lavere ultimative stammer for fibrøse plaquehætteprøver med en overvejende omkredsfiberorientering15. Undersøgelsen var dog også begrænset til bruttomekaniske og strukturelle egenskaber.

For at kaste lys over de væsentlige oplysninger om den lokale kollagenarkitektur og lokale mekaniske egenskaber af det fibrøse plakvæv har vi i den aktuelle undersøgelse udviklet en mekano-billeddannelsesrørledning. Denne ex vivo-rørledning muliggør kvantificering af den lokale kollagenfiberretning og dispersion samt lokal brudstamme. Rørledningen involverer MPM-billeddannelse med SHG til afbildning af kollagenfibre i plakvævet samt DIC- og uniaxial trækprøvning for at kvantificere vævets brudegenskaber.

Multifotonmikroskopi-anden-harmonisk generation (MPM-SHG) er blevet en populær teknik til at studere kollagen i biologiske væv16. Teknikken har mange fordele sammenlignet med andre kollagenbilleddannelsesteknikker, såsom histologi17, diffusionstensorbilleddannelse (DTI)14 og småvinkellysspredning (SALS)15. For det første er MPM-SHG-billeddannelse ikke-destruktiv, hvilket gør den ideel at kombinere med mekanisk test18. For det andet er SHG-signalet specifikt for kollagen, og derfor er ingen farvning af vævet nødvendig. På grund af de lange excitationsbølgelængder (nær-infrarød) er penetrationsdybden større end med andre mikroskopiteknikker16. Den høje opløsning (μm-niveau), der opnås med SHG-billeddannelse, tillader også visualisering af individuelle fibre. Dette giver mange muligheder, såsom lokal kvantificering af antallet af kollagenfibre, kollagenfiberorientering og distribution19.

Digital billedkorrelation (DIC) kombineret med mekanisk test er en meget anvendt metode til at opnå lokale mekaniske egenskaber af biologisk væv20. Med DIC spores forskydningen af pletter, der påføres vævsoverfladen, ved at sammenligne højhastighedskamerabilleder erhvervet under mekanisk test20. Denne billedefterbehandlingsmetode bruges til at estimere fuldfeltoverfladestammerne afprøven 20 og kan også bruges til at studere vævets brudadfærd21.

Protocol

Alle metoder beskrevet i dette papir blev godkendt af det etiske forskningsudvalg ved Erasmus Medical Center i Rotterdam; Der blev indhentet informeret samtykke fra patienter før indsamling af plakprøver. Et workflowdiagram over protokollen er vist i figur 1.

1. Vævsindsamling, mikrocomputertomografi (μCT) billeddannelse og forberedelse af testprøver

  1. Opsamling og opbevaring af væv
    1. Indsaml friske humane carotis aterosklerotiske plaque prøver fra samtykkende patienter, der gennemgik carotis endarterektomi kirurgi.
      BEMÆRK: De plakprøver, der er hentet fra denne operation, består af det syge intimalag i halspulsåren, herunder ophobning af fedt (lipidpuljen) og forkalkninger22.
    2. Fjern blodrester ved hjælp af fosfatbufret saltvand (1x PBS) og tør prøven med en gasbind.
    3. Anbring prøven i et 15 ml rør ved hjælp af pincet. Snap-frys vævet ved at placere røret i flydende nitrogen i 10 min.
    4. Efter trykfrysning opbevares prøven i en fryser til -80 °C indtil dagen for μCT-billeddannelsen.
      BEMÆRK: Snapfrysning minimerer krystaldannelse, hvilket fører til mikrostrukturelle skader i vævet. En tidligere undersøgelse af aortavæv fra svin har vist, at snapfrysning og opbevaring ved -80 °C ikke havde nogen signifikant indflydelse på vævets mekaniske egenskaber23.
  2. μCT-billeddannelse
    1. På dagen for μCT-billeddannelse skal du tage plakprøven ud af 15 ml røret. Hvis vævet klæber til røret, skal du fylde røret med PBS ved stuetemperatur. Lad vævet stå i PBS, indtil prøven kan tages ud af røret.
    2. Tør plakprøven grundigt med silkepapir.
    3. Tænd μCT-systemet ved at trykke på den grønne knap. Tryk på varmen i CT-softwaren nederst på skærmen, og vent 15 min.
    4. Anbring manuelt et røntgenfilter på Cu 0,06 mm + Al 0,5 mm i μCT-systemet.
    5. Vælg den mappe, hvor billederne skal gemmes.
    6. Vælg parametrene i venstre panel. Brug rullelisterne til at vælge en scanningstid på 4 min, en opløsning på 172 μm, en spænding på 90 kV, en strømstyrke på 88 mA, et synsfelt på 86 mm og en rotation på 360°.
    7. Åbn enhedens dør. Træk platformen ud manuelt.
    8. Sæt parafilm på platformen, og placer prøven på platformen (mod den yderste del af platformen).
    9. Placer platformen manuelt i enheden, og luk døren.
    10. Aktivér live-tilstand (øjeikon ). Flyt platformen med pilene i enheden for at centrere prøven i synsfeltet.
    11. Start billedbehandling (ikon nederst i midten). Når billeddannelsen er færdig, skal du trykke på dørikonet nederst (under afbryderknappen ).
    12. Efter μCT-scanningen snapfryses plakprøven igen som beskrevet i trin 1.1.3. Opbevar det ved -80 °C indtil dagen for multifotonmikroskopi, billeddannelse og mekanisk testning.
    13. Åbn de erhvervede DICOM-filer fra μCT-billeddannelsen i open source 3D Slicer-softwaren24.
    14. Gå til Segmenteditor . Vælg Opret en ny segmentering | den diskenhed, der skal analyseres som en masterdiskenhed.
    15. Klik på Tilføj for at tilføje et segment. Tryk på navn og farve for at ændre disse parametre.
    16. For at definere segmenterne skal du klikke på effekter | tærskel i nederste del af vinduet. Brug dette tærskelværktøj til at skelne mellem forkalkede (>450 HU) og ikke-forkalkede (<450 HU) vævsområder. Når tærsklen er valgt, skal du trykke på Anvend i den nederste del.
    17. Tryk på Vis 3D (lige til højre for Tilføj) for at visualisere segmenteringen i 3D-visningen. Hvis der er områder af segmenteringen, der ikke ønskes, skal du fjerne dem med sakseffekten.
    18. Skift opaciteten af segmenter i segmenteringsmodulet ved at klikke på navnet på den ønskede segmentering.
      BEMÆRK: Hvis det er muligt, kan μCT-billeddannelse og gennemgang af μCT-billederne udføres samme dag som resten af protokollen. I så fald skal du springe trin 1.2.12 over. Vær dog opmærksom på, at de efterfølgende trin i denne protokol også er tidskrævende og skal udføres samme dag. Efter lidt øvelse og med de beskrevne indstillinger og væv skal μCT-billeddannelse tage ~ 45 minutter, gennemgang af μCT-billederne ~ 15 minutter, testprøveforberedelse af en enkelt testprøve ~ 1 time, mikroskopi ~ 4 timer og uniaxial trækprøvning ~ 2 timer.
  3. Forberedelse af testprøve
    1. På dagen for kollagenbilleddannelse og mekanisk test optøes plakken ved nedsænkning i PBS ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.
    2. Åbn 3D-konstruktionen af den plak, der blev oprettet i trin 1.2.13-1.2.18, i 3D-udsnitssoftwaren.
    3. Brug plakvævets naturlige vartegn til at identificere, hvilke dele af 3D-rekonstruktionen der svarer til den rigtige plakprøve. Identificer hvilket område af 3D-rekonstruktionen der ikke indeholder forkalkninger og identificer visuelt dette område i den rigtige plak.
    4. Skær pladen åben langs arteriens længdeakse ved hjælp af kirurgisk saks og pincet. Hvis der allerede er et snit fra operationen, skal du starte fra dette snit for optimal brug af vævet. Hvis prøven ikke har en rørformet form, og det er vanskeligt at definere længderetningen, skal prøven udelukkes fra testning.
    5. Klip rektangulære testprøver ud af plakprøverne. Sørg for, at testprøverne er så store som muligt, samtidig med at du undgår vævsområder, der indeholder tårer eller forkalkninger. Vær forsigtig under denne skæring, da en lille revne eller revne i kanten af testprøven kan resultere i revneudbredelse fra den eksisterende revne under trækprøvning.
    6. Sørg for, at testprøverne har et bredde-til-længde (WL) forhold på <1 i målerlængden, når de er monteret i træktesteren. Hvis prøverne opfylder dette krav, er de egnede til passende trækprøvning med hensyn til grænsebetingelser25.
      BEMÆRK: Området i prøvedimensionerne kan være stort. De prøver, som forfatterne testede, havde en målerlængde, der varierede mellem 3,4 og 12,9 mm og en bredde, der varierede mellem 1,6 og 6,4 mm.

