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Biology

केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए माइक्रोबियल रूप से विविध, प्राकृतिक जैसे वातावरण के रूप में कंपोस्ट माइक्रोकॉसम

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64393
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

Summary

कंपोस्ट सूक्ष्म जगत प्रकृति में पाए जाने वाले माइक्रोबियल विविधता को प्रयोगशाला में लाते हैं ताकि केनोरहाब्डिस एलिगेंस में माइक्रोबायोम अनुसंधान की सुविधा मिल सके। यहां सूक्ष्म जगत प्रयोगों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल दिए गए हैं, प्रयोगों ने पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता और कृमि आंत माइक्रोबायोम संरचना के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता को संशोधित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है।

Abstract

नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबानों और उनके आंत माइक्रोबायोम के बीच अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभर रहा है। जबकि अच्छी तरह से विशेषता वाले बैक्टीरिया या परिभाषित जीवाणु समुदायों के साथ प्रयोग आणविक तंत्र के विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, उनके प्राकृतिक माइक्रोबियल संदर्भ में नेमाटोड का अध्ययन ऐसे तंत्र की विविधता की खोज के लिए आवश्यक है। इसी समय, जंगल से कीड़े का अलगाव हमेशा संभव नहीं होता है, और, यहां तक कि जब संभव हो, जंगल से नमूना लेना सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए अन्यथा उपलब्ध आनुवंशिक टूलकिट के उपयोग को प्रतिबंधित करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल माइक्रोबियल रूप से विविध और प्राकृतिक जैसे वातावरण में इन-लैब विकास के लिए कम्पोस्ट माइक्रोकॉसम का उपयोग करके माइक्रोबायोम अध्ययन के लिए एक विधि का वर्णन करता है।

स्थानीय रूप से सोर्स की गई मिट्टी को माइक्रोबियल समुदायों में विविधता लाने के लिए उपज से समृद्ध किया जा सकता है जिसमें कीड़े उठाए जाते हैं और जिनसे उन्हें बाद के विश्लेषणों के लिए काटा, धोया और सतह-निष्फल किया जाता है। प्रतिनिधि प्रयोग एक आम मिट्टी में माइक्रोबियल समुदाय को विभिन्न उपज के साथ समृद्ध करके संशोधित करने की क्षमता प्रदर्शित करते हैं और आगे प्रदर्शित करते हैं कि इन अलग-अलग वातावरणों में उठाए गए कीड़े अपने संबंधित वातावरण से अलग समान आंत माइक्रोबायोम को इकट्ठा करते हैं, जो एक प्रजाति-विशिष्ट कोर आंत माइक्रोबायोम की धारणा का समर्थन करते हैं। कुल मिलाकर, खाद सूक्ष्म जगत सिंथेटिक माइक्रोबियल समुदायों या जंगली नेमाटोड के अलगाव के विकल्प के रूप में माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए प्राकृतिक जैसे इन-लैब वातावरण प्रदान करते हैं।

Introduction

नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस मेजबानों और उनके आंत माइक्रोबायोम 1,2 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल के रूप में उभर रहा है। एक मॉडल के रूप में, यह कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, रोगाणु मुक्त या जीनोबायोटिक जानवरों को प्राप्त करना और बनाए रखना आसान है; ब्लीच का उपयोग ग्रेविड कीड़े और संबंधित रोगाणुओं को मारने के लिए किया जा सकता है, जिससे उनके ब्लीच-प्रतिरोधी अंडे उम्र-सिंक्रनाइज़ आबादी के रूप में बढ़ने के लिए बिना नुकसान के रह जाते हैं जिन्हें रुचि के बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेशित किया जा सकता है 3,4. इसके अलावा, जब बैक्टीरिया की उपस्थिति में उगाया जाता है, तो सी एलिगेंस, एक बैक्टेरिवोर, सामने आए बैक्टीरिया को निगलता है, जिसमें अतिसंवेदनशील प्रजातियां पचती हैं या उत्सर्जित होती हैं, जबकि प्रतिरोधी और लगातार प्रजातियां कीड़े आंत को स्थिर रूप से उपनिवेशित करती हैं। एलिगेंस ज्यादातर हेर्मैफ्रोडिटिक होते हैं, जो आनुवंशिक रूप से समान संतान की आबादी का उत्पादन करते हैं, जो भ्रामक आनुवंशिक भिन्नता को कम करता है। उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक कृमि उपभेदों की उपलब्धता के साथ युग्मित, सी एलिगेंस के साथ काम करना शोधकर्ताओं को मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन 5,6,7,8 के आणविक आधार की जांच करने के लिए एक जीनोबायोटिक और आनुवंशिक रूप से वापस लेने योग्य मॉडल प्रदान करता है।

