Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine konsistente Methode zur schnellen Durchführung von Überlebensorchiektomien und Ovariektomien von Nagetieren.
Abstract
Die Signalübertragung von Sexualhormonen spielt eine entscheidende Rolle in mehreren Organsystemen sowie beim Fortschreiten verschiedener Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Die Manipulation des Sexualhormonspiegels im murinen Modellsystem ermöglicht die Untersuchung ihrer Auswirkungen auf Organe/Gewebe und auf das Fortschreiten der Krankheit. Die Orchiektomie - die chirurgische Entfernung der Hoden - und die Ovariektomie - die chirurgische Entfernung der Eierstöcke - bieten eine Methode, um die endogenen Sexualhormone zu erschöpfen, so dass die genauen Hormonspiegel durch Medikamente oder andere Verabreichungsmethoden bereitgestellt werden können. Hier stellen wir schnelle und minimalinvasive Methoden sowohl für die Orchiektomie als auch für die Ovariektomie im murinen Modellsystem zur Reduktion von Sexualhormonen zur Verfügung. Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Vorbereitung und Exzision der Hoden durch den Hodensack und die Exzision der Eierstöcke über zwei Schnitte im rechten und linken seitlichen Dorsum.
Introduction
Die Hoden und Eierstöcke sind die primären Organe, die für die Produktion von Sexualhormonen verantwortlich sind. Die Kaskade der hormonellen Kommunikation, die zur Produktion von Testosteron und Östrogen führt, ist ein gut charakterisierter Prozess, der im Hypothalamus mit der Freisetzung des Gonadotropin-Releasing-Hormons (GnRH)1 beginnt. Die Freisetzung von GnRH bewirkt die Freisetzung des luteinisierenden Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) aus der Hirnanhangsdrüse. Wenn diese Hormone in den Blutkreislauf gelangen, wirken sie sich dann auf andere Gewebe im Körper aus. Das primäre Ziel von LH sind die Hoden (bei Männern) und die Eierstöcke (bei Frauen)2. Als Reaktion auf LH produzieren und setzen die Hoden Testosteron3 frei. In ähnlicher Weise produzieren die Eierstöcke Östrogen4. Während die beabsichtigte Wirkung dieser Hormone darin besteht, die Zellen und den Körper auf die Befruchtung vorzubereiten und ein funktionierendes Fortpflanzungssystem zu gewährleisten, können viele andere Körpersysteme betroffen sein.
Sexualhormone wurden mit mehreren physiologischen Funktionen in Verbindung gebracht. Zum Beispiel hilft Östrogen, die Knochenhomöostase aufrechtzuerhalten, indem es die Resorption von Knochen durch Osteoklasten verhindert. Aus diesem Grund können ovariektomierte Mausmodelle verwendet werden, um die Physiologie von Knochenerkrankungen wie Osteoporose zu untersuchen 5,6,7. Testosteron und Östrogen sind auch Forschungsziele für viele kardiovaskuläre und neurodegenerative Erkrankungen. In jüngster Zeit wurde eine erhöhte Testosteronproduktion in Verbindung mit einer fettreichen Ernährung mit vaskulärem oxidativem Stress in Verbindung gebracht8. Im Gehirn haben Veränderungen der LH nach einer Ovariektomie zu Veränderungen des räumlichen Gedächtnisses geführt9. Die Reduktion von Östrogenen nach einer Ovariektomie ist auch zu einem Modellsystem für die Untersuchung des Zelltods im Hippocampus geworden, da dies eine Apoptose induzieren kann, die zu Gedächtnisdefiziten führt10. Testosteron hat auch eine Rolle beim Wachstum der Nieren gezeigt, sowohl in Mausmodellen als auch beim Menschen nach einer Nierentransplantation11.
Die Erstellung eines hormonarmen Mausmodells ermöglicht die Untersuchung von Sexualhormonen und ihren Hormonkaskaden bei verschiedenen Krankheiten oder Geweben. Dies kann durch eine operative Entfernung der Hoden (Orchiektomie) oder der Eierstöcke (Ovariektomie) erreicht werden. Dieses Verfahren kann bei Mäusen jeden Stammes durchgeführt werden, wenn sie bereits im Entwöhnungsalter (einundzwanzig Tage) oder im Erwachsenenalter sind. Die Ovariektomie wird bei weiblichen Mäusen durchgeführt, während die Orchiektomie bei männlichen Mäusen durchgeführt wird. Durch die Entfernung dieser Organe kann der Östrogen- und Testosteronspiegel und viele ihrer Derivate, wie z. B. Progesteron, stark gesenkt werden12,13. Der Prozess der Durchführung von Orchiektomien oder Ovariektomien bei Mäusen kann mit der richtigen Technik schnell und minimalinvasiv sein. Die schnelle Exzision dieser Organe auf sichere und effiziente Weise kann eine schnelle chirurgische Behandlung ermöglichen und gleichzeitig die Anzahl der Mäuse minimal halten, da sie bei korrekter Durchführung eine Überlebensrate von 100 % aufweist. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle Entfernung der Hoden und Eierstöcke und demonstrieren die richtige postoperative Überwachung, damit die Forscher diese Operation schnell und sicher durchführen können. Wir fügen auch visuelle Beispiele der Geschlechtsorgane und des umgebenden Gewebes hinzu, um dem Chirurgen bei der Durchführung dieses Eingriffs anatomische Orientierungspunkte zu liefern.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der UTSW genehmigt (APN#2019-102840).
