Summary
यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल मज़बूती से एक पूर्व विवो छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर ठंड संरक्षण के बाद दाता दिल के सही और बाएँ वेंट्रिकुलर समारोह यों करने के लिए है.
Abstract
प्राथमिक ग्राफ्ट डिसफंक्शन (पीजीडी) हृदय प्रत्यारोपण के बाद प्रारंभिक मृत्यु का प्रमुख कारण बना हुआ है। ठंड संरक्षण के दौरान लंबे समय तक इस्केमिक समय पीजीडी के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है, और ठंड संरक्षण के बाद दाता हृदय की कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए हृदय समारोह का विश्वसनीय मूल्यांकन आवश्यक है। साथ में वीडियो विभिन्न अवधि के लिए ठंड संरक्षण के बाद एक Langendorff मॉडल में आधारित पूर्व विवो छिड़काव का उपयोग कर murine सही और छोड़ दिया वेंट्रिकुलर समारोह का आकलन करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है. संक्षेप में, हृदय को अलग किया जाता है और एक ठंडे हिस्टिडाइन-ट्रिप्टोफैन-किटोग्लूटारेट (एचटीके) समाधान में संग्रहीत किया जाता है। फिर, दिल 60 मिनट के लिए एक Langendorff मॉडल में एक क्रेब बफर के साथ perfused है. एक सिलिकॉन गुब्बारा बाएं और दाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है, और कार्डियक फंक्शनल पैरामीटर दर्ज किए जाते हैं (डीपी / डीटी, दबाव-मात्रा संबंध)। यह प्रोटोकॉल विभिन्न हृदय संरक्षण प्रोटोकॉल के बाद हृदय समारोह के विश्वसनीय मूल्यांकन की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह तकनीक विशेष रूप से देशी हृदय कोशिकाओं में हृदय संरक्षण प्रतिक्रियाओं के अध्ययन की अनुमति देती है। बहुत छोटे murine दिल का उपयोग पीजीडी के तंत्र की जांच करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों की एक विशाल सरणी तक पहुंच की अनुमति देता है।
Introduction
हृदय प्रत्यारोपण अंतिम चरण के दिल की विफलता वाले रोगियों में जीवित रहने और जीवन की गुणवत्ता में सुधार करताहै 1. दुर्भाग्य से, हृदय दाताओं की कमी रोगियों की संख्या को सीमित करती है जो इस चिकित्सा से लाभ उठा सकते हैं और चिकित्सकों की क्षमता को सीमित करते हैं ताकि वे प्राप्तकर्ताओं के साथ दाताओं का बेहतर मिलान कर सकें 2,3,4. इसके अलावा, नई आवंटन प्रणाली ने लंबे समय तक इस्केमिक समय में योगदान दिया है और 2018 के बाद से सीमांत दाताओं के उपयोग में काफी वृद्धि हुईहै। नतीजतन, हृदय दाताओं की औसत आयु और इस्केमिक समय समय के साथ बढ़ रहा है, जिससे हृदय संरक्षण के लिए रणनीतियों में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूद प्राथमिक ग्राफ्ट डिसफंक्शन (पीजीडी) की उच्च दर हो रही है।
पीजीडी बाएं, दाएं या दोनों निलय को प्रभावित कर सकता है, और एक जीवन-धमकाने वाली जटिलता बनी हुई है जो हृदय प्रत्यारोपण के बाद शुरुआती मौतों के प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करती है। पीडीजी के तंत्र की जांच करना और बेहतर हृदय संरक्षण के लिए रणनीतियों का विकास महत्वपूर्ण विचार हैं, हृदय प्राप्तकर्ताओं पर संभावित जीवन-बचत प्रभाव को देखते हुए। इसलिए, प्रयोगात्मक मॉडल जो लंबे समय तक भंडारण समय के बाद दाता हृदय समारोह के एक मजबूत और विश्वसनीय मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, पीजीडी की हमारी समझ को बढ़ाने और उपन्यास चिकित्सा के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए आवश्यक हैं। माउस दिल में कार्डियक फ़ंक्शन का सही आकलन करने की क्षमता ट्रांसजेनिक म्यूरिन मॉडल के विशाल प्रदर्शनों की सूची तक पहुंच की अनुमति देती है जो पीजीडी तंत्र की सटीक पहचान कर सकती है।