जबकि अच्छी तरह से विशेषता वाले बैक्टीरिया के साथ प्रयोग आणविक तंत्र के विश्लेषण की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, उन बैक्टीरिया की पहचान और अध्ययन करना जो प्रकृति में कीड़े के साथ बातचीत करते हैं, ऐसे तंत्र की विविधता की खोज करने, उनके कार्य के लिए प्राकृतिक संदर्भ को उजागर करने और उनके विकास को आकार देने वाले चयनात्मक बलों को समझने के लिए आवश्यक हैं। प्रयोगशाला के बाहर, सी एलिगेंस को विश्व स्तर पर आर्द्र समशीतोष्ण जलवायु में पाया जाता है, जहां आबादी को "बूम-एंड-बस्ट" जीवनचक्र से गुजरना पड़ता है, जो संसाधनों के प्रचुर मात्रा में होने पर तेजी से जनसंख्या वृद्धि की विशेषता है, इसके बाद संसाधनों के कम होने पर अग्रणी, तनाव-सहिष्णु ड्यूरमें विकासात्मक बदलाव होता है। हालांकि मिट्टी के निमेटोड माना जाता है, जंगली-प्रसार सी एलिगेंस आबादी आमतौर पर सड़ने वाले फूलों या फलों जैसे कार्बनिक पदार्थों को विघटित करने पर भोजन करती है, जहां बैक्टीरिया की आबादी प्रचुर मात्रा में और विविध होती है।

जंगली से अलग नेमाटोड में आंत माइक्रोबायोम के अध्ययन ने विविध, अभी तक विशिष्ट, जीवाणु समुदायों10,11 की पहचान की है, जिसकी संरचना को प्राकृतिक जैसे सूक्ष्मजगत के वातावरण में उठाए गए कीड़े के साथ किए गए अध्ययनों द्वारा समर्थित किया गया था। साथ में, इस तरह के अध्ययनों ने कोर वर्म आंत माइक्रोबायोम2 के चित्रण को सक्षम किया। जबकि जंगल में सी एलिगेंस आबादी का नमूना प्राकृतिक कीड़े-माइक्रोब इंटरैक्शन की सबसे प्रत्यक्ष परीक्षा का प्रतिनिधित्व करता है, यह हर जगह और कभी भी संभव नहीं है, क्योंकि यह पर्याप्त वर्षा वाले क्षेत्रों औरमौसमों तक सीमित है। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को उनके प्राकृतिक आवास से अलग करने के बजाय, सूक्ष्म जगत का उपयोग करने वाले प्रयोग प्राकृतिक आवास को प्रयोगशाला 6,8,12,13,14,15 में लाते हैं। सूक्ष्म जगत के वातावरण विभिन्न फलों या सब्जियों के साथ खाद बनाई गई मिट्टी से तैयार किए जाते हैं, जो शुरुआती मिट्टी समुदाय के और विविधीकरण को सक्षम बनाता है। वे वापस लेने योग्य प्रयोगात्मक तरीकों की पेशकश करते हैं जो माइक्रोबियल विविधता और त्रि-आयामी जंगली मिट्टी के वातावरण को एक नियंत्रित प्रयोगशाला सुविधा और आनुवंशिक रूप से परिभाषित कृमि उपभेदों के प्रयोगात्मक लाभों के साथ जोड़ते हैं। नीचे दिए गए प्रोटोकॉल में खाद सूक्ष्म जगत के साथ काम करने में शामिल चरणों का विवरण दिया गया है, जो विभिन्न वातावरणों से एक विशिष्ट कृमि आंत माइक्रोबायोम की असेंबली को समझने में उनके उपयोग का प्रदर्शन करता है।