1. Orchiektomie bei Mäusen
- Bereiten Sie ein aseptisches Arbeitsfeld vor und stellen Sie sicher, dass die erforderlichen chirurgischen Instrumente sterilisiert wurden und leicht verfügbar sind. Befolgen Sie aseptische Praktiken für die Überlebenschirurgie von Nagetieren.
- Erfassen Sie das Gewicht der männlichen Maus und verabreichen Sie die bevorzugte Anästhesiemethode gemäß den institutionellen Richtlinien. In diesem Protokoll wurden 2% Isofluran über einen Präzisionsverdampfer verabreicht, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Verabreichen Sie vor dem Eingriff Schmerzmittel gemäß den institutionellen Leitlinien. In diesem Protokoll wurden 1,0 mg/kg Buprenorphin SR und 5 mg/kg Meloxicam subkutan verabreicht.
- Sobald die Maus unter Narkose ist, bedecken Sie die Augen des Tieres mit befeuchtendem Augengel, um die Bildung von Augenverletzungen, Hornhautaustrocknung oder Geschwüren zu vermeiden.
- Bevor Sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Anästhesie richtig ist, indem Sie einen Zehenkneiftest durchführen.
- Bereiten Sie den Operationsbereich des Tieres vor, bevor Sie ihn auf das aseptische, drapierte Operationsfeld legen.
- Als nächstes rasierst du den Leisten- und Hodensackbereich der Maus mit einer Haarschneidemaschine.
HINWEIS: Die Rasur des Unterbauchs oberhalb des Penis ermöglicht eine bessere Visualisierung während der Operation. - Tragen Sie mit einem mit Watte abgeklebten Applikator eine dünne Schicht Enthaarungscreme (siehe Materialtabelle) auf die Haut des Tieres auf und bedecken Sie den Hodensack und die Umgebung, die gerade rasiert wurde. Warten Sie 30 s und entfernen Sie die Creme mit einem Stück sauberer Gaze.
- Verwenden Sie 70 % mit Ethanol getränkte Mullschwämme, um die restliche Creme und die Haare von der Stelle abzuwischen.
HINWEIS: 70% Ethanol in diesem Schritt soll die vollständige Entfernung der Enthaarungscreme unterstützen. Die antiseptische Vorbereitung des Operationsfeldes erfolgt in Schritt 1.8.
- Als nächstes rasierst du den Leisten- und Hodensackbereich der Maus mit einer Haarschneidemaschine.
- Bringen Sie die Maus in den Operationsbereich und stellen Sie sicher, dass eine Wärmequelle zur Verfügung steht, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation aufrechtzuerhalten. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein OP-Tuch und kleben Sie die Füße der Maus mit weichem Klebeband auf die OP-Matte.
- Wenn die Hoden in den Bauch aufsteigen, tasten Sie den Bauch vorsichtig ab, damit die Hoden absinken. Verwenden Sie eine behandschuhte Hand, um sanften Rolldruck nach unten auf den Bauch auszuüben.
HINWEIS: Es ist einfacher, diese Operation unter einem Seziergerät oder mit einer Lupenbrille für eine verbesserte Vergrößerung durchzuführen. Wenn Sie dies unter einem Dissektionsfernrohr durchführen, nehmen Sie sich einen Moment Zeit, um den Hodensack der Maus unter dem Sichtfeld des Oszilloskops zu positionieren. Ein weiches Klebeband kann verwendet werden, um die Beine oder den Bauch der Maus auf das Operationsfeld zu kleben, um sicherzustellen, dass sie an der richtigen Stelle bleibt. - Schrubben Sie die Haut mit einem chirurgischen Peeling von Betadine (oder einem ähnlichen antiseptischen Hautpräparat), gefolgt von einem Peeling mit 70 % Alkohol mindestens dreimal, um eine ordnungsgemäße Hautdesinfektion zu gewährleisten. Schrubben Sie bei jedem Peeling in einer radialen Bewegung nach außen, so dass die Mitte der Inzisionsstelle zuerst geschrubbt wird und der äußere Rand des rasierten Operationsbereichs zuletzt geschrubbt wird.
- Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt sterile OP-Handschuhe an. Verwenden Sie für die nächsten Schritte des Verfahrens aseptische Techniken. Bedecken Sie die Maus mit einem sterilen chirurgischen Tuch mit einem kleinen Einschnitt (auf etwa 0,5-1 Zoll im Quadrat geschnitten, um über die Operationsstelle zu passen) über dem Tier, um den Körper mit dem Abdeckmaterial zu bedecken.
- Legen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt im Hodensack von ca. 1 cm bis 1,5 cm Länge mit einer chirurgischen Skalpellklinge oder ähnlichen Instrumenten an, die den von Ihnen genehmigten institutionellen Tierschutzrichtlinien entsprechen.
- Greife den Schnittrand der Haut und trenne die Haut mit einem stumpfen Instrument vom darunterliegenden Gewebe. Nehmen Sie sich Zeit, um dies an den lateralen, oberen und unteren Rändern des Einschnitts zu tun.