शारीरिक और औषधीय अध्ययन में, Langendorff प्रतिगामी छिड़काव मॉडल व्यापक रूप से दिल समारोह7 का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विशेष रूप से, कार्डियक प्रदर्शन का पता बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) गुहा के भीतर एक दबाव ट्रांसड्यूसर से जुड़े एक सिलिकॉन गुब्बारे द्वारा लगाया जाता है। पीजीडी की एक प्रमुख विशेषता वेंट्रिकुलर मांसपेशियों का अपर्याप्त संकुचन और विश्राम है। पूर्व Langendorff अध्ययन LV कार्यात्मक मूल्यांकन 8,9,10 में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम का उत्पादन करने के लिए एक LV गुब्बारे का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, गुब्बारा प्रणाली का उपयोग करके सही वेंट्रिकुलर (आरवी) फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए एक इंट्राकैविटरी गुब्बारे का उपयोग कम अच्छी तरह से पहचाना जाता है।
प्रत्यारोपण11 के बाद आरवी को शामिल करने वाली एक महत्वपूर्ण पीजीडी दर को देखते हुए, एलवी और आरवी फ़ंक्शन दोनों का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों से आरवी पीजीडी में योगदान करने वाले आणविक और शारीरिक तंत्र को निर्धारित करने में मदद मिलेगी। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि intracavitary सिलिकॉन गुब्बारे एक ही murine दिल12 में LV और RV समारोह के विश्वसनीय आकलन प्रदान कर सकते हैं. पीजीडी अध्ययन में लैंगेंडॉर्फ प्रणाली के संभावित उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए, हमने भंडारण की विभिन्न अवधियों के साथ हृदय कार्यों की जांच की और पाया कि मुराइन दिलों के लंबे समय तक ठंडे भंडारण के साथ संकुचन और विश्राम में हृदय समारोह में कमी आई है। दिलचस्प बात यह है कि एलवी में आरवी की तुलना में अधिक कार्यात्मक कमी है। सारांश में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल दोनों एलवी और आरवी समारोह पर एक उम्मीदवार दवा और आणविक रास्ते के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. murine दिलों पर इस पद्धति का उपयोग करने की क्षमता विस्तृत यंत्रवत अध्ययन के प्रदर्शन की सुविधा होगी.
Protocol
इस प्रोटोकॉल में सभी पशु प्रयोगों मिशिगन विश्वविद्यालय, एन आर्बर में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी चूहों को रोगजनक मुक्त कमरों में 12:12 प्रकाश चक्र में रखा गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, जानवरों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।
1. सिलिकॉन बैलून कैथेटर का निर्माण
नोट: सिलिकॉन गुब्बारा पहले वर्णित13 के रूप में बनाया गया है।
- आसुत जल के 9.5 एमएल, हल्के मकई सिरप के 14.2 एमएल, और सुक्रोज के 33.8 ग्राम एक 100 एमएल बीकर के लिए जोड़ें. गर्म करें और घोल को तब तक हिलाएं जब तक कि चीनी पूरी तरह से घुल न जाए।
- 10 ग्राम गेहूं का आटा और 5 ग्राम पानी मिलाकर आटा तैयार करें जब तक कि एक समान स्थिरता प्राप्त न हो जाए और इसे 10 मिनट तक आराम करने दें।