2. Multifotonmikroskopi billeddannelse

  1. Præparater
    1. Før dagen for kollagenbilleddannelse og mekanisk test divideres 40 g af en silikoneelastomerbase over to 50 ml rør og tilsættes 2 g hærdningsmiddel til hvert rør (forhold 1:10) ved hjælp af en Pasteur-pipør. Bland de to komponenter med pipetten.
    2. Centrifuger glassene i 1 min ved 700 × g for at fjerne så mange luftbobler som muligt.
    3. Fyld et petrifad (10 cm i diameter) med et tyndt lag silicium (ca. 0,5-1 cm) og inkuber det enten i ovnen ved 65 °C i 3 timer eller anbring det ved stuetemperatur i 48 timer.
    4. Tag en plaktestprøve og fastgør begge dens ender til silicium ved at fastgøre nåle i vævet (figur 2A). Sørg for, at prøvens luminalside vender opad. Indsæt nålene i det område af prøven, der vil være i klemmerne på trækprøvningsenheden under den mekaniske test.
    5. Tag sikkerhedsbriller på. Brug en sideskærer til at forkorte nålene, så de stikker ud mindre end et par millimeter over prøveoverfladen for at forhindre dem i at beskadige mikroskopmålet. Fyld petriskålen med PBS, indtil prøven er nedsænket.
  2. Mikroskopi opsætning
    1. Sørg for, at et korrekt mål er monteret på multifotonmikroskopet. Brug et mål, der er optimeret til at transmittere infrarødt lys med en forstørrelse på 20x.
    2. Start mikroskopsystemet. Åbn mikroskopets operativsystem.
    3. Når du bliver bedt om at initialisere billeddannelsestabellen, skal du sørge for, at mikroskopkondensatorarmen skubbes tilbage, og at målet er i den laveste position.
    4. Aktivér multifotonlaseren.
    5. Petriskålen med analyseprøven anbringes under målet, jf. figur 3. Sørg for ikke at placere målet over prøven endnu, da laserindstillingerne stadig skal optimeres. Ellers kan laserlysets mulige høje effekt føre til beskadigelse af vævet.
    6. Sørg for, at målet er lidt nedsænket i PBS. Brug en pipet til at tilføje ekstra PBS, hvis det er nødvendigt.
    7. Indstil lysbølgelængden til 880 nm.
      BEMÆRK: Denne bølgelængde er valgt, fordi SHG-emissionsfilteret i det anvendte to-fotonsystem har en centerbølgelængde på ca. 440 nm. For andre mikroskoper kan en anden bølgelængde være mere anvendelig.
  3. Feltscanning og valg af billedbehandlingssteder
    1. Sluk for multifotonlaseren, og aktiver mikroskopets brightfield-tilstand . Tænd derefter live scan-tilstanden .
    2. Placer scenen således, at målet er placeret over prøven, og bring prøveoverfladen i fokus. Sluk for live scanningstilstand .
    3. Under fanen erhvervelse i det andet panel skal du ændre zoomfaktoren til 1 ved at skubbe den tilsigtede bjælke.
      BEMÆRK: Denne zoomfaktor bestemmer sammen med forstørrelsesfaktoren for målet (20x) størrelsen på det optagne billede (739 μm x 739 μm).
    4. Under fanen anskaffelse i det andet panel skal du ændre scanningshastigheden til 400 Hz, linjegennemsnittet til 1 og opløsningen til 128 x 128 pixels pr. billede (pixelstørrelse på ~5,8 μm x 5,8 μm) ved hjælp af rullelisterne.
    5. Under fanen anskaffelse i det første panel skal du klikke på rastermønstersymbolet og vente på, at et flisescanningspanel vises.
    6. Tænd for live scan-tilstand . Flyt målet til et hjørne af eksemplet ved hjælp af knapperne på smartpanelet, og klik på symbolet for markeringsposition i panelet til scanning af fliser. Gentag dette for hvert hjørne af prøven. Hvis det udføres korrekt, vises et gitter med alle valgte fliser til billedbehandling i orange.
    7. Slå funktionen til automatisk syning fra.
    8. Klik på start i nederste højre hjørne af skærmen for at oprette en feltscanning af hele prøveoverfladen for at få et overblik over prøvegeometrien.
      BEMÆRK: Baseret på de beskrevne indstillinger, væv og mikroskopsystem tager det ~ 10 minutter at erhverve en flisescanning af hele prøveoverfladen.
    9. Efter flisescanningen skal du observere x- og y-koordinaterne i øverste venstre hjørne af hver flise i flisescanningspanelet, der vises automatisk af mikroskopisystemets software. Notér disse koordinater i et regneark.
    10. I mikroskopsoftwaren skal du i flisescanningspanelet observere antallet af fliser i x- og y-retningerne i boksen kaldet scanfield. Bemærk størrelsen på feltscanningen i regnearket. Beregn koordinaterne for de andre fliser ved at addere/trække flisens størrelse (739 μm).
      BEMÆRK: Disse koordinater er nødvendige for at identificere den nøjagtige placering af de fliser, der skal scannes med SHG-billeddannelse. Hvis den samlede billedbehandlingstid ikke er et problem, kan alle felter afbildes uden at springe nogen fliser over.
    11. Fra flisescanningen skal du vælge de fliser, der skal afbildes med SHG-billeddannelse. Ved dette valg skal du undgå fliser, der vil være i klemmerne, og efterlade en flise mellem hver markeret flise i både længde- og omkredsretningen, som vist i figur 2B.
  4. Visualisering af kollagen: SHG-billeddannelse
    1. Sluk lyset i rummet og dæk mikroskoptrinnet med mørklægningsstof, også at intet lys fra rummet når detektoren.
      BEMÆRK: Minimering af lys, der når detektorerne, reducerer støjen under billedoptagelse.
    2. Tænd multifotonlaseren (MP).
    3. Vælg den ikke-scannede detekteringsdetektor (NDD), der er udstyret med et 430-450 nm båndpasfilter.
    4. Identificer placeringen af de fliser, der skal afbildes, ved hjælp af de oplysninger, der er hentet i trin 2.3.10. Udfyld koordinaterne i de angivne felter, og klik på Enter, så målsætningen flyttes til højre felt. Tænd for live scan-tilstand.
      BEMÆRK: Med andre mikroskoper eller nyere versioner af operativsystemet kan flytning til placeringer inden for flisescanningen udføres automatisk. I dette tilfælde er det ikke nødvendigt at notere x- og y-koordinaterne for hver flise (trin 2.3.10) og udfylde koordinaterne i operativsystemet (trin 2.4.4).
    5. Forøg MP-lasereffekten ved at bruge skyderen i det øverste panel under strålebaneindstillinger for at få den højest mulige lasereffekt uden væsentlig blegning. Juster derefter detektorforstærkningen for at få lyse billeder, men uden mættede pixels, ved hjælp af knappen på smartpanelet eller ved at klikke på navnet på detektoren under strålebaneindstillinger | yderligere kanaler. Typiske værdier for detektorforstærkningen er mellem 500 og 800 V.
    6. Brug z-positionsknappen på smartpanelet til at justere fokusplanet.
    7. Flyt til toppen af prøven og indstil positionerne for toppen af z-stakken ved at klikke på pilespidsen i z-stack-panelet (under fanen erhvervelse | 3. panel).
    8. Fokuser derefter på prøven, indtil SHG-signalet ikke længere registreres - dette er slutningen af stakken. Klik igen på pilehovedet i z-stack-panelet for at indstille denne position. Når du er færdig, skal du slukke for live scanningstilstand .
      BEMÆRK: Vævet er muligvis ikke helt fladt. Derfor kan prøveoverfladen i forskellige regioner i vævet have lidt forskellige positioner i z-retningen.
    9. Under fanen Anskaffelse i det andet panel skal du holde scanningshastigheden på 400 Hz, indstille linjegennemsnittet til 2 og opløsningen til 512 x 512 pixels pr. billede (pixelstørrelse på ~1,4 μm x 1,4 μm) ved hjælp af rullelisterne. Skift til tovejs X-scanningsknappen.
    10. Klik på z-trinstørrelse i z-stack-panelet, og udfyld en z-trinstørrelse på 3 μm i boksen. Klik på start i nederste højre hjørne af skærmen for at oprette en z-stak. Når du er færdig, skal du sørge for at gemme koordinaterne for flisen i filnavnet eller give hver flise sit eget nummer (som i figur 2B).
      BEMÆRK: Baseret på de beskrevne indstillinger, væv og mikroskopsystem tager erhvervelsen af en z-stak af en enkelt flise ~ 10-15 minutter. Forberedelsestrinnene (trin 2.4.4-2.4.10) er inkluderet i dette tidsestimat.