- Isolieren Sie einen Hoden, indem Sie den Spatel und die Pinzette verwenden, um den Einschnitt in der Haut so zu bewegen, dass er auf einem der Hoden zentriert wird. Wenn dies schwierig ist, gehen Sie zurück zu 1.11 und trennen Sie die Haut weiter von den darunterliegenden Schichten.
- Nimm eine gebogene Pinzette und lege sie auf beide Seiten des Hodens. Üben Sie einen sanften Druck nach unten aus, um den Hoden nach außen zu drücken. Greife die dünne, durchsichtige Muskelschicht, die sich auf dem Hoden befindet, mit einer Pinzette. Das ist der Cremaster-Muskel. Die Überprüfung der korrekten Muskelschicht erfolgt durch die Beobachtung dieser Schicht und ihrer Durchblutung, die sich unabhängig vom darunter liegenden Hoden bewegt.
HINWEIS: Die Identifizierung des korrekten Gewebes wird durch seine Transparenz und seine Fähigkeit, sich unabhängig vom darunter liegenden Gewebe zu bewegen, bestätigt.- Manipulieren Sie das Muskelgewebe mit einer Pinzette, bis der Scheitelpunkt des Muskels erfasst ist. Dies sollte der unterste Teil sein, darunter befinden sich die Hoden und der Nebenhoden der Cauda.
- Fassen Sie den Cremaster-Muskel mit einer Pinzette und bewegen Sie sich vorsichtig von den Hoden und Nebenhoden weg. Machen Sie einen 0,5 cm langen Schnitt durch den Cremaster-Muskel des ersten Hodens an seiner Spitze mit einer kleinen Vannas-Federschere.
- Platzieren Sie eine Verriegelungsklemme an der hinteren Kante des geschnittenen Cremaster-Muskels. Verwenden Sie ein schmales Paar Hämostaten oder ein Paar verriegelnde Mikronadelhalter. Sobald das Gewebe geklemmt ist, legen Sie das Instrument vorsichtig auf die seitliche Seite der Maus, um das Gewebe während der folgenden Verfahrensschritte festzuhalten.
- Greife mit einer Pinzette den oberen Rand des in Schritt 1.14 vorgenommenen Schnitts. Während die beiden Enden des Cremaster-Muskels zurückgezogen werden, greifen Sie mit einer weiteren Pinzette in den Hohlraum und fassen Sie den Hoden vorsichtig an.
- Ziehe es durch das Loch im Muskel nach außen. Achten Sie darauf, auf Anzeichen von eingekerbten Blutgefäßen und Blut im Operationsfeld zu achten.
- Der Hoden, die Nebenhoden, der anhaftende Samenstrang und das Blutgefäß werden sichtbar, wenn das Gewebe richtig externalisiert wird.
- In der Nähe des kaudal-dorsalen Endes des Nebenhodens und des Hodens befindet sich ein fibröser Ansatzpunkt des Hodens am Cremaster-Muskel. Rollen Sie das äußere Gewebe seitlich, um diesen Einstichpunkt zu finden. Trennen Sie diese, um eine Schädigung des Muskels zu vermeiden und eine weitere Isolierung und Visualisierung des Gewebes zu ermöglichen. Verwende zwei Pinzettenpaare, um eine Klemm- und Reißtechnik durchzuführen.
- Suchen Sie nach Fettgewebe um den Hoden herum aus dem Leistenfettpolster. Greife mit einer Pinzette nach dem Fettpolster und ziehe es vorsichtig, um es nach außen zu drücken.
- Greifen Sie nicht nach dem Blutgefäß, das entlang des Fettpolsters verläuft, da das Ziehen daran zu Blutungen führen kann.
- Lokalisieren Sie den Samenstrang, die Blutgefäße und das verbleibende Fettpolster, das sich in der Nähe des äußeren Gewebes befindet, und verwenden Sie ein Paar Hämostaten, um es zu klemmen. Halten Sie eine leichte Spannung auf dem distalen Hoden aufrecht und kauterisieren Sie den Samenstrang und die Blutgefäße distal der Hämosteklemme.
- Sobald Sie fertig sind, lösen Sie die Klemme langsam proximal zum kauterisierten Ende und prüfen Sie, ob es Anzeichen von Blutungen gibt. Falls vorhanden, wiederholen Sie diesen Schritt. Es ist hilfreich, eine Pinzette zu verwenden, um eine sanfte Spannung auf das distale Ende des zu kauterisierenden Gewebes zu halten.
- Lassen Sie den abgetrennten Stumpf des Samenstrangs wieder in den Körper zurückziehen. Greife die beiden abgeschnittenen Enden des Cremaster-Muskels und führe sie zusammen. Beurteilen Sie die Größe des Schnitts im Gewebe und verschließen Sie das Gewebe mit resorbierbaren 4-0- oder 5-0-Nähten. Je nach Schnittgröße sind 1 oder 2 Nähte erforderlich. Kürzen Sie die Nahtenden mit einer Nahtschere auf 0,5 cm.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.20 auf der anderen Seite des Hodensacks, um den zweiten Hoden zu entfernen.
- Bereiten Sie sich darauf vor, den Hautschnitt zu schließen.
- Sorgen Sie für eine gute Blutstillung beider Gewebestümpfe. Eine schlechte Hämostase führt zu Restblutungen im Operationsfeld. Wenn dies der Fall ist, lokalisieren Sie die Blutung und kauterisieren Sie. Dies wird durch langsame und vorsichtige Manipulation des Gewebes mit stumpfen Instrumenten vermieden.