- आटे के एक छोटे टुकड़े को अंडाकार "सिर" में आकार दें - और इसे सूखे स्पेगेटी स्ट्रैंड के अंत में संलग्न करें। फिर, इस सिर को चीनी के घोल में डुबोएं और धीरे-धीरे घोल से हटा दें, क्योंकि सिर अब पूरी तरह से लेपित हो गया है।
नोट: आटा चिकना और समान बनावट का होना चाहिए। 5 मिमी (छोटा व्यास) से 7 मिमी (लंबा व्यास) तक विभिन्न आकारों के गुब्बारे उत्पन्न करने के लिए आटा के आकार अलग-अलग हो सकते हैं। उन्हें चीनी समाधान की एक पतली फिल्म के साथ कवर करने की कोशिश करें। - स्पेगेटी स्ट्रैंड को पॉलीस्टायर्न फोम ब्लॉक, या अन्य धारकों पर निलंबित करें, सिर पर समान रूप से एक चमकदार कवर बनाने और रात भर सूखने के लिए।
- मोल्ड को सिलिकॉन फैलाव (सिलिकॉन इलास्टोमेर xylene में छितरी हुई) में डुबोएं। स्पेगेटी स्ट्रैंड को पॉलीस्टायर्न फोम ब्लॉक में 2 घंटे के लिए या सूखने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें। इस चरण को एक बार दोहराएं।
नोट: हवा के संपर्क के कारण सिलिकॉन फैलाव जेल को ऑक्सीकरण से रोकने के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह एक असमान गुब्बारे की मोटाई उत्पन्न करेगा। - गुब्बारे को अलग करने और इकट्ठा करने के लिए मोल्ड को पानी में रखें। गुब्बारे को 0.02% सोडियम एज़ाइड में स्टोर करें।
- 22 जी सुई से दो-ब्लंट-एंड टिप काटें; सिलिकॉन गुब्बारे के लिए एक कुंद अंत और पीई टयूबिंग के लिए एक और कुंद अंत माउंट। सुई पर गुब्बारे को जगह में बांधने के लिए 4-0 रेशम का उपयोग करें।
नोट: इसमें पानी इंजेक्ट करके गुब्बारे की अखंडता का परीक्षण करें। एक बार गुब्बारा भर जाने के बाद, गुब्बारे को धीरे से दबाएं ताकि यह जांचा जा सके कि गुब्बारा अंदर तनाव बनाए रखता है या नहीं। यदि यह लीक हो रहा है तो एक नए गुब्बारे का उपयोग करें। घुड़सवार गुब्बारे भविष्य में उपयोग के लिए संग्रहीत किए जा सकते हैं।
2. हृदय छिड़काव प्रणाली की तैयारी
- Krebs-Henseleit (केएच) छिड़काव बफर के 1 एल बनाओ और यह पानी जलाशय Langendorff प्रणाली के लिए हस्तांतरण.
- एयर ट्यूब को जलाशय से कनेक्ट करें और कम से कम 5 मिनट के लिए केएच बफर को 2% सीओ 2 और 95% ओ2 के साथ संतुलित करने के लिए एयरफ्लो चालू करें।
- 41.5 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान सेट करें और सिस्टम और केएच बफर को गर्म करने के लिए लैंगेंडॉर्फ सिस्टम की बाहरी परत में पानी प्रसारित करें।
नोट: पानी के स्नान के तापमान को प्रत्येक प्रणाली के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस प्रणाली के लिए, पानी के स्नान का तापमान दिल में छिद्रित होने पर केएच को 37-37.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखेगा।
3. अलगाव, बढ़ते, और माउस दिल के cannulating
- एंटीकोआग्यूलेशन के लिए, इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा खारा में हेपरिन की 200 इकाइयों को सी 57/बी 6 माउस पेट के दाहिने हाथ के चतुर्थांश में इंजेक्शन दिया जाता है। इंजेक्शन से पहले सिरिंज को एस्पिरेट करें ताकि सुइयों की बेवल की पुष्टि हो सके कि जीआई पथ के मूत्राशय या लुमेन में नहीं है। प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत में कम से कम चार चूहों का प्रयोग करें (लेकिन यह भी उपचार प्रभाव के आकार पर विचार).