3. Mekanisk prøvning

  1. Forberedelse af uniaxial trækprøvningsopsætning
    1. Gør opsætningen af den vandrette trækprøvning (figur 4) klar til brug ved at følge instruktionerne til træktesteren (f.eks. tænd software, fastgør klemmer, fastgør vejecelle).
    2. For at minimere glidningen af prøven fastgøres tosidet skumtape (figur 4A, B-2) til indersiden af træktesterens klemmer og sandpapir til indersiden af skumbåndet. Til sidst vil sandpapiret være i kontakt med testprøven.
    3. Placer varmebadet (figur 4A, B-3) på plads. Fyld varmebadet med PBS op til niveauet for klemmernes bundflade, så det endnu ikke når sandpapiret.
    4. Tænd for varmebadets strømkilde, og indstil temperaturen til omkring 37 °C.
    5. Monter højhastighedskameraet over trækprøvningssystemet (figur 4A-4), f.eks. ved hjælp af et laboratoriestativ, og monter et objektiv med en brændvidde på 50 mm på kameraet gennem en forlængerring.
    6. Sørg for, at klemmerne er i fokus, og at synsfeltet er stort nok til at registrere prøven under hele strækningsproceduren (synsvidde: ± prøvebredden; FOV længde: ± 2x prøvelængden).
    7. Monter belysningssystemet (figur 4A-5) over trækprøvningssystemet, for eksempel ved hjælp af et laboratoriestativ. Tænd for belysningssystemet, og juster lysintensiteten og placeringen, så der ikke er refleksioner på PBS-overfladen, der skal observeres på kamerabilledet.
    8. Juster kameraets eksponeringstid og forstærkning for at få klare billeder.
    9. Indstil billedoptagelsessoftwaren til at optage med 30 billeder / s med en opløsning på 5.2 MP.
      BEMÆRK: Denne høje billedhastighed er nødvendig for at udføre den efterfølgende DIC-analyse og studere brudadfærden.
    10. Indstil forskydningshastigheden for en af klemmerne således, at den globale tekniske belastningshastighed under mekanisk test svarer til vævets in vivo fysiologiske belastningshastighed
      (5 %/s for plakvæv26).
  2. Generering af speckle mønster
    BEMÆRK: Denne speckle mønsterprotokol er baseret på tidligere arbejde af Walsh et al.27.
    1. Prøven tørres ved let at duppe den med silkepapir.
    2. Sæt det sorte vævsfarve i den tilsigtede spand af airbrushen.
    3. Tilslut airbrush til kompressoren. Tænd for airbrush-kompressoren, og indstil trykket til 25 PSI.
    4. Prøv at skabe et optimalt pletmønster på papir, før du sprøjter på vævet. Spray et par gange, indtil et sort/hvid-forhold på 50 :5028 er opfyldt. Flyt airbrushens nål frem og tilbage for at justere ruheden af pletmønsteret, indtil størrelsen på en plet svarer til størrelsen på 3-5 pixels på højhastighedskameraet29.
      BEMÆRK: Det speckle mønster vil blive brugt til to forskellige formål. For det første måles forskydningen af disse pletter ved at sammenligne højhastighedskamerabilleder erhvervet under mekanisk test (DIC, trin 4.2). For det andet bruges dette specklemønster til at identificere brudstedet på billedet af prøvens ikke-deformerede tilstand (trin 4.3.1).
    5. Hold airbrush ca. 30 cm væk fra prøven, og spray på den lysende overflade.
    6. Lad farvestoffet binde til prøven i 1 min ved stuetemperatur, før prøven nedsænkes i PBS.
  3. Uniaxial trækprøvning
    1. Anbring prøven i træktesterens klemmer med prøvernes omkredsretning på linje med trækretningen og prøvens luminalside opad. Sørg for, at den oprindelige målerlængde er indstillet således, at strimlernes WL-forhold er <1.
    2. Stram grebets skruer ved at anvende et drejningsmoment på 20 cNm ved hjælp af en momentskruetrækker. Gør dette gradvist ved at påføre et lille drejningsmoment på hver skrue, inden det endelige drejningsmoment påføres.
    3. Undersøg visuelt, om prøven indeholder tårer, der kan påvirke testene.
    4. Der hældes mere PBS i varmebadet, indtil prøven er nedsænket, og vent, indtil PBS' temperatur igen har nået 37 °C.
    5. Få et kalibreringsbillede med højhastighedskameraet, hvor testprøven og en lineal er inkluderet som reference. Sørg for, at linealen er i samme afstand fra kameramålet som prøvens lysflade.
    6. Tara vejecellen, og begynd at registrere de globale kraft- og forskydningsmålinger fra vejecellen og aktuatoren på træktesteren.
    7. Ret prøven ud ved at anvende en forstrækning på 0,05 N for at slippe af med slæk i prøven. Udfør 10 cyklusser med forkonditionering af op til 10 % belastning baseret på aktuatorens måling af målerlængden efter påføring af forstrækning.
    8. Start den uniaxiale trækprøvning, indtil prøven er fuldstændig svigtet, mens du optager en video af prøvedeformationen med højhastighedskameraet. Efter vævssvigt skal du stoppe med at registrere de globale kraft- og forskydningsmålinger.
      BEMÆRK: Nogle kommercielle træktestere kan udføre trin 3.3.6-3.3.9 automatisk. Den aktuelle protokol beskriver de manuelle trin, der skal tages, hvis denne automatiske indstilling ikke er inkluderet i den træktester, der bruges.
    9. Fjern prøven fra trækprøvningsanordningen, og kassér den korrekt.
    10. Når du tester den næste prøve, skal du udskifte sandpapir og skumtape på klemmerne.