- Wenn Blut im Operationsfeld zu sehen ist, verwenden Sie einen sterilisierten Applikator mit Wattespitze, um den Bereich für eine bessere Visualisierung zu trocknen. Verwenden Sie eine Spritze, um Kochsalzlösung auf den Bereich zu tropfen, um Blut oder Flüssigkeit vom Operationsfeld weg zu spülen.
- Ziehen Sie die beiden Seiten des Hautschnitts zusammen, um ihn für den Verschluss vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass die vernähten Enden der Cremaster-Einschnitte nicht in den Hautschnitt hineinragen. Bei Bedarf werden die Enden der Naht weiter gekürzt.
- Schließen Sie die Haut.
- Wenn Sie Wundklammern verwenden, verwenden Sie eine Pinzette, um die Haut abzuschneiden und vom darunter liegenden Gewebe wegzuziehen. Platzieren Sie eine Wundklammer mittig über dem Einschnitt. Prüfen Sie, ob die Haut gut geschnitten ist. Wenn der Schnitt etwas zu groß ist, als dass eine Wundklammer ihn ausreichend schließen könnte, kann chirurgischer Hautkleber auf den oberen und unteren Teil des Schnitts aufgetragen werden.
- Wenn Sie Nähte verwenden, führen Sie die erforderliche Anzahl von Nähten durch die Haut, ohne das darunter liegende Gewebe zu greifen. Diese Art der Inzision erfordert 2-3 einzelne unterbrochene Nähte mit 4-0 nicht resorbierbarem Nahtmaterial.
- Reinigen Sie die Haut um die Operationsstelle herum vorsichtig mit Kochsalzlösung und einem sterilisierten Applikator mit Wattespitze, um getrocknetes Blut oder antiseptisches Peeling zu entfernen.
2. Maus-Ovariektomie
- Bereiten Sie ein aseptisches Arbeitsfeld vor und stellen Sie sicher, dass die erforderlichen chirurgischen Instrumente sterilisiert wurden und leicht verfügbar sind. Befolgen Sie aseptische Praktiken für die Überlebenschirurgie von Nagetieren.
- Erfassen Sie das Gewicht der weiblichen Maus und verabreichen Sie die bevorzugte Anästhesiemethode gemäß den Richtlinien Ihrer Einrichtung. In diesem Protokoll wurden 2% Isofluran über einen Präzisionsverdampfer verabreicht, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Verabreichen Sie vor dem Eingriff Schmerzmittel gemäß den Richtlinien Ihrer Einrichtung. In diesem Protokoll wurden 1,0 mg/kg Buprenorphin SR und 5 mg/kg Meloxicam subkutan verabreicht.
- Verabreichen Sie befeuchtetes Augengel auf die Augen des Tieres, um die Bildung von Augenverletzungen, Hornhautaustrocknung oder Geschwüren zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass eine Wärmequelle zur Verfügung steht, um die Körpertemperatur des Tieres während der Operation aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die richtige Anästhesieebene sicher, indem Sie auf eine Zehenklemmreaktion achten.
- Bereiten Sie den Operationsbereich des Tieres vor, bevor Sie es in das Operationsfeld legen.
- Rasieren Sie die Haare im dorsolateralen Bereich des Rückens des Tieres vorsichtig mit einer Haarschneidemaschine. Entfernen Sie Haare aus dem Bereich oberhalb des oberen Rand der Hüften und unterhalb des unteren Randes des Brustkorbs sowie aus den Bereichen zwischen diesen Orientierungspunkten.
- Tragen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze eine Schicht Enthaarungscreme auf die Haut des Tieres auf und bedecken Sie den Bereich, der gerade rasiert wurde. Warten Sie 30 Sekunden und entfernen Sie die Creme mit einem Stück Gaze, um die verbleibenden feinen Härchen zu entfernen.
- Verwenden Sie einen mit 70 % Ethanol getränkten Mullschwamm, um restliche Creme und Haare aus dem Operationsbereich zu wischen.
HINWEIS: 70% Ethanol in diesem Schritt soll helfen, die Enthaarungscreme vollständig zu entfernen. Die antiseptische Vorbereitung des Operationsfeldes wird in Schritt 2.5 durchgeführt.
- Legen Sie das Tier in die Seitenlage (für den Schnitt, um einen Eierstock nach dem anderen zu entfernen) in das Operationsfeld und stellen Sie sicher, dass eine Wärmequelle zur Verfügung steht. Schrubben Sie den Operationsbereich mit dem chirurgischen Peeling Betadine (oder einem ähnlichen antiseptischen Hautpräparat), gefolgt von 70%igem Alkohol mindestens dreimal, um eine ordnungsgemäße Hautdesinfektion zu gewährleisten. Schrubben Sie bei jedem Peeling in einer radialen Bewegung nach außen, so dass die Mitte des Einschnitts zuerst geschrubbt wird und der äußere Rand des rasierten Operationsbereichs zuletzt geschrubbt wird.
- Ziehen Sie zu diesem Zeitpunkt sterile OP-Handschuhe an. Verwenden Sie für die nächsten Schritte des Verfahrens aseptische Techniken. Legen Sie ein OP-Tuch mit einem kleinen Einschnitt (schneiden Sie ein etwa 0,5-1 Zoll großes Quadrat in das Tuch, damit es in die Operationsstelle passt) über das Tier, so dass der Körper mit Abdeckmaterial bedeckt ist.