- 30 मिनट के बाद, माउस को संवेदनाहारी करने के लिए 80 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 10 मिलीग्राम / किग्रा xylazine आईपी का प्रशासन करें। जांचें कि क्या एनेस्थेटाइज्ड माउस एक पैर की अंगुली चुटकी करके बेहोश है और यह सुनिश्चित करना कि कोई प्रतिक्रिया नहीं देखी गई है। Acepromazine 2mg/kg को केट/xyl कॉकटेल में जोड़ा जा सकता है यदि चूहों का इस्तेमाल किया गया तनाव केवल केट/xyl के साथ एनेस्थीसिया के पर्याप्त स्तर तक नहीं पहुंचता है।
- उरोस्थि के ठीक नीचे एक चीरा लगाएं। डायाफ्राम और पसलियों को काटकर छाती को खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें। छाती को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए पूर्वकाल छाती की दीवार को मोड़ो। अवरोही महाधमनी (महाधमनी मेहराब के लिए बंद) पर काटें। दिल स्थानांतरण, फेफड़े, और ठंड histidine-tryptophan-ketoglutarate करने के लिए माउस के थाइमस (HTK) बफर. बर्फ-ठंडे एचटीके बफर के तहत अंगों को अलग करें। किसी भी संयोजी ऊतकों को हटाकर महाधमनी का पर्दाफाश करें।
नोट: एक सुई से कनेक्ट करने के लिए पर्याप्त स्थान की अनुमति देने के लिए छांटना में आरोही महाधमनी और महाधमनी चाप क्षेत्र दोनों को शामिल करके महाधमनी की लंबाई को अधिकतम करें।
- महाधमनी के अंत को 22 जी सुई से कनेक्ट करें, और 6-0 रेशम सिवनी के साथ टाई करें। सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी महाधमनी जड़ से ऊपर है ताकि महाधमनी वाल्व के साथ हस्तक्षेप न करें। लगभग 10 मिनट में 10 एमएल ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) एचटीके बफर के साथ महाधमनी छिड़कना।
नोट: यह कम से कम 15 महाधमनी के cannulation करने के लिए दिल को हटाने से मिनट लेता है; हालांकि, छिड़काव की गति को उचित स्तर पर रखना महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन जो बहुत तेज और जोरदार होते हैं, उच्च दबाव उत्पन्न कर सकते हैं और संवहनी/हृदय संबंधी क्षति का कारण बन सकते हैं। - 8 घंटे के लिए बर्फ-ठंडे एचटीके के साथ 50 एमएल ट्यूब में दिल को स्टोर करें या तुरंत छिड़काव करें (नियंत्रण को स्टोर न करें) और बर्फ के साथ सीधे संपर्क से बचें।
नोट: बर्फ के साथ हृदय के ऊतकों के सीधे संपर्क से ठंड की चोट लग सकती है। - सुई घुड़सवार दिल Langendorff तंत्र में प्रवेशनी के लिए कनेक्ट और एक रेशम सिवनी के साथ टाई.
नोट: प्रक्रिया को मानकीकृत करने के लिए, छिड़काव से पहले कैनुलेशन प्रक्रिया के लिए कुल 3 मिनट तक प्रतीक्षा करें। - 3 एमएल / मिनट पर एक निरंतर प्रवाह मोड के साथ छिड़काव शुरू; फिर, 70-80 mmHg पर निरंतर दबाव मोड में बदलें और ~ 6 एमएल / मिनट के लिए दिल को समायोजित करें।
नोट: दिल को धीरे से सहलाना कार्डियक रीएनिमेशन में तेजी लाने में मदद कर सकता है। छिड़काव प्रवाह दर निरंतर दबाव मोड पर 6 एमएल / मिनट से बहुत अधिक है, तो वहाँ cannulation में एक रिसाव हो सकता है या महाधमनी वाल्व ठीक से काम नहीं किया जा सकता है. रिसाव को ठीक करने के लिए कनेक्शन समायोजित करें। निरंतर प्रवाह मोड हृदय के संवहनी स्वर आत्म-नियमन को ओवरराइड करता है। निरंतर दबाव मोड दिल को अपने कोरोनरी छिड़काव प्रवाह को विनियमित करने की अनुमति देता है। इसलिए, निरंतर दबाव मोड हृदय के हृदय समारोह और संरक्षण की गुणवत्ता को ठीक से मापेगा। - एक डिफ्लेटेड, पानी से भरे गुब्बारे को एक दबाव ट्रांसड्यूसर और तीन-तरफा नल के साथ पानी से भरे सिरिंज से कनेक्ट करें। 15-20 मिनट संतुलन अवधि के बाद, सही आलिंद (आरए) में कटौती और आरए के माध्यम से आरवी के लिए गुब्बारा डालें। आरवी के अंदर गुब्बारे को पकड़ने के लिए टेप का उपयोग करें। वेंट्रिकल में गुब्बारे को बाधित करने में मदद करने के लिए आरए के खुले क्षेत्र को कम से कम करें (सेटअप के लिए चित्र 1 देखें)।