4. Analyse af data

  1. Kollagen organisationsanalyse
    1. Åbn z-stakkene opnået under MPM med SHG i ImageJ, og opret maksimale intensitetsfremskrivninger (MIP'er) for hver z-stak.
    2. Analysér hver MIP med open source MATLAB-baseret FOA (Fiber Orientation Analysis) værktøj30 for at måle orienteringsvinklen for de enkelte kollagenfibre, der er til stede i fliserne. Brug følgende parametre: Skalaer: [3 4 5] eller [2 4 6], afhængigt af beholderdiameteren, og Beholderhedstærskel: 0,999, 0,9995 eller 0,9999, afhængigt af intensiteten af SHG-signalet.
      BEMÆRK: Flere detaljer om, hvordan du bruger dette værktøj, findes i softwarens manual31.
    3. Brug et andet open source MATLAB-baseret værktøj, FibLab32, til at tilpasse en gaussisk fordeling til vinkelfordelingshistogrammet.
      BEMÆRK: Flere detaljer om, hvordan du bruger dette værktøj, findes i softwarens manual32.
    4. Fra det gaussiske distributionsplot opnået ved hjælp af FibLab ekstraheres følgende strukturelle parametre fra MATLABs arbejdsområde: den dominerende fibervinkel (μ p), som er fordelingsmåden, standardafvigelsen (σp) af fibervinkelfordelingen og den anisotrope fraktion (Pani = 1 - Piso).
      BEMÆRK: Den isotrope fraktion er arealet under basislinjen i den gaussiske fordeling, mens den anisotrope fraktion indeholder arealet af toppen oven på denne baseline33. Bådeσ p og Pani giver information om spredningen af fibrenes orientering i fliseområdet.
    5. Til visuel inspektion skal du afbilde μp ved hjælp af orienterede linjer og σp og Panived hjælp af farvekort.
  2. Digital billedanalyse og brudanalyse
    1. Udfør visuel inspektion på kamerabillederne for at identificere det billede, hvor brudstart finder sted. På denne ramme skal du visuelt identificere brudstedet.
    2. Udfør visuel inspektion på kamerabillederne for at identificere eventuelle revner eller rifter på brudstedet ved starten af mekanisk test. Hvis en sådan tåre er til stede, skal prøven udelukkes fra analyse.
    3. Udfør DIC-analysen med den open source, MATLAB-baserede software Ncorr (v1.2)34. Følg trinnene i Ncorr-manualen35.
      1. Brug de kamerabilleder, der er optaget under trækprøvningen, med højhastighedskameraet til DIC. Vælg det sidste billede før den endelige strækning indtil fejl (efter forkonditionering) som referencebillede. For de aktuelle billeder skal du vælge alle billeder fra starten af den sidste strækning indtil det sidste billede før det billede, hvor brudstart fandt sted.
      2. Vælg eksempeloverfladen som interesseområde (ROI). Undgå de områder, der er tæt på (ca. 1 mm) til klemmerne, da belastningerne i disse områder vil blive stærkt påvirket af grebene.
      3. Udfør DIC-analyse ved hjælp af følgende parametre: Delmængderadius: 30 pixels; Delmængdeafstand: tre pixels; Afskæring af gentagelse: 50; Norm for forskellen vektor cutoff: 10-5; Stamme radius: 5; Automatisk formering, trin #: 5.
      4. Fra DIC-analysen med Ncorr opnås Green-Lagrange (eller Eulerian-stammen) fordelinger af ROI. Brug disse belastningsfordelinger til at beregne den gennemsnitlige Green-Lagrange-stamme af hele plakprøveoverfladen ved det sidste billede før brud. Beregn Green-Lagrange-stammen på brudstedet.
  3. Korrelering af strukturelle og mekaniske data på brudstedet
    1. Brug de naturlige landemærker i analyseprøven og de påførte pletter på prøveemnet til at identificere brudstedet (identificeret i trin 4.2.1) på referencebilledet (trin 4.2.3.1).
    2. Brug de naturlige landmærker i testprøven til at oprette en overlejring af referencebilledet og flisescanningen (trin 2.3) for at identificere brudplaceringen på flisescanningen. Identificer MPM-SHG-flisen, hvor bruddet skete. Hvis bruddet ikke er i et felt, der er scannet med MPM-SHG, skal du identificere det felt, der er tættest på brudplaceringen. Få de strukturelle parametre, der findes ved flisen, hvor brud opstod.