- Finden Sie die ideale Stelle für den chirurgischen Schnitt, indem Sie den halben Punkt zwischen den Hüften und Rippen der Maus finden (siehe Abbildung 2). Fassen Sie die Haut mit einer Pinzette an und machen Sie an dieser Stelle einen 1,0 cm langen Schnitt in die Haut.
- Verwenden Sie ein Instrument mit stumpfer Spitze (Sonde, chirurgischer Spatel oder Hämostaten mit stumpfer Spitze), um die Haut vom darunter liegenden Muskelgewebe zu trennen. Nehmen Sie sich Zeit, um dies an den lateralen, oberen und unteren Rändern des Einschnitts zu tun.
- Lokalisieren Sie die dorsolaterale Muskelwand des Bauches. Entfernen Sie bei Bedarf Fettgewebe, das zwischen den Haut- und Muskelschichten liegt. Bei reifen Mäusen ist dieses Fettgewebe stärker ausgeprägt. Bewegen Sie dieses Fettgewebe in Richtung des kaudalen Endes der Maus und legen Sie die Muskelwand frei.
- Fettgewebe wird farblich von der Bauchdecke unterschieden: Fettgewebe erscheint blassweiß und liegt oberflächlicher, während die Bauchdecke rosa erscheint und tiefer liegt als das Fettgewebe.
- Fassen Sie die Bauchdecke mit einer Rattenzahnzange an und machen Sie einen 0,5 cm langen Schnitt hinein.
- Greife einen Rand dieses Einschnitts mit einer Pinzette, greife mit einem zweiten Paar in die Körperhöhle und finde den Eierstock, das Gebärmutterhorn und das Fettpolster. Ziehen Sie diese vorsichtig durch den Einschnitt in der Muskelwand, um den Muskel vom darunter liegenden Gewebe zu trennen und nach außen zu drücken. Lokalisieren Sie den Übergang zwischen dem Gebärmutterhorn und dem Eierstock.
- Durchtrennen Sie den Eierstock, indem Sie eine Quetsch- und Reißtechnik durchführen.
- Platzieren Sie eine Klemme am distalen Ende des Gebärmutterhorns und platzieren Sie die zweite Klemme direkt distal zur ersten. Üben Sie mit beiden Klemmen festen Druck aus und bewegen Sie die weiter entfernte vom Körper weg, wodurch die Verbindung zwischen ihnen abgerissen wird. Um Blutungen und Gewebeschäden zu minimieren, halten Sie die proximale Klemme während dieses Vorgangs stationär und achten Sie darauf, sie nicht auch noch vom Körper wegzuziehen.
- Alternativ können Sie auch einen Kauter verwenden. Verwenden Sie eine Pinzette oder ein Hämostat, um das Gebärmutterhorn genau proximal zum gewünschten Kauterpunkt zu klemmen. Verwende ein Kauterwerkzeug, um das Gewebe zu durchtrennen.
- Lösen Sie vorsichtig und langsam die proximale Klemme und prüfen Sie, ob es Anzeichen von Blutungen gibt.
- Lassen Sie den Gewebestumpf sich in die Körperhöhle zurückziehen. Greife die Bauchdecke und ziehe sie sanft nach oben. Drücken Sie den Gewebestumpf nicht nach innen, da dies die Wahrscheinlichkeit von Blutungen erhöht.
- Lokalisieren Sie die Ränder des Einschnitts in der Muskelwand und bringen Sie sie zusammen, um die Naht vorzubereiten.
- Legen Sie 1-2 einzelne unterbrochene Nähte mit 4-0 resorbierbarem Nahtmaterial in die Bauchmuskelwand. Kürzen Sie die Nahtenden mit einer Nahtschere auf 0,5 cm.
- Schließen Sie den Einschnitt, indem Sie die Haut in ihren natürlichen Ruhezustand zurückkehren lassen und ihn dann nach oben klappen, wobei Sie darauf achten müssen, dass Sie nicht das darunter liegende Gewebe oder die Enden des Nahtmaterials greifen. Platzieren Sie 1-2 Wundklammern auf der umgestülpten Haut. Basierend auf Ihren institutionellen Richtlinien kann die Haut auch mit 4-0 nicht resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen werden.
- Um den anderen Eierstock zu entfernen, ändern Sie die Position der Maus so, dass die andere seitliche Seite nach oben zeigt. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Position der Maus wechseln, um nicht zu viel Druck auf die abgeklippte Haut aus Schritt 2.17 auszuüben.
- Wiederholen Sie auf dieser Seite die Schritte 2.5 - 2.17.
- Reinigen Sie die Haut um die Operationsstelle herum vorsichtig mit Kochsalzlösung und einem sterilisierten Applikator mit Wattespitze, um getrocknetes Blut oder antiseptisches Peeling zu entfernen.
3. Nachsorge
- Verabreichen Sie gemäß den Richtlinien Ihrer Institution bis zu 72 Stunden nach der Operation Schmerzmittel. Dokumentieren Sie den chirurgischen Eingriff der Tiere und notieren Sie das Datum, die Uhrzeit, das verwendete Anästhetikum und das verwendete Analgetikum. Hier werden Buprenorphin mit langsamer Freisetzung und Meloxicam präoperativ verabreicht.