नोट: संतुलन की अवधि आवश्यक है, क्योंकि शुरुआत में हृदय संकुचन और विश्राम स्थिर नहीं होते हैं, और माप कम सटीक और प्रतिनिधि होता है। यदि आरए के उद्घाटन के दौरान एवी नोड क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो हृदय लगातार अतालता प्रदर्शित करेगा। - आरवी कार्यात्मक डेटा संग्रह के 20 मिनट के बाद, बाएं आलिंद (एलए) को काटें और एलए के माध्यम से एलवी में एक डिफ्लेटेड पानी से भरा गुब्बारा डालें। LV के अंदर गुब्बारे को पकड़ने के लिए टेप का उपयोग करें।
नोट: हृदय को 1.5 घंटे से अधिक समय तक स्थिर हेमोडायनामिक्स बनाए रखना चाहिए।
4. कार्यात्मक डेटा रिकॉर्डिंग
- दबाव ट्रांसड्यूसर का अंशांकन
- गर्म खारा के साथ एक 10 एमएल सिरिंज भरें और तीन तरह से नल के माध्यम से गुंबद को सिरिंज कनेक्ट. नल खोलें और धीरे-धीरे खारा के साथ गुंबद भरें, और फिर सभी नल बंद करें और सिरिंज को हटा दें। भरे हुए गुंबद को ट्रांसड्यूसर से संलग्न करें; दबाव नापने का यंत्र को तीन-तरफ़ा नल के तीसरे छोर से कनेक्ट करें।
- रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में, चुनें ब्रिज Amp ट्रांसड्यूसर से कनेक्ट करने वाले चैनल के ड्रॉपडाउन मेनू से। चैनल Perfused दबाव के रूप में नाम बदलें. ट्रांसड्यूसर को शून्य करने के लिए शून्य पर क्लिक करें।
- स्टार्ट पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू करें ताकि ट्रांसड्यूसर अब 0 mmHg पढ़ रहा हो। रिकॉर्डिंग के कई सेकंड के बाद, धीरे धीरे सिरिंज धक्का और 100 के लिए दबाव में वृद्धि. रिकॉर्डिंग बंद करने के लिए स्टॉप पर क्लिक करें।
- इकाई रूपांतरण संवाद में, 0 mmHg के लिए रिकॉर्डिंग के क्षेत्र का चयन करें और बिंदु 1 पर तीर पर क्लिक करें और 0 mmHg टाइप करें। 100 mmHg के लिए रिकॉर्डिंग के क्षेत्र का चयन करें, बिंदु 2 पर तीर पर क्लिक करें, और 100 mmHg टाइप करें। ट्रांसड्यूसर को कैलिब्रेट करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
- वेंट्रिकल दबाव के रूप में गुब्बारे के साथ दबाव ट्रांसड्यूसर के अनुरूप चैनल का नाम बदलें। रिकॉर्डिंग शुरू करें जब दिल सिस्टम से जुड़ा हो। वेंट्रिकल में गुब्बारा डालने के बाद, 5-10 mmHg पर अंत-डायस्टोलिक दबाव बनाए रखने के लिए तीन-तरफा नल के माध्यम से माइक्रोमीटर सिरिंज का उपयोग करके गुब्बारे में पानी की मात्रा को समायोजित करें।
नोट: माप के दौरान अंत-डायस्टोलिक माप कम हो सकता है, अधिमानतः 10 मिमीएचजी के करीब शुरू हो सकता है। - dP/dt के रूप में एक खाली चैनल का नाम बदलें। ड्रॉपडाउन मेनू से, वेंट्रिकल प्रेशर के रूप में व्युत्पन्न | स्रोत चैनल का चयन करें। चैनल संकुचन अवधि के दौरान वेंट्रिकुलर गुहा में दबाव परिवर्तन के अनुपात को रिकॉर्ड करेगा।
- माप की एक स्थिर अवधि का चयन करें, फिर रक्तचाप मॉड्यूल पर सेटिंग पर क्लिक करें।
- इनपुट चैनल के रूप में वेंट्रिकल दबाव का चयन करें और गणना की अवधि के लिए चयन पर क्लिक करें | ठीक पर टैप करें.