Representative Results

Vævsindsamling og forberedelse af testprøver
Vævssamlingen giver plaque-fibrøse vævsprøver, der kan dissekeres i individuelle testprøver til strukturel billeddannelse og uniaxial trækprøvning. Ideelt set indeholder en indsamlet fibrøs vævsprøve områder med ringe eller ingen tårer (figur 5A) og makrokalcifikationer (figur 5B). Et overskud af disse rifter og forkalkninger (figur 5C) kan føre til plakprøver, der ikke opfylder det tidligere nævnte krav til prøvedimensioner i WL 1.

Multifotonmikroskopi billeddannelse
SHG-billedbehandling og billedefterbehandling leverer MIP'er fra hver afbildet flise (figur 6A, B). Yderligere efterbehandling ved fiberdetektion (figur 6C) giver fiberorienteringshistogrammer (figur 6D), hvorfra kollagenstrukturelle parametre kan ekstraheres (figur 6E). Derudover kan farvekort, der viser de lokale strukturelle kollagenparametre på tværs af hele plakprøven, opnås til visuel analyse (figur 6F, G). For den repræsentative analyseprøve i figur 6 findes en stor intrasamplevariation i de strukturelle kollagenparametre (gennemsnitlig SD ± på μ p = -34° ± 32°; σp = 21° ± 4°; Pani = 0,49 ± 0,14, hvis omkredsretningen er defineret som 0°). Denne intrasample-variation understreger vigtigheden af at opnå lokale strukturelle parametre i stedet for at antage homogenitet.

Mekanisk test
Ruptur adfærd
Højhastighedskameraet giver billeder af plakprøvernes deformations- og brudadfærd under mekanisk test (figur 7). Fra disse billeder kan placeringen af brudinitiering og brududbredelsesstien identificeres. Brudidentifikationsresultaterne er ikke optimale, hvis der er bobler eller refleksioner til stede i kamerabillederne, eller hvis bruddet forplanter sig for hurtigt til at blive fanget af den valgte billedhastighed.

Lokale belastningsmønstre
Digital billedkorrelationsanalyse på kameraoptagelserne erhvervet under den uniaxiale trækprøvning giver de lokale vævsdeformationskort, såsom Green-Lagrange-stammekortene vist i figur 8. Disse kort viser de tre belastningskomponenter (εxx, εxy og ε yy) ved rammen før brudstart. Fra disse belastningskort kan de gennemsnitlige stammer i et område af interesse og lokal belastning på et sted, såsom brudsted, ekstraheres.

For den repræsentative prøve i figur 8 viser de lokale stammedata en stor variation inden for stikprøven. For den repræsentative analyseprøve i figur 8 findes en stor intrasamplevariation i de lokale stammer (intervallerne for de observerede stammer er som følger: εxx = -0,30-0,17; εxy = -0,13-0,20; εyy = 0-0,40). Dette understreger vigtigheden af at indhente lokale data i stedet for brutto, gennemsnitlige værdier opnået med antagelsen om vævshomogenitet.

Korrelering af mekanisk og strukturel vævsinformation
Ovennævnte resultater tillader tilknytning af vævets lokale deformations- og brudadfærd til kollagenarkitekturen. Når brudstedet er identificeret på kameraoptagelserne (figur 9A), kan det kortlægges tilbage til referencekamerabilledet (figur 9B) og til mikroskopiflisescanningen (figur 9C). Dette giver MPM-SHG-flisen, hvor bruddet skete, og de strukturelle parametre, der findes på denne flise (figur 9D). De strukturelle parametre, der findes i flisen, hvor brud forekom i en repræsentativ prøve, vist i figur 9, er μ p = 28°, σp = 19° og Pani = 0,6. Den samme procedure kan også anvendes på de ikke-bristede vævssteder. Det er vigtigt at bemærke, at kortlægning af brudplaceringen på referencebilledet fra brudrammen kan være udfordrende i tilfælde af et dårligt pletmønster og uklare naturlige vartegn. Hvis vævets naturlige vartegn ikke er tydelige nok, kan det desuden være vanskeligt at medregistrere flisescanningsoverlejringen og højhastighedskamerabillederne.

Figure 1
Figur 1: Arbejdsprocesdiagram for den præsenterede eksperimentelle protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Valg af fliser til SHG-billeddannelse fra flisescanningen . (A) Testprøve fastgjort i silicium. (B) Flisescanning af testprøven opnået ved brightfieldmikroskopi. De felter, der er valgt til SHG-billeddannelse, er markeret med blå firkanter. C) Maksimal intensitetsprojektion af MPM med SHG. Skalabjælke = 140 μm (C). Forkortelser: SHG = anden harmonisk generation; MPM = multifotonmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Plakprøve placeret under målet for multifotonmikroskopet. Placeringen af plakprøven sikres med en fosfatbufret saltvandsfyldt petriskål. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Specialdesignet uniaxial træktester med dens forskellige komponenter angivet . (A) Samlet overblik over systemet. Bemærk, at sandpapirindsatserne i klemmerne er synlige, da kun bundklemmerne er fastgjort. (B) Zoomet billede af trækprøverens klemmer med prøveemnet klar til prøvning. Forkortelser: PVC = polyvinylchlorid; LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Resultater af vævsindsamling og prøveforberedelse fra repræsentative prøver . (A) Frisk og intakt plakprøve, udtaget fra samtykkende patienter, der har gennemgået carotis endarterektomikirurgi. (B) 3D-rekonstruktion fra en μCT-scanning. Forkalket væv er vist i lyseblå og ikke-forkalket i rødt. En optimal prøve uden forkalket væv kunne opnås fra området mellem de blå linjer. (C) 3D-rekonstruktion fra μCT-scanningen, der viser en suboptimal plak med et overskud af forkalket væv. Skalastang = 3 mm. Forkortelse: μCT = mikrocomputertomografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: MPM-SHG-resultater fra en repræsentativ stikprøve. (A) Oversigt over flisescanning; De valgte felter til billedbehandling vises med blåt. B) MIP'er fra forskellige fliser. (C) Fiberdetektering af FOA-værktøjet fra en valgt flise # 1. (D) Fiberorienteringshistogram fra en valgt flise. (E) Fiberorienteringshistogram + Gaussisk pasform, hvorfra kollagenstrukturelle parametre kan ekstraheres fra en valgt flise. (F) Gengivelse af μp (retning sort linje) og σp (baggrundsfarve) på tværs af hele plakprøven. (G) Gengivelse af μp (retning sort linje) og Pani (baggrundsfarve) på tværs af hele plakprøven. Skalastænger = 140 μm (B,C). Forkortelser: MPM-SHG = multifotonmikroskopi-anden-harmonisk generation; MIP'er = fremskrivninger af maksimal intensitet FOA = fiberorienteringsanalyse; μp = overvejende fibervinkel; Pani = anisotrop fraktion; σp = standardafvigelse af fibervinkelfordelingen; Piso = isotrop fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Brudinitiering og formering i en plakvævsprøve under trækprøveproceduren.1) Forstrakt tilstand, intakt væv. 2) Rupture initiation-første ramme, hvor brud observeres. Brudinitieringsstedet er markeret med en rød firkant. 3 ) og 4) Rupture udbredelse. 5) Fuldstændig brud på plakprøven. Vægtstænger = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Green-Lagrange-stammemønstre af en repræsentativ prøve (εxx, εxy og εyy) ved rammen før brud, opnået med DIC-analyse. Gennemsnitlig og standardafvigelse over hele plakken angives sammen med belastningen på brudstedet. Forkortelser: DIC = digital billedkorrelation; εxx = langsgående stamme; εxy = forskydning; εyy = trækbelastning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Overlejringsbillede af brudstedet (rød firkant) på billeder. (A) Højhastighedskamerabillede, hvor brud identificeres (brudramme). (B) Højhastighedskamerabillede, hvor der kun anvendes forstrækning (referenceramme). (C) Flisescanningsbilledet opnået via mikroskopi. (D) Et farvekodet kort, der viser lokale kollagenstrukturelle parametre ved forskellige fliser. Den μp (retning sort linje) og Pani (baggrundsfarve) på tværs af hele plakprøven præsenteres. Forkortelser: μp = fremherskende fibervinkel; Pani = anisotrop fraktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Den aktuelle undersøgelse fokuserede på at udvikle en mekano-billeddannelsesrørledning for at studere sammenhængen mellem den lokale kollagenorientering og dispersion, lokale mekaniske egenskaber og brudadfærd af fibrøst aterosklerotisk plakvæv. Protokollen beskrevet heri er innovativ af flere grunde. For det første er det første gang, at digital billedkorrelation er blevet anvendt til at måle den lokale deformation af fibrøst plakvæv under mekanisk belastning. For det andet giver denne protokol de nødvendige oplysninger til at analysere sammenhængen mellem det lokale deformationsmønster og den lokale kollagenarkitektur i det fibrøse plakvæv. Betydningen af den lokale vurdering understreges af både stammedataene og kollagendataene, der præsenteres i resultatafsnittet, som viser vævets heterogene natur. Derfor anbefales brugen af teknikker, der muliggør lokal vurdering, såsom dem, der anvendes i denne protokol, til fremtidige undersøgelser af fibrøse plakegenskaber.