- Nach Abschluss der Operation werden die Tiere in einen sauberen Käfig gebracht, der mit einem trockenen Papiertuch ausgelegt ist. Stellen Sie diesen Käfig zu 2/3 auf eine Wärmequelle und lassen Sie die anderen 1/3 des Käfigs von der Hitze aus. Setzen Sie Mäuse nicht zusammen in einen Käfig, bis sie sich von der Narkose erholt haben.
- Erlaube dem Tier, sich wieder frei im Käfig zu bewegen, bevor du es wieder in einen sauberen Käfig mit normaler Einstreu setzt. Zu diesem Zeitpunkt können Mäuse zusammen untergebracht werden, wenn sich alle von der Narkose erholt haben.
- Stellen Sie in den ersten Tagen nach der Operation sicher, dass feuchte Nahrung und Wasser leicht zugänglich sind. Lege etwas angefeuchtetes Futter auf den Boden des Käfigs. Kontrollieren Sie regelmäßig die Operationsstelle der Maus und suchen Sie nach Anzeichen von Infektionen oder Blutungen.
- Stellen Sie nach der Operation sicher, dass die Mäuse entweder allein oder mit anderen Tieren untergebracht werden, die sich gleichzeitig dem gleichen Eingriff unterzogen haben. Eine Maus, die sich von einer Operation erholt und sich im selben Käfig wie eine Maus ohne Operation befindet, kann eine Gefahr darstellen und sollte vermieden werden.
- Bei Mäusen, die sich einer Ovariektomie unterzogen haben und Wundklammern an den dorsolateralen Seiten des Rückens haben, entfernen Sie alle Nagetier-Iglu-Habitate aus dem Käfig, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass sich die Wundklammer der Maus in der ersten Woche der Heilung am Iglu verfängt.
- Überwachen Sie das Tier alle 12 Stunden während der ersten 72 Stunden der Heilungszeit auf Anzeichen von Infektionen, Schmerzen oder chirurgischen Komplikationen.
- Entfernen Sie die Wundklammern 10-14 Tage nach der Operation mit einem Wundclip-Entferner.
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Representative Results
Das hier vorgestellte Verfahren wird an ein bis drei Monate alten Mäusen im C57BL/6J-Hintergrund durchgeführt. Männliche Mäuse wogen zum Zeitpunkt des Eingriffs 16-28 g und weibliche Mäuse 14-24 g. Dieses Verfahren wurde so optimiert, dass es für Mäuse unterschiedlichen Alters von der Entwöhnung bis zum Erwachsenenalter anwendbar ist.
Bei der chirurgischen Orchiektomie wird ein einzelner Hautschnitt im ventralen Hodensack durchgeführt, wie in Abbildung 1A dargestellt. Beide Hoden werden nacheinander entfernt und durch die Samenleiter und die spermatischen Blutgefäße durchtrennt, was zur Entfernung des Hodens und der daran befestigten Nebenhoden führt (Abbildung 1B). Zu den entfernten Inhalten gehören der Hoden, der Nebenhoden und das Leistenfettpolster, wie in Abbildung 1C dargestellt. Die erfolgreiche Entfernung der Hoden kann durch visuelle Beobachtung des entfernten Gewebes und die Sicherstellung einer guten Blutstillung des Gewebestumpfes vor dem Verschluss der Körperhöhle bestätigt werden. Der Erfolg der Orchiektomie kann durch die Beobachtung von gut erholten Mäusen gemessen werden, die verheilte Inzisionsstellen aufweisen (Abbildung 1D). Mäuse, die sich einer Orchiektomie unterzogen haben, zeigen bereits eine Woche nach dem Eingriff eine Verringerung des im Mäuseserum gemessenen Testosteronspiegels (Abbildung 1E).
Die chirurgische bilaterale Ovariektomie erfolgt durch Schnitte in den linken und rechten Rücken weiblicher Mäuse (Abbildung 2A). Der laterale Schnittzugang kann verwendet werden, wenn nur ein Eierstock entfernt werden soll. Bei diesem Ansatz wird die Bauchdecke eingeschnitten und das Fettpolster der Eierstöcke lokalisiert. Das Fettpolster, der Eierstock, der Eierstockgang und das distale Gebärmutterhorn, wie in Abbildung 2B dargestellt, werden exteriorisiert, gefolgt von der Durchtrennung des distalen Gebärmutterhorns. Diese Technik führt zur Entfernung des Eierstocks und des Eileiters. Der Eierstock und der Eierstockgang können entfernt werden, ohne das distale Gebärmutterhorn einzubeziehen, aber es besteht die Gefahr, dass die verbleibenden Eierstockzellen die Maus weiterhin in Brunstzyklen halten. Die Einbeziehung des distalen Gebärmutterhorns stellt sicher, dass der gesamte Eierstock und der Gang entfernt werden, es zu einer Erschöpfung der Sexualhormone kommt und die Mäuse keinen Zyklus mehr haben. Abbildung 2C zeigt ein Beispiel für die weiblichen Fortpflanzungsorgane von Mäusen, die aus dem Körper seziert wurden. Es ist zu beobachten, dass die Eierstöcke selbst viel kleiner sind als das umgebende Gewebe. Ein Seziergerät oder Lupen helfen bei der Identifizierung dieser Gewebe. Abbildung 2D zeigt die Anatomie der Eierstöcke unter einem Sezierfernrohr, bei dem Gewebe aus dem Uterusfettpolster entfernt wurde, was eine bessere Visualisierung ermöglicht. Der Erfolg dieses Verfahrens kann anhand der Beobachtung von gut erholten Mäusen gemessen werden, die verheilte Inzisionsstellen aufweisen (Abbildung 2E).