- बाहरी कार्डियक चक्र (जैसे, असामान्य चक्र समय या दबाव) को हटाने के लिए क्लासिफ़ायर दृश्य पर क्लिक करें।
- चयनित अवधि के लिए अधिकतम डीपी/डीटी (संकुचन) और न्यूनतम डीपी/डीटी (विश्राम) के औसत की तालिकाएं उत्पन्न करने के लिए तालिका दृश्य पर क्लिक करें।
नोट: प्रत्येक नमूने के लिए रिकॉर्डिंग फ़ाइल स्टोर करें और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए औसत हृदय समारोह की तालिका को बचाएं।
Representative Results
वयस्क C57Bl/6 माउस दिल, 3 महीने की उम्र, काटा गया और लैंगेंडोर्फ प्रणाली पर लगाया गया। दाता दिल एचटीके में 0 और 8 घंटे के लिए संग्रहीत किया गया था, और फिर ऑक्सीजन युक्त केएच बफर के साथ perfused था। एक दबाव ट्रांसड्यूसर से जुड़ने वाले एक सिलिकॉन गुब्बारे का उपयोग एलवी और आरवी फ़ंक्शन के संकुचन और विश्राम को मापने के लिए किया गया था।
महाधमनी दबाव 70-80 mmHg रेंज में बनाए रखा गया था। हृदय गति 0 और 8 घंटे के भंडारण के साथ माउस दिलों में तुलनीय थी। एलवी और आरवी फ़ंक्शन की जांच सिस्टोलिक और डायस्टोलिक दबाव को मापकर की गई थी। dP/dt, दबाव परिवर्तन के अनुपात की गणना करने के लिए एक व्युत्पन्न, दबाव गतिशीलता को निर्धारित करने के लिए गणना की गई थी। अधिकतम डीपी/डीटी और न्यूनतम डीपी/डीटी की पूर्ण संख्या मांसपेशियों के संकुचन और विश्राम के स्तर का प्रतिनिधित्व कर सकती है। भंडारण के 0 घंटे में, एलवी में आरवी(चित्रा 2सी और चित्रा 3ए)की तुलना में उच्च सिस्टोलिक दबाव था। एलवी ने 0 एच भंडारण(चित्रा 2सी) और चित्रा 3बी,सी) के छिड़काव के बाद आरवी की तुलना में अधिक मांसपेशियों के संकुचन और विश्राम दिखाया। हालांकि, कोल्ड स्टोरेज के 8 घंटे के बाद, एलवी और आरवी दोनों ने 0 घंटे बेसलाइन(चित्रा 2ए-डी और चित्रा 3बी,सी)की तुलना में एक महत्वपूर्ण कार्यात्मक कमी दिखाई। हृदय संकुचन में कमी एलवी में अधिक गंभीर थी। भंडारण के 8 घंटे के बाद, एलवी का संकुचन और विश्राम 0 घंटे बेसलाइन का 25.1% और 30.7% था, जबकि आरवी में 0 एच बेसलाइन(चित्रा 3बी,सी)की तुलना में 32.5% और 29.1% फ़ंक्शन था। इन परिणामों से पता चला कि लंबे समय तक भंडारण के बाद एलवी के पीजीडी में आरवी की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण हृदय संकुचन में कमी आई थी।
चित्रा 1: बढ़ते और माउस दिल के cannulation . (ए) छिड़काव सेटअप के समग्र सेटअप. 1. छिड़काव जलाशय। 2. ऑक्सीजन कक्ष। 3. एयर ट्रैप चैंबर। 4. हृदय कक्ष। 5. निरंतर प्रवाह और दबाव के लिए मूल्य स्विच। 6 और 7. ऑक्सीजन का प्रवाह। (बी) सामने आरवी के साथ कैनुलेट दिल। (सी) आरवी की स्थिति इसकी गुहा खोलने के लिए कटौती करने के लिए। (डी) प्रवेशनी के साथ गुब्बारा ट्यूब ठोकर. संक्षिप्त: RV = दायां वेंट्रिकल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एलवी बनाम आरवी के कार्य की तुलना करना। (ए) भंडारण के 0 घंटे के साथ दाता दिल में आरवी और एलवी में अधिकतम और न्यूनतम डीपी/डीटी के अनुरेखण रिकॉर्ड। (बी) भंडारण के 8 घंटे के साथ दाता दिल में आरवी और एलवी में अधिकतम और न्यूनतम डीपी / (सी, डी) डीटी, एलवी दबाव, हृदय गति, और 0 घंटे और 8 घंटे में एलवी और आरवी में छिड़काव दबाव का विवरण। संक्षिप्ताक्षर: RV = दायां वेंट्रिकल; LV = बायाँ वेंट्रिकल; dP/dt = दबाव-समय संबंध। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: भंडारण और छिड़काव के बाद एलवी बनाम आरवी के कार्य की तुलना। (ए) भंडारण के 0 घंटे और 8 घंटे के बाद एलवी और आरवी के सिस्टोलिक और डायस्टोलिक दबाव। (बी) अधिकतम डीपी/डीटी और (सी) 0 घंटे और 8 घंटे भंडारण के साथ छिड़काव के बाद एलवी और आरवी के न्यूनतम डीपी/डीटी। यह आंकड़ा लेई एट अल 12 से है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यह प्रोटोकॉल महाधमनी कैनुलेशन के माध्यम से प्रतिगामी छिड़काव Langendorff विधि का वर्णन करता है। इस तकनीक का उपयोग कोल्ड स्टोरेज के बाद murine दिलों के LV और RV फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। परिणाम बताते हैं कि दाता दिलों के लंबे समय तक कोल्ड स्टोरेज इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एलवी और आरवी दोनों में कार्डियक फ़ंक्शन को कम करता है।
हृदय प्रत्यारोपण के बाद तीव्र और पुरानी अस्वीकृति के अध्ययन व्यापक रूप से इम्यूनोबायोलॉजी14 पर ध्यान केंद्रित करते हैं। कोल्ड स्टोरेज के दौरान पीजीडी पर देशी कोशिकाओं के प्रभावों की कम अच्छी तरह से जांच की जाती है। पीजीडी ~ 10% -20% हृदय प्रत्यारोपण में होता है और प्रत्यारोपण के बाद 30 दिनों के भीतर 66% प्रारंभिक मृत्यु के लिए जिम्मेदार है। विशेष रूप से, एलवी बनाम आरवी को प्रभावित करने वाले पीजीडी की घटनाएं प्रत्यारोपण11 के बाद भिन्न होती हैं। प्राप्तकर्ता सेलुलर प्रतिक्रियाओं के योगदान के बिना, यह पूर्व विवो विधि दाता दिलों के ठंडे संरक्षण के बाद पीजीडी में देशी हृदय कोशिकाओं के योगदान पर केंद्रित है। आगे के अध्ययन में म्यूरिन हृदय प्रत्यारोपण मॉडल में प्राप्तकर्ता प्रतिक्रियाओं को शामिल किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, ठंड संरक्षित दाता दिल के Langendorff छिड़काव सेलुलर प्रतिरक्षा घुसपैठ के बिना गर्म क्रिस्टलीय छिड़काव करने के लिए देशी हृदय प्रतिक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई महत्वपूर्ण चरणों को मानकीकृत किया गया था। माउस दिलों को एचटीके समाधान का उपयोग करके गिरफ्तार किया गया था और नैदानिक अभ्यास के समान बर्फ-ठंडे एचटीके में संग्रहीत किया गया था। छिड़काव मात्रा और हर दिल के लिए HTK समाधान के जलसेक समय बारीकी से एक टाइमर के साथ निगरानी की गई थी. दाता दिल एक 4 डिग्री सेल्सियस कमरे में HTK युक्त बर्फ पर prechilled ट्यूबों में रखा गया था. Cannulation समय छिड़काव से पहले ~ 3 मिनट के लिए मानकीकृत है. इन सभी कदमों ने सुनिश्चित किया कि ठंड संरक्षण अवधि अध्ययन में प्रमुख चर थी।
~ 20 मिनट के लिए अनियमित हृदय सिकुड़न की अवधि आमतौर पर छिड़काव की शुरुआत में देखा गया था. इस संतुलन और वसूली की अवधि को क्रमिक वार्मिंग और हृदय के ऊतकों के ऑक्सीकरण द्वारा सुगम बनाया गया था। प्रारंभिक 20 मिनट के बाद अपेक्षाकृत स्थिर अवधि की उम्मीद थी। गुब्बारे प्रारंभिक संतुलन अवधि के बाद ~ 18 मिनट में वेंट्रिकल गुहा में डाला गया था. गुब्बारा डालने के बाद हमने ~ 25 मिनट के लिए दिल स्थिर होने के बाद हेमोडायनामिक्स रिकॉर्ड करना शुरू कर दिया। केएच बफर के साथ छिड़काव ~ 1.5-2 घंटे के लिए स्थिर हृदय प्रदर्शन बनाए रखा। इसलिए हम बाएं और दाएं निलय में से प्रत्येक में 20 मिनट के लिए हेमोडायनामिक्स रिकॉर्ड करने के लिए चुने गए।