Testprøveforberedelse er blandt de kritiske trin i denne protokol. Carotidplaques er hovedsageligt kollagenvæv; De kan dog indeholde forkalkninger, der anses for at påvirke den samlede plaquemekaniske opførsel36,37. Da undersøgelsen fokuserer på plakkens fibrøse vævskomponent, undgås forkalkninger i testprøverne ved hjælp af μCT-billeddannelse38. Hvis μCT ikke er tilgængelig, kan andre billeddannelsesteknikker såsom MR eller OCT39 overvejes til påvisning af de forkalkede områder i plaquen. At opnå fibrøse vævstestprøver, der er fri for forkalkninger og er af en stor nok størrelse, der kan bruges til mekanisk testning, kan være en udfordrende opgave for plaques, der er stærkt forkalkede eller indeholder dispergerede forkalkninger. En anden udfordrende opgave i protokollen er at generere et optimalt pletmønster til digital billedkorrelation. Optimal DIC kræver et sort/hvid-forhold på 50:5028 og pletter størrelsen på tre til fem pixels29 for at sikre passende kvalitet. Manglende opfyldelse af disse krav kan resultere i unøjagtige lokale belastningsmålinger. Endelig kan kortlægning af brudstedet til SHG-billederne være udfordrende, hvis de naturlige vartegn for et væv ikke er klare. For sådanne prøver vil anvendelse af flere fiduciale markører på vævet før billeddannelse være nyttigt.

MPM-SHG-teknikken, der anvendes i den nuværende protokol, er bedre end mange andre kollagenbilleddannelsesteknikker, da det er en højopløselig og ikke-destruktiv teknik med en relativt stor penetrationsdybde. Alligevel udgør penetrationsdybden (<400 μm) af MPM-SHG en begrænsning, da det ikke tillader billeddannelse af hele tykkelsen af testprøverne, som varierede mellem 0,5 og 2 mm. I en nylig undersøgelse med diffusionstensor magnetisk resonansbilleddannelse (DT-MRI) har vi vist, at den dominerende fiberorientering i de dybere dele af plakvævet kan være forskellig fra den i de mere overfladiske, luminale dele af vævet14. Derfor er yderligere undersøgelser berettiget til at undersøge den lokale kollagenarkitektur i de dybere dele af tykke fibrøse plakvævsprøver og dens relation til den lokale vævsmekanik. Til dette formål kan polariseret rumlig frekvensdomænebilleddannelse (pSFDI) anvendes. Denne nyligt udviklede optiske billeddannelsesteknik blev rapporteret at have potentialet til at måle fiberorientering så dybt som 0,8 mm i mitralventilblade12. pSFDI tilbyder også en hurtig erhvervelse, som også kan lette visualisering af hele prøveområdet i stedet for kun et udvalg af fliser, som det er tilfældet i den nuværende protokol. En anden begrænsning ved den nuværende protokol er, at kun overfladedeformation kunne identificeres. I fremtidige undersøgelser kan spejlassisteret multi-view DIC40 eller digital volumenkorrelation (DVC)41 inkluderes i denne protokol for at få yderligere oplysninger om de volumetriske undergrundsstammer.

Den nuværende eksperimentelle protokol kan udvides eller ændres yderligere på flere måder for at få yderligere information om plaque rupture mekanik og dens relation til den underliggende mikrostruktur. For det første inkluderer den nuværende protokol uniaxial trækprøvning i omkredsretningen. Denne type mekanisk test blev valgt, da pladen overvejende oplever trækstrækning i omkredsretningen in vivo. For mere omfattende mekanisk karakterisering kan denne protokol udvides yderligere til at inkorporere inflationstest, biaxial test eller uniaxial trækprøvning i længderetningen. For det andet fokuserer den nuværende protokol kun på at opnå lokale stammer gennem DIC. Imidlertid kan et mere komplet billede af plakettens mekaniske opførsel opnås ved også at inkludere lokal stressanalyse i protokollen, men dette kræver karakterisering af lokal stivhed. Selvom det i øjeblikket er udfordrende, kan dette opnås ved beregningsteknikker som det inverse endelige element metode 42,43 og de virtuelle felter metode44. Bortset fra eksperimentel tilpasning kan nogle yderligere efterbehandlingstrin også tilføjes til den nuværende protokol. For det første, i stedet for kun at identificere brudstedet, kan revneudbredelsesstien identificeres via de opnåede højhastighedskamerabilleder. Denne formeringsvej kan korreleres med lokale strukturelle og mekaniske parametre. For det andet blev brudinitieringsstedet visuelt identificeret i den beskrevne protokol. En tidligere undersøgelse af ikke-biologisk væv har brugt diskontinuiteter i DIC-stammemålinger til at detektere brud45. Anvendelse af en sådan automatiseret bruddetektion på plakvæv kan muligvis forbedre nøjagtigheden af bruddetektionen. Endelig er en stor fordel ved MPM-SHG sammenlignet med andre kollagenbilleddannelsesteknikker, at den visualiserer individuelle kollagenfibre. Derfor kan de data, der opnås via denne protokol, også bruges til at undersøge yderligere lokale kollagenegenskaber, såsom kollagenindholdet.