Die Ovariektomie ist sicher und effizient, wenn sie schnell und mit minimaler Störung des umliegenden Gewebes durchgeführt wird. Wenn Sie das hier beschriebene Verfahren befolgen, stellen Sie sicher, dass die Haut und der Bauchwandschnitt richtig positioniert sind, was eine schnelle Lokalisierung des Gebärmuttergewebes ermöglicht. Die Identifizierung der unteren Grenze des Brustkorbs und der oberen Grenze der Beinknochen stellt sicher, dass der Schnitt in der Nähe des interessierenden Gewebes erfolgt. Ein Schnitt, der etwa auf halbem Weg zwischen dem unteren Rand der Rippen und dem oberen Rand der Beinknochen liegt und etwa 1,5 cm lateral der Wirbelsäule liegt, ermöglicht eine gute Positionierung des Operationsfeldes bei einem lateralen Inzisionszugang (Abbildung 2A).
Die Bestätigung der chirurgischen Ovariektomie wird durch die Beobachtung der Uterusatrophie gezeigt. Abbildung 2F zeigt ein Gebärmutterhorn, das von einer 6 Monate alten Maus präpariert wurde, während Abbildung 2G ein Gebärmutterhorn einer 6 Monate alten Maus zeigt, die sich im Alter von drei Monaten einer chirurgischen Ovariektomie unterzogen hat. Das ovariektomierte Gebärmutterhorn erscheint dünner und es fehlt der Ansatz zum Eierstock am distalen Ende. Diese Methode der Bestätigung der Operationstechnik zeigt effektiv, dass die Entfernung des Eierstocks zu einer Atrophie des Gebärmuttergewebes geführt hat.
Sobald das Gewebe erfolgreich identifiziert und entfernt wurde, kann die Operation durch den Verschluss der Wunden und eine sorgfältige postoperative Überwachung abgeschlossen werden. Die richtige aseptische Technik14 ist wichtig, um gute Ergebnisse bei der Durchführung von Überlebensoperationen zu gewährleisten. Wenn die Maus beginnt, von den Einschnitten zu heilen, wird eine Überwachung durchgeführt, um nach Anzeichen von Schmerzen und chirurgischen Komplikationen zu suchen. Eine mögliche chirurgische Komplikation sind innere Blutungen, die durch das Stechen oder Einschneiden von Blutgefäßen beim Versuch, das Gewebe zu schneiden oder zu manipulieren, verursacht werden. Dies ist durch ein anhaltendes rotes, gerötetes Erscheinungsbild unter der Haut um die Operationsstelle herum gekennzeichnet. Die Vermeidung solcher Komplikationen wird durch die richtige Lokalisierung der Inzisionsstellen und die Unterstützung des Sehvermögens des Chirurgen durch die Verwendung eines Operationsmikroskops oder einer Lupenbrille erreicht. Eine visuelle Untersuchung wird in den ersten drei Tagen nach der Operation alle 12 Stunden empfohlen. Eine erfolgreiche Operation führt zu sauberen, heilenden Wunden (Abbildung 1D, 2E).
Abbildung 1: Männliche murine Orchiektomie . (A) Eine männliche Maus ist in Rückenlage dargestellt, wobei ein chirurgischer Schnitt in den Hodensack zur Entfernung des Hodens in Rot dargestellt ist. (B) Das während der Orchiektomie aufgenommene Bild zeigt den Ablösungspunkt in Grün. (C) Präparierte Hoden, Fettpolster und Nebenhoden einer männlichen Maus. (D) Eine männliche Maus mit einer gut verheilten Wundklemme über dem Hodensackschnitt nach Orchiektomie. (E) Testosteronkonzentration im Serum der Maus in ng/ml, bestimmt durch ELISA-Interpolation. Beide Gruppen repräsentieren 9 Wochen alte Mäuse. Chirurgische Orchiektomien wurden im Alter von 8 Wochen durchgeführt. N = 3 Mäuse pro Gruppe. Die Proben wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Serumproben wurden durch Herzpunktion entnommen und bis zum Zeitpunkt der Analyse eingefroren. *, S. < 0,05. Fehlerbalken = SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Weibliche Maus-Ovariektomie . (A) Eine weibliche Maus in lateraler Position mit der chirurgischen Inzisionsstelle für die Entfernung eines einzelnen Eierstocks von der dorsalen lateralen Seite, rot dargestellt. Weitere wichtige anatomische Orientierungspunkte werden hervorgehoben. (B) Während der Operation aufgenommenes Bild, das den exteriorisierten Eierstock, den Eileiter und das distale Gebärmutterhorn zeigt, wobei der Ablösungspunkt grün dargestellt ist. (C) Präparierte Gebärmutterhörner, Eierstöcke und Fettpolster einer weiblichen Maus. (D) Eine Nahaufnahme des präparierten Eierstocks, des Eierstockgangs und des distalen Teils des Gebärmutterhorns, wobei das Fett aus dem Fettpolster entfernt wurde, was eine bessere Visualisierung des Eierstocks ermöglicht. (E) Eine weibliche Maus mit einer gut verheilten Wundklemme über dem Einschnitt nach einer Ovariektomie. (F) Präpariertes Gebärmutterhorn einer Maus. (G) Seziertes Gebärmutterhorn der Maus 3 Monate nach der Ovariektomie, mit Gebärmutteratrophie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Graphische Zusammenfassung der murinen Ovariektomie und Orchiektomie. Eine bildliche Darstellung des Orchiektomie-Verfahrens bei männlichen Mäusen mit der Entfernung des Hodens und des Ovariektomie-Verfahrens mit der Entfernung der Eierstöcke, die beide zu einem Sexualhormon-armen Mausmodell führen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die chirurgische Entfernung von Hoden und Eierstöcken ermöglicht es, die Physiologie von Mäusen unter kontrolliertem Hormonentzug zu untersuchen. Diese Technik ist für viele Bereiche der Wissenschaft wichtig, darunter Neurodegeneration, Mineralstoffwechsel, Herz-Kreislauf und reproduktive Gesundheit 15,16,17,18,19,20,21. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die schnelle, sichere und effektive Entfernung von Eierstöcken und Hoden von Mäusen mittels Überlebenschirurgie zum Abbau der Sexualhormone. Wenn diese Eingriffe von einem erfahrenen Chirurgen durchgeführt werden, können sie nur 5 Minuten dauern, was zu einer sehr hohen Überlebensrate bei Mäusen führt.
Zu den Überlegungen bei der Planung einer Mausoperation gehören die beste Inzisionsstelle und die Physiologie des Tieres. Bei der Orchiektomie kann der Maushoden auch durch einen ventralen Mittellinienschnitt durch das Abdomen entfernt werden13. Diese Technik öffnet nicht nur die Bauchhöhle, sondern setzt auch auf die schnelle Identifizierung der Leistenfettpolster. Für neue Chirurgen ist es schwierig, diese Technik schnell durchzuführen. Wenn Mäuse sehr jung sind, sind die Fettpolster auch weniger entwickelt und daher schwieriger zu finden. Der in diesem Protokoll beschriebene Skrotalansatz ist eine geeignete Option für Forscher, die neu in der Mauschirurgie sind, kleine, junge Mäuse operieren oder die Wahrscheinlichkeit minimieren möchten, dass andere Organe in der Bauchhöhle durch einen Bauchschnitt gestört werden.
Bei der chirurgischen Ovariektomie werden ein oder beide Eierstöcke entfernt. Wie bei den meisten chirurgischen Eingriffen besteht die sichere und schnelle Methode in der Regel darin, den Schnitt in die Haut und die darunter liegenden Faszien so klein wie möglich zu machen. Dies ermöglicht eine Reduzierung von Nähten und Wundklammern und eine schnellere Heilung. Während die Fähigkeit, die Einschnitte zu verkleinern, eine Fähigkeit ist, die mit der Übung einhergeht, ist es von Vorteil, sich über die Lage des Einschnitts sicher zu sein. Abbildung 2A zeigt ein Beispiel dafür, wie die besten Inzisionspunkte gefunden werden. Aufgrund der kleinen Anatomie der Maus liegt der Eierstock in der Nähe der Leber und auf der linken Seite der Maus in der Nähe der Milz. Das versehentliche Sondieren und Ziehen an diesen Organen kann zu unerwünschten Blutungen oder Schäden führen. Wir bieten einen detaillierten Leitfaden zur korrekten Inzisionsposition und zur Identifizierung der umliegenden anatomischen Orientierungspunkte, um diese Technik zu unterstützen und die Wahrscheinlichkeit unerwünschter Komplikationen zu verringern.
Hier geben wir ein Beispiel dafür, wie dieses Verfahren verwendet werden kann, um den zirkulierenden Hormonspiegel bei Mäusen weniger als eine Woche nach dem chirurgischen Eingriff effektiv zu senken und wie das verbleibende Gonadengewebe im Laufe der Zeit nach dem Eingriff verkümmert. Bisherige Methoden und Forschungen beschreiben, wie diese durchgeführt werden können, um Mausmodelle für die Menopause oder die Andropause zu generieren, aber viele davon werden in Rattenmodellen und nicht in Mäusen durchgeführt12,22. Während Ratten und Mäuse eine ähnliche Anatomie haben, hat das murine System kleinere anatomische Strukturen. Hier stellen wir eine Methode zur Verfügung, die bereits in Mausmodellen ab einem Alter von 3 Wochen zuverlässig funktioniert. Insgesamt stellen diese beiden Protokolle einen konsistenten Weg dar, um Orchiektomien und Ovariektomien für das Überleben von Nagetieren schnell durchzuführen, die Anatomie der Maus zu erkennen und chirurgische Komplikationen zu minimieren, wodurch eine Grundlage für konsistente und effektive Ergebnisse geschaffen wird.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken dem University of Texas Southwestern Medical Center Animal Resource Center für seine Hilfe bei der chirurgischen Ausbildung und der Überprüfung des Protokolls. Wir danken dem Support-Team von Wert Lab für seine unschätzbare Unterstützung. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des National Institute of Health (NIH P30EY030413) unterstützt. Biorender.com wurde für die Erstellung von Cartoon-Schaltplänen verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
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