कोल्ड स्टोरेज के बाद दिल के पीजीडी का अध्ययन करने के लिए प्रतिगामी छिड़काव की कई सीमाएं हैं। सबसे पहले, गुब्बारे के आकार और प्रत्येक वेंट्रिकुलर गुहा (विशेष रूप से, आरवी) में जगह की कमी के कारण, एलवी और आरवी दोनों में दो गुब्बारे का एक साथ सम्मिलन बहुत चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, हम RV और LV के कार्य को क्रमिक रूप से मापते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम बाएं और दाएं वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन दोनों में महत्वपूर्ण योगदान देता है। पट सही वेंट्रिकुलर समारोह के ~ 50% करने के लिए योगदान देता है, तो वहाँ अंतः निलय निर्भरता15 है. यह भी ध्यान दें कि Langendorff डिवाइस में murine दिल के reperfusion के लिए प्रक्रियाओं ~ 3 मिनट ले, अपेक्षाकृत गर्म शल्य चिकित्सा क्षेत्र में मानव हृदय के शल्य चिकित्सा आरोपण ~ 45 मिनट लेता है कि, ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है. इसकी तुलना में, इस लैंगेंडॉर्फ प्रणाली में म्यूरिन दिल कम इस्केमिक समय लगाता है। नैदानिक अनुवाद पर विचार करते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए।
चूंकि हमने रक्त के बिना दिल को छिड़कने के लिए केएच बफर का उपयोग किया था, इसलिए इससे ऑक्सीजन वितरण में भी कम दक्षता हो सकती है। हालांकि, छिड़काव के प्रारंभिक 1.5-2 घंटे के माध्यम से हृदय समारोह अपेक्षाकृत स्थिर है, इस प्रकार विश्वसनीय हेमोडायनामिक माप की अनुमति देता है। दुर्भाग्य से, वर्तमान में इन छोटे murine दिल के लिए कोई व्यवहार्य काम दिल छिड़काव मॉडल हैं, और वेंट्रिकुलर लोड हो रहा है के प्रभाव इस प्रणाली में मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है. इसके बावजूद, छिड़काव प्रणाली प्रत्यारोपण मॉडल की तुलना में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कम श्रम-गहन और समय लेने वाली है। यह प्रत्यारोपण अध्ययनों की तुलना में भी कम खर्चीला है, जो इसे विभिन्न चिकित्सीय विकल्पों और विभिन्न आणविक मार्गों की जांच के लिए अधिक उपयुक्त बना सकता है। उम्मीदवार दवाओं को जोड़कर संरक्षण समाधान में संशोधन के साथ, इस मंच का उपयोग एलवी और आरवी दोनों में पीजीडी को कम करने पर औषधीय एजेंटों के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
कोई नहीं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
| 6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
| All purpose flour | Kroger | ||
| BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
| Corn Syrup | Kroger | ||
| Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
| Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
| Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
| Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
| PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Xylazine | Sigma | X1126 |
References
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