Denne protokol kan bruges til at give en bedre forståelse af de lokale egenskaber ved fibrøst plakvæv, den komponent, der mekanisk fejler i plakbrud in vivo. Disse oplysninger er nødvendige for at etablere nye strukturelle og funktionelle billeddannelsesmarkører, der forudsiger plaquebrud hos patienter. Disse nye markører er nødvendige, da de tidligere foreslåede risikobiomarkører har vist sig at have suboptimal prædiktiv værdi for fremtidige kliniske hændelser 5,6. I fremtiden kan OCT og ps-OCT muligvis identificere og kvantificere fibrøst væv i arteriesystemet46,47,48. Desuden blev stammen betragtet som en surrogatmarkør for lokal plaksammensætning49. Således kan in vivo-stammemålinger49 potentielt hjælpe med at identificere plakstabilitet hos patienter. Man bør dog være forsigtig med direkte at oversætte de opnåede resultater til in vivo plaque ruptur. For det første oplever det fibrøse plakvæv mere kompleks belastning in vivo end den ensrettede trækbelastning, der anvendes i denne protokol. For det andet er aterosklerotiske plaques multikomponentstrukturer; In vivo-stress- og belastningsfordelingen i det fibrøse plakvæv kan påvirkes af tilstedeværelsen og placeringen af de andre plakkomponenter, såsom forkalkninger37.

Denne mekano-billeddannelse pipeline kan også bruges til at studere andre kollagenøse væv. Global mekanisk test og strukturel billeddannelse af kollagen anvendes allerede i vid udstrækning til biologisk væv. Imidlertid er lokal vurdering af egenskaber før svigt og svigt samt kollagenarkitektur afgørende for nøjagtig mekanisk karakterisering af heterogent fibrøst væv. Vi forventer, at strukturen i denne nye protokol vil give yderligere indsigt i samspillet mellem mikrostrukturen og mekanikken i flere biologiske væv.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af et NWO-Vidi-tilskud (18360).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mm extension ring Thorlabs Inc. CML10
15 mL tube VWR 525-0150
20x APO water immersion objective Leica 507701
3D Slicer software N/A Version 4.11
50 mL tubes VWR 525-0156
Airbrush pistol AB 430- nozzle diameter 0.3 mm Conrad 4.01614E+12
Blackout, Nylon Fabric with Polyurethane Coating Thorlabs
Black tissue dye Polysciences inc 24113-2
Camera lens, focal length 50 mm Thorlabs Inc. MVL50M1
Camera stand VWR 241-0093, 241-7311
Chameleon Ultra multiphoton laser Coherent
Compressor + air hose JUN-AIR, Conrad B07GB9HC62, 4016138577198
Excel Microsoft Version 2208
Foam tape double-sided, 1.9 x 150 cm Pattex
Heating bath N/A Custom made
High-speed camera + imaging software Pixelink-Navitar Inc. PL-D725
Human carotid atherosclerotic plaques (from carotid endarterectomy surgery) N/A
Image J National Institute of Health N/A
LAS-AF Leica Version 2.3 Imaging software multiphoton microscope
LEICA TCS SP5 II Leica Microscope used for SHG imaging
Lighting system AMZ instruments LED-60TB Used to obtain clear images with the high-speed camera
MATLAB MathWorks Version R2021A
MATLAB-based FibLab software Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based FOA (Fibre Orientation Analysis) tool Eindhoven University of Technology N/A
MATLAB-based Ncorr software Georgia Institute of Technology Version 1.2
Needles Emerald BDAM302986
Petri dish (10 cm diameter) VWR BRND452000
Parafilm VWR 291-1214
Pasteur Pipettes VWR ELKA127-P511-000
Quantum GX2 Micro computed tomography (μCT) scanner + X-ray filter of Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm PerkinElmer CLS149276
Ruler Fine Science Tools 1800030
Sandpaper (P180) Conrad 4.00932E+12
Side cutter Conrad 4.25084E+12
Silicon elastomer base and curing agent (Sylgard 184) VWR 634165S
Tensile tester + software + clamps N/A Made in-house using a cylindrical linear actuator (EACM2E10AZAK, Oriental Motor Ltd.), and a 10 N load cell (LCMFD-10N, Omega Engineering Inc.)
Torque screwdriver Garant, Hoffman group 659906