Protocol

1. खाद की तैयारी

  1. किसी भी सुविधाजनक स्रोत से खाद या बगीचे की मिट्टी प्राप्त करें और हवा को अंदर जाने देने के लिए ढक्कन में काटे गए छेद के साथ एक मानक रसोई प्लास्टिक कंटेनर में प्रयोगशाला के अंदर स्टोर करें। फल मक्खियों और अन्य अकशेरुकी जीवों को बाहर रखने के लिए कपास ऊन के साथ छेद प्लग करें (चित्रा 1 ए)।
    नोट: पांच सौ ग्राम मिट्टी (1.5 गैलन कंटेनर में फिटिंग, आयाम: 30 सेमी x 20 सेमी x 10 सेमी) 12 सूक्ष्म जगत के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करेगा।
  2. कटी हुई उपज या विभिन्न उपज के मिश्रण के साथ खाद या मिट्टी के उत्पादन के 1: 2 द्रव्यमान अनुपात में समृद्ध करें।
  3. 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 7-14 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें, दिन में एक बार मिलाएं और नमी बनाए बिना नमी बनाए रखने के लिए आवश्यक रूप से एम 9 माध्यम जोड़ें।
    नोट: उपज से समृद्ध मिट्टी आमतौर पर सी एलिगेंस के विकास का समर्थन नहीं करती है, लेकिन उपयोग करने के लिए कौन सी विशिष्ट उपज शोधकर्ता पर निर्भर है, जिसमें कई प्रकार और मिश्रण कृमि विकास का समर्थन करने में सक्षम हैं। विभिन्न उपज के साथ संवर्धन विभिन्न तरीकों से जीवाणु समुदाय विविधीकरण को बढ़ावा देगा, जिससे विभिन्न शुरुआती बिंदुओं से आंत माइक्रोबायोम असेंबली का अध्ययन सक्षम होगा (चर्चा अनुभाग देखें)।

2. खाद सूक्ष्म जगत की तैयारी

  1. प्रत्येक सूक्ष्म जगत के लिए, टिन पन्नी और ऑटोक्लेव (चित्रा 1 बी) से ढके 30 एमएल ग्लास बीकर में 10 ग्राम समृद्ध खाद जोड़ें।
  2. ऑटोक्लेव खाद को फिर से भरने के लिए माइक्रोबियल अर्क तैयार करने के लिए, चरण 2.1 में उपयोग की जाने वाली उसी खाद के 30 ग्राम को तीन 50 एमएल ट्यूबों में से प्रत्येक में जोड़कर शुरू करें और एम 9 से भरें। 1 मिनट के लिए भंवर (चित्रा 1 सी)।
    नोट: यह नौ सूक्ष्म जगत के लिए पर्याप्त बैक्टीरिया प्रदान करना चाहिए, प्रत्येक सैकड़ों नेमाटोड के विकास का समर्थन करता है।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 560 × ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. गोली को परेशान न करने पर ध्यान देते हुए, एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सुपरनैटेंट को हटा दें और एक नई 50 एमएल ट्यूब में मिलाएं।
  5. RT पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति (2,000 × g) पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके बैक्टीरिया के अर्क को केंद्रित करें। प्रत्येक सूक्ष्म जगत के लिए 200 μL और एक प्लेट में जोड़ने के लिए 200 μL के लिए छर्रों को पर्याप्त M9 में पुन: निलंबित करें जो सूक्ष्म जगत के अंदर कृमि विकास के दृश्यमान प्रॉक्सी के रूप में काम करेगा।
    नोट: उदाहरण के लिए, नौ सूक्ष्म जगतों के लिए, एम 9 के 2 एमएल में माइक्रोबियल गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. ऑटोक्लेव खाद के प्रत्येक बीकर में केंद्रित माइक्रोबियल अर्क के 200 μL जोड़ें, साथ ही एक एनजीएम प्लेट में जो दृश्यमान प्रॉक्सी प्लेट के रूप में काम करेगा।
  7. कीड़े को जोड़ने से पहले 20-25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सूक्ष्म जगत और प्रॉक्सी प्लेट को इनक्यूबेट करें।

3. खाद सूक्ष्म जगत में कीड़े उठाना

  1. प्रयोग शुरू करने के लिए प्रत्येक सूक्ष्म जगत में और प्रॉक्सी प्लेट (चरण 2.7) में 500-1000 अंडे या एल 1 लार्वा3 जोड़ें (चित्रा 1 डी)।
    नोट: यहां वर्णित प्रयोग एन 2 जंगली प्रकार के कीड़े का उपयोग करते हैं। एलिगेंस उपभेदों (और संभावित रूप से अन्य नेमाटोड) का उपयोग किया जा सकता है।
  2. कीड़े को वयस्कता में 20 डिग्री सेल्सियस (आमतौर पर 3 दिन) पर बढ़ाएं।

Figure 1
चित्र 1: खाद सूक्ष्म जगत तैयार करना, कीड़े उठाना और कटाई करना। (A) स्थानीय मिट्टी या खाद को उपज के साथ समृद्ध करें और 2 सप्ताह के लिए इनक्यूबेट करें। प्रयोग शुरू करने के लिए सूक्ष्म जगत में सिंक्रनाइज़ एल 1 एस कीड़े जोड़ने से पहले (बी) आटोक्लेव समृद्ध मिट्टी को (सी) माइक्रोबियल अर्क और (डी) कम से कम 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। (E, F) कटाई के लिए तैयार होने पर, एक बेरमैन फ़नल सपोर्ट सिलेंडर में सूक्ष्म जगत से खाद जोड़ें और एम 9 के साथ कवर करें। (जी) 15 मिनट के बाद, छानना 50 एमएल ट्यूब में छानना जारी करें। संक्षिप्त नाम: सूप = सतह पर तैरने वाला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. कीड़े की कटाई के लिए एक बेरमैन फ़नल तैयार करना

  1. प्लास्टिक फ़नल के अंत में 5-8 सेमी कठोर रबर ट्यूबिंग को जोड़कर एक बेरमैन फ़नल को इकट्ठा करें।
  2. ट्यूबिंग पर एक क्लैंप स्लाइड करें और इसे बंद करें।
  3. फ़नल में 7 सेमी लंबा, 5 सेमी व्यास, बेलनाकार पीवीसी पाइप रखें, जिसके तल पर 1 मिमी नायलॉन जाल चिपका हुआ है (चित्र 1 ई)। टिशू पेपर की दो शीट के साथ सिलेंडर को पंक्तिबद्ध करें।
  4. बेयरमैन फ़नल को फ्लास्क में रखें (चित्रा 1 एफ)।

5. सूक्ष्म जगत से कीड़े की कटाई और संबंधित मिट्टी के नमूने एकत्र करना

  1. उस सूक्ष्म जगत में 20 एमएल एम 9 जोड़ें जिसमें कीड़े उठाए गए थे, मिश्रण को उत्तेजित करें, और फिर बीकर से मिश्रण को बेरमैन फ़नल सेटअप में टिशू पेपर-लाइन सिलेंडर में डालें। फ़नल में खाद को पूरी तरह से डुबोने के लिए और अधिक एम 9 जोड़ें।
    एलिगेंस (एन 2) आबादी खाद सूक्ष्म जगत में वयस्कता तक पहुंचती है, जैसा कि एस्चेरिचिया कोलाई के साथ बीजित मानक एगर प्लेटों पर होता है। एक विशिष्ट विकास चरण में कीड़े की कटाई में और सटीकता के लिए, चरण 3.3 से प्रॉक्सी प्लेट देखें।
  2. 30 मिनट के बाद, कटे हुए कीड़े वाले छानने को 50 एमएल ट्यूब (चित्रा 1 जी) में छोड़ने के लिए क्लैंप को खोल दें।
  3. सिलेंडर में अधिक एम 9 जोड़ें और अधिक कीड़े काटने के लिए दूसरे दौर के लिए दोहराएं, और एक बार फिर यदि अतिरिक्त कीड़े की आवश्यकता हो।
    नोट: कटाई के दौर को दोहराते समय, सावधान रहें कि टिशू पेपर की अखंडता से समझौता न करें, जो मिट्टी के कणों को गुजरने की अनुमति दे सकता है। अधिकतम चार फसल राउंड को मूल रूप से टिशू पेपर अखंडता से समझौता किए बिना सूक्ष्म जगत में जोड़े गए कीड़े के कम से कम 50% को अलग करना चाहिए।
  4. 2 मिनट (आरटी) के लिए 560 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके कीड़े को केंद्रित करें। सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 35 एमएल सुपरनैटेंट निकालें।
  5. शेष 15 एमएल को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और कीड़े को और अधिक केंद्रित करने के लिए 1 मिनट के लिए 560 × ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ सुपरनैटेंट के 14 एमएल को हटा दें।
  6. समानांतर में, शेष सूक्ष्म जगत मिट्टी के 1 ग्राम को 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। पर्यावरणीय जीवाणु समुदाय वाले मिट्टी के नमूनों को तुरंत संसाधित करें या न्यूक्लिक एसिड के बाद के निष्कर्षण के लिए उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जैसा कि कृमि के नमूनों के लिए नीचे वर्णित है।

6. कटे हुए कीड़े की धुलाई और सतह नसबंदी

  1. कांच के पिपेट का उपयोग करके चरण 5.5 से 1.5 एमएल ट्यूब में केंद्रित, काटे गए कीड़े के 1 एमएल को स्थानांतरित करें। कीड़े को ट्यूब के तल पर बसने की अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, नीचे के 100 μL को अबाधित छोड़ दें।
  2. 6x को 1.5 mL M9+ T (M9 में 0.025% Triton-X) के साथ धोएं, जिससे कीड़े हर बार नीचे बैठ सकें।
  3. कांच के पिपेट का उपयोग करके धोए गए कीड़े को 100 μL की मात्रा में एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, पहले धोने (चरण 6.2) के बाद से लगभग 30 मिनट बीत जाना चाहिए था। लेवामिसोल को जोड़ने से पहले कीड़े को कम से कम 1 घंटे तक भोजन के बिना रहने की अनुमति देने की सिफारिश की जाती है ताकि क्षणिक बैक्टीरिया के उत्सर्जन और खाद्य बैक्टीरिया के पूर्ण पाचन की अनुमति मिल सके।
  4. कीड़े को लकवाग्रस्त करने के लिए 25 एमएम लेवैमिसोल हाइड्रोक्लोराइड का 100 μL जोड़ें। आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. 4% ब्लीच घोल का 200 μL जोड़ें। 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. सतह पर तैरने वाले को हटा दें, नीचे के सबसे 150 μL को अबाधित छोड़ दें, और ऊपर के रूप में M9 + T के साथ 3x धो लें।
    नोट: नमूने के संदूषण को कम करने के लिए, फ़िल्टर किए गए एम 9 + टी (0.2 μm फ़िल्टर के माध्यम से) का उपयोग करने और इस बिंदु से दस्ताने पहनने की सिफारिश की जाती है।
  7. धोने के बाद, बाहरी बैक्टीरिया के प्रभावी निष्कासन की पुष्टि करने के लिए 48 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम धोने और प्लेट से शेष 150 μL का 50 μL लें।
    नोट: अंतिम धोने में 30 कॉलोनियों को देखने (नमूने में कुल 60 बाहरी जीवाणु कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हुए) की अनुमति है और विश्लेषण किए गए माइक्रोबायोम संरचना में केवल एक मामूली योगदान होने की उम्मीद है, हजारों बैक्टीरिया को देखते हुए जो आमतौर पर प्रत्येक वयस्क कीड़े15 को उपनिवेशित करते हैं। जब अधिक देखा जाता है, तो नमूना अखंडता से समझौता किया जा सकता है।
  8. सतह-निष्फल कीड़े का तुरंत उपयोग करें (उदाहरण के लिए, [सीएफयू गिनती] संवर्धन के लिए जीवित बैक्टीरिया निकालने के लिए) या न्यूक्लिक एसिड के बाद के निष्कर्षण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. डीएनए निष्कर्षण

नोट: निम्नलिखित चरण मिट्टी से माइक्रोबियल डीएनए के निष्कर्षण के लिए डिज़ाइन की गई वाणिज्यिक किट का उपयोग करके काटे गए कीड़े के डीएनए निष्कर्षण का वर्णन करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें), कीड़े से माइक्रोबियल डीएनए के निष्कर्षण की सुविधा के लिए नीचे वर्णित संशोधनों के साथ।

  1. सतह-निष्फल कीड़े (यदि आवश्यक हो तो आरटी पर डीफ्रॉस्ट) वाले नमूने को किट द्वारा प्रदान की गई ट्यूबों में स्थानांतरित करें, प्रदान किए गए ग्लास मोतियों को लगभग 30-50 1 मिमी व्यास ज़िरकोनिया मोतियों के साथ बदलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: किट द्वारा प्रदान किए गए ग्लास मोतियों की तुलना में जिरकोनिया मोतियों के साथ देखे गए डीएनए पैदावार अधिक हैं। हालांकि इस अवलोकन के पीछे का कारण अनिर्धारित है, ज़िरकोनिया मोती नेमाटोड छल्ली को अधिक कुशलता से खोल सकते हैं, जिससे अधिक बैक्टीरिया जारी हो सकते हैं।
  2. खाद के नमूनों के लिए, ग्लास मोतियों को प्रतिस्थापित किए बिना किट की ट्यूबों में एकत्रित मिट्टी का लगभग 250 मिलीग्राम जोड़ें।
  3. किट द्वारा सभी नमूनों में प्रदान किए गए बफर समाधान को जोड़ने के बाद, आरटी पर एक पावर होमोजेनाइज़र के साथ समरूप करें ( सामग्री की तालिका देखें) 30 सेकंड के लिए 2,000 आरपीएम के दो राउंड के लिए, बीच में 30 सेकंड के लिए रुकें।
  4. किट प्रोटोकॉल के अनुसार शेष डीएनए शुद्धिकरण चरणों को पूरा करें। डीएनए सांद्रता सुनिश्चित करने के लिए 50 μL से अधिक क्षालन बफर में कृमि के नमूनों का उपयोग करें जो अनुक्रमण के लिए पर्याप्त उच्च हैं।

Representative Results

मिट्टी के सूक्ष्म जगत के समुदाय में विविधता लाने की क्षमता का पता लगाने के लिए, हमने एक ही प्रारंभिक मिट्टी को समृद्ध करके तैयार खाद सूक्ष्म जगत में माइक्रोबियल समुदायों की तुलना की, कैलिफोर्निया के बर्कले शहर से उपलब्ध एक औद्योगिक-ग्रेड खाद, विभिन्न उपज के साथ: सेब, घंटी मिर्च, संतरे, या आलू (प्रत्येक तीन प्रतियों में सेट)। हमने आगे प्रत्येक खाद वातावरण के माइक्रोबियल समुदायों की तुलना संबंधित सूक्ष्म जगत में उठाए गए जंगली प्रकार सी एलिगेंस के आंत माइक्रोबायोम के साथ की। विश्लेषण प्रति सूक्ष्म जगत में लगभग 500 सतह-निष्फल वयस्कों से और संबंधित सूक्ष्म जगत के 250 मिलीग्राम खाद नमूनों से निकाले गए डीएनए नमूनों के साथ किया गया था।

पर्यावरणीय मिट्टी और कृमि आंत माइक्रोबायोम का लक्षण वर्णन बैक्टीरियल 16 एस आरआरएनए जीन के वी 4 क्षेत्र के अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पर निर्भर करता है। अनुक्रमण लाइब्रेरी की तैयारी मानक किट का उपयोग करके हासिल की गई थी और निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था, जिसमें एक वाणिज्यिक अनुक्रमक पर अनुक्रमण किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)। डीमल्टीप्लेक्स अनुक्रमों को डीएडीए 2 का उपयोग करके संसाधित किया गया था, सिल्वा वी 132 संदर्भ डेटाबेस के आधार पर वर्गीकरण सौंपा गया था, और फ़ाइलोसेक 16,17,18 के साथ विश्लेषण किया गया था (देखें पूरक फ़ाइल 1, पूरक चित्रा एस 1, पूरक चित्रा एस 2, पूरक चित्रा एस 3, पूरक तालिका एस 1, और पूरक तालिका एस 2)। अनुक्रमण और विश्लेषण के विस्तृत विवरण के लिए; पूर्ण कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms] में उपलब्ध है। कच्चे डेटा एनसीबीआई अनुक्रम पठन संग्रह (बायोप्रोजेक्ट आईडी पीआरजेएनए 856419) पर उपलब्ध हैं।

औसतन, प्रति नमूना 73,220 अनुक्रम प्राप्त किए गए थे। ये अनुक्रम 15,027 एम्प्लिकॉन अनुक्रम वेरिएंट (एएसवी) का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो 27 फ़ाइला और 216 परिवारों में फैले हुए हैं, जिनमें कोर सी एलिगेंस आंत माइक्रोबायोम13 का हिस्सा माने जाने वाले परिवार शामिल हैं, जैसे कि राइजोबियासी, बर्कहोल्डरियासी और बेसिलसी। एंटरोबैक्टीरिया, और स्यूडोमोनाडेसी, जो पहले प्रमुख सदस्य पाए गए थे, इस बार अल्पसंख्यक थे, लेकिन फिर भी अपने संबंधित मिट्टी के वातावरण की तुलना में समृद्ध (2-10 गुना) थे। 19,20 दूरी के भारित और भारित यूनिफ्रैक दोनों के आधार पर तुलना ने एक ही उपज से समृद्ध सूक्ष्म जगत तीन प्रतियों के बीच अच्छी प्रजनन क्षमता का प्रदर्शन किया, जैसा कि क्लोज क्लस्टरिंग द्वारा इंगित किया गया है। इसके विपरीत, पर्यावरणीय मिट्टी के माइक्रोबायोम एक-दूसरे से दूर विभिन्न उपज समूहों से समृद्ध होते हैं, जो विभिन्न उपज के अतिरिक्त एक प्रारंभिक माइक्रोबियल समुदाय में विविधता लाने की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं (चित्रा 2)।

कृमि आंत माइक्रोबायोम और पर्यावरणीय समुदायों की तुलना में, प्रमुख समन्वय विश्लेषण (पीसीओए) ने या तो भारित या भारित यूनिफ्रैक दूरी के साथ प्रत्येक सूक्ष्म जगत प्रकार के लिए अपने संबंधित वातावरण से दूर कृमि आंत माइक्रोबायोम के अलग-अलग क्लस्टरिंग को दिखाया (चित्रा 2)। जबकि भारित यूनिफ्रैक दूरी के आधार पर पीसीओए ने मिट्टी और कृमि माइक्रोबायोम (चित्रा 2 ए) के बीच अंतर नहीं किया, भारित दूरी के आधार पर क्लस्टरिंग ने कृमि आंत और खाद माइक्रोबायोम के स्पष्ट पृथक्करण का खुलासा किया (चित्रा 2 बी)। ये परिणाम एक ऐसी प्रक्रिया का समर्थन करते हैं जिसमें मेजबान फ़िल्टरिंग एक आंत माइक्रोबायोम को आकार देने के लिए पर्यावरणीय उपलब्धता पर काम करता है जो टैक्सा की उपस्थिति के संबंध में अपने पर्यावरणीय स्रोत से पूरी तरह से अलग नहीं है, लेकिन उपलब्ध टैक्सा के उप-समूह के लिए समृद्ध करके उनकी बहुतायत को नियंत्रित करता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः विभिन्न वातावरणों में उठाए गए कीड़े के बीच एक कोर वर्म आंत माइक्रोबायोम साझा किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: वर्म आंत माइक्रोबायोम क्लस्टरिंग उनके संबंधित उपज-विविध माइक्रोबियल वातावरण से दूर है। माइक्रोबायोम संरचना को 16 एस अनुक्रमण के साथ निर्धारित किया गया था, और निर्दिष्ट उपज से समृद्ध या उनमें उठाए गए कीड़े से समृद्ध सूक्ष्म जगत के समुदायों को (ए) अभारित या (बी) भारित यूनिफ्रैक दूरी के आधार पर पीसीओए का उपयोग करके क्लस्टर किया गया था। दिखाए गए अक्ष वे हैं जो नमूनों के बीच सामुदायिक संरचना में सबसे बड़ी भिन्नता की व्याख्या करते हैं (प्रत्येक सूक्ष्म जगत प्रकार के लिए एन = 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अगली पीढ़ी के अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण। यहां प्रस्तुत पुस्तकालय की तैयारी, इन-लैब अनुक्रमण और डेटा विश्लेषण के लिए कदम हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: रिवर्स के लिए गुणवत्ता नियंत्रण ग्राफ का एक उदाहरण एक नमूने से पढ़ता है। एक्स-अक्ष (चक्र) अनुक्रम पढ़ने के साथ न्यूक्लियोटाइड स्थिति को दर्शाता है। बायां वाई-अक्ष गुणवत्ता स्कोर दिखाता है। ग्रेस्केल हीटमैप प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड स्थिति में गुणवत्ता स्कोर की आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है; हरी रेखा प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड स्थिति में औसत गुणवत्ता स्कोर को दर्शाती है; शीर्ष नारंगी रेखा गुणवत्ता स्कोर वितरण के चतुर्थकों को दर्शाती है; नीचे लाल रेखा अनुक्रम के प्रतिशत को दर्शाती है जो उस न्यूक्लियोटाइड स्थिति (दाएं वाई-अक्ष, यहां 100%) को बढ़ाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 2: विभिन्न नमूनों के लिए त्रुटि दर। विभिन्न नमूनों (काले डॉट्स) में त्रुटि आवृत्ति को चित्रित प्रत्येक संभावित बेस जोड़ी प्रतिस्थापन के लिए बढ़ते गुणवत्ता स्कोर के साथ कम होना चाहिए, जो अपेक्षित प्रवृत्ति को दर्शाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: भारित यूनिफ्रैक दूरी के आधार पर पीसीओए का एक उदाहरण। किंवदंती में दिखाए गए समूह नाम विभिन्न सूक्ष्म जगत में उपयोग की जाने वाली खाद को समृद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली उपज का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: अनुक्रमिक अनुक्रम फ़िल्टरिंग। एक फ़िल्टर करने से पहले अनुक्रम की संख्या पढ़ी जाती है. बी-डी प्रत्येक कॉलम एक निस्पंदन चरण के बाद शेष अनुक्रम पढ़ने की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है: कम गुणवत्ता वाले रीड (चरण 2.5) को फ़िल्टर करना, दादा () (चरण 2.8) द्वारा किए गए एनोइज़िंग एल्गोरिदम, आगे और रिवर्स रीड (चरण 2.9) को विलय करना, और चिमेरा (चरण 2.11) को हटाना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 2: मेटाडेटा तालिका। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्राकृतिक जैसे वातावरण में उठाए गए नेमाटोड के आंत माइक्रोबायोम का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो प्रकृति से कीड़े के अलगाव के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है या उन्हें सिंथेटिक समुदायों पर उठाता है।

प्रतिनिधि सूक्ष्म जगत प्रयोग में कैप्चर की गई हजारों संभावित जीवाणु प्रजातियां माइक्रोबियल विविधता को दर्शाती हैं जो कीड़े के साथ विकसित हुई हैं और एक मॉडल मेजबान जीव और प्राकृतिक, विविध माइक्रोबियल