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5, 1-18 (2019).
  2. Visseren, F., et al. ESC Guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice. European Heart Journal. 42 (34), 3227-3337 (2021).
  3. Jang, I. K., et al. et al. In vivo characterization of coronary atherosclerotic plaque by use of optical coherence tomography. Circulation. 111 (12), 1551-1555 (2005).
  4. Ohayon, J., et al. Necrotic core thickness and positive arterial remodeling index: emergent biomechanical factors for evaluating the risk of plaque rupture. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 295 (2), 717-727 (2008).
  5. SCOT-HEART investigators. Coronary CT angiography and 5-year risk of myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 379, 924-933 (2018).
  6. Williams, M. C., et al. Coronary artery plaque characteristics associated with adverse outcomes in the SCOT-HEART study. Journal of the American College of Cardiology. 73 (3), 291-301 (2019).
  7. Kwak, B. R. Biomechanical factors in atherosclerosis: mechanisms and clinical implications. European Heart Journal. 35 (43), 3013-3020 (2014).
  8. Akyildiz, A. C., Speelman, L., Gijsen, F. J. Mechanical properties of human atherosclerotic intima tissue. Journal of Biomechanics. 47 (4), 773-783 (2014).
  9. Loree, H. M., Grodzinsky, A. J., Park, S. Y., Gibson, L. J., Lee, R. T. Static circumferential tangential modulus of human atherosclerotic tissue. Journal of Biomechanics. 27 (2), 195-204 (1994).
  10. Holzapfel, G. A., Sommer, G., Regitnig, P. Anisotropic mechanical properties of tissue components in human atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (5), 657-665 (2004).
  11. Maher, E., et al. Tensile and compressive properties of fresh human carotid atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 42 (16), 2760-2767 (2009).
  12. Teng, Z. A uni-extension study on the ultimate material strength and extreme extensibility of atherosclerotic tissue in human carotid plaques. Journal of Biomechanics. 48 (14), 3859-3867 (2015).
  13. Lendon, C. L., Davies, M. J., Richardson, P. D., Born, G. V. R. Testing of small connective tissue specimens for the determination of the mechanical behaviour of atherosclerotic plaques. Journal of Biomedical Engineering. 15 (1), 27-33 (1993).
  14. Akyildiz, A. C. 3D fiber orientation in atherosclerotic carotid plaques. Journal of Structural Biology. 200, 28-35 (2017).
  15. Johnston, R. D., Gaul, R. T., Lally, C. An investigation into the critical role of fibre orientation in the ultimate tensile strength and stiffness of human carotid plaque caps. Acta Biomaterialia. 124, 291-300 (2021).
  16. Larson, A. M. Multiphoton microscopy. Nature Photonics. 5 (1), (2010).
  17. Pagiatakis, C., Galaz, R., Tardif, J. C., Mongrain, R. A comparison between the principal stress direction and collagen fiber orientation in coronary atherosclerotic plaque fibrous caps. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (6), 545-555 (2015).
  18. Niestrawska, J. A., et al. The role of tissue remodeling in mechanics and pathogenesis of abdominal aortic aneurysms. Acta Biomaterialia. 88, 149-161 (2019).
  19. Woessner, A. E., Jones, J. D., Witt, N. J., Sander, E. A., Quinn, K. P. Three-dimensional quantification of collagen microstructure during tensile mechanical loading of skin. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 642866 (2021).
  20. Kujawinska, M., et al. Digital image correlation method: A versatile tool for engineering and art structures investigations. Proceedings of SPIE. 8011, (2011).
  21. Luo, Y., Duprey, A., Avril, S., Lu, J. Characteristics of thoracic aortic aneurysm rupture in vitro. Acta Biomaterialia. 42, 286-295 (2016).
  22. Bonati, L. H., et al. European Stroke Organisation guideline on endarterectomy and stenting for carotid artery stenosis. European Stroke Journal. 6 (2), 1-47 (2021).
  23. Hemmasizadeh, A., Darvish, K., Autieri, M. Characterization of changes to the mechanical properties of arteries due to cold storage using nanoindentation tests. Annals of Biomedical Engineering. 40 (7), 1434-1442 (2012).
  24. Fedorov, A., et al. 3D slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network. Magnetic Resonance Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).
  25. Mulvihill, J. J., Walsh, M. T. On the mechanical behaviour of carotid artery plaques: the influence of curve-fitting experimental data on numerical model results. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 12 (5), 975-985 (2013).
  26. Walsh, M. T., et al. Uniaxial tensile testing approaches for characterisation of atherosclerotic plaques. Journal of Biomechanics. 47 (4), 793-804 (2014).
  27. Walsh, D. R. Mechanical and structural characterisation of the dural venous sinuses. Scientific Reports. 10, 21763 (2020).
  28. Palanca, M., Tozzi, G., Cristofolini, L. The use of digital image correlation in the biomechanical area: a review. International Biomechanics. 3, 1-21 (2016).
  29. Zhou, P., Goodson, K. E. Subpixel displacement and deformation gradient measurement using digital image/speckle correlation. Optical Engineering. 40 (8), 1613-1620 (2001).
  30. Frangi, A. F., Niessen, W. J., Vincken, K. L., Viergever, M. A. Multiscale vessel enhancement filtering. Lecture Notes in Computer Science. 1496, (1998).
  31. Fibertracking Manual. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blob/mater/Fibertracking/manual.pdf (2023).
  32. FibLab Different Angle. , Available from: https://gitlab.tue.nl/stem/FibLab/-/blobl/master/adifferentangle.pdf (2023).
  33. van Haaften, E. Decoupling the effect of shear stress and stretch on tissue growth and remodeling in a vascular graft. Tissue Engineering Part C: Methods. 24 (7), 418-429 (2018).
  34. Blaber, J., Adair, B., Antoniou, A. Ncorr: open-source 2D digital image correlation matlab software. Experimental Mechanics. 55 (6), 1105-1122 (2015).
  35. NCorr Manual. , Available from: http://www.ncorr.com/download/ncorrmanual_v1_2_2.pdf (2017).
  36. Barrett, H. E., Vander Heiden, K., Farrell, E., Gijsen, F., Akyildiz, A. C. Calcifications in atherosclerotic plaques and impact on plaque biomechanics. Journal of Biomechanics. 87, 1-12 (2019).
  37. Gijsen, F. Morphometric and mechanical analyses of calcifications and fibrous plaque tissue in carotid arteries for plaque rupture risk assessment. IEEE transactions on Biomedical Engineering. 68 (4), 1429-1438 (2021).
  38. Zhang, L. Advances in CT techniques in vascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 29 (8), 716-822 (2021).
  39. Wang, Y., Osborne, M. T., Tung, B., Li, M., Li, Y. Imaging cardiovascular calcification. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-15 (2018).
  40. Chen, B., Zhao, J., Pan, B. Mirror-assisted multi-view digital image correlation with improved spatial resolution. Experimental Mechanics. 60, 283-293 (2019).
  41. Santamarıa, V. A. A., Garcıa, M. F., Molimard, J., Avril, S. Characterization of chemoelastic effects in arteries using digital volume correlation and optical coherence tomography. Acta Biomaterialia. 102, 127-137 (2019).
  42. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent material property characterization of atherosclerotic human carotid arteries through a Bayesian Optimization based inverse finite element approach. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104996 (2022).
  43. Guvenir Torun, S., et al. Multicomponent mechanical characterization of atherosclerotic human coronary arteries: an experimental and computational hybrid approach. Frontiers in Physiology. 12, 733009 (2021).
  44. vanden Berg, R., Avril, S., Gijsen, F. J. H., Akyildiz, A. C. Material characterization of atherosclerotic plaques with virtual fields method. Proceeding Book of 6th International Conference on Computational and Mathematical Biomedical Engineering - CMBE2019. , (2019).
  45. Helm, J. D. Digital image correlation for specimens with multiple growing cracks. Experimental Mechanics. 48 (6), 753-762 (2008).
  46. Nadkarni, S. K., et al. Measurement of collagen and smooth muscle cell content in atherosclerotic plaques using polarization-sensitive optical coherence tomography. Journal of the American College of Cardiology. 49 (13), 1474-1481 (2007).
  47. Nadkarni, S. K., Bouma, B. E., de Boer, J., Tearney, G. J. Evaluation of collagen in atherosclerotic plaques: the use of two coherent laser-based imaging methods. Lasers in Medical Science. 24 (3), 439-445 (2009).
  48. Villiger, M. Coronary plaque microstructure and composition modify optical polarization: a new endogenous contrast mechanism for optical frequency domain imaging. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 11 (11), 1666-1676 (2018).
  49. Schaar, M. D., et al. Characterizing vulnerable plaque features with intravascular elastography. Circulation. 108, 2636-2641 (2003).

Tags

Bioengineering nr. 189
En metode til at studere sammenhængen mellem lokal kollagenstruktur og mekaniske egenskaber af aterosklerotisk plaque-fibrøst væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Crielaard, H., Guvenir Torun, S.,… More

Crielaard, H., Guvenir Torun, S., Wissing, T. B., de Miguel Muñoz, P., Kremers, G. J., Gijsen, F. J. H., Van Der Heiden, K., Akyildiz, A. C. A Method to Study the Correlation Between Local Collagen Structure and Mechanical Properties of Atherosclerotic Plaque Fibrous Tissue. J. Vis. Exp. (189), e64334, doi:10.3791/64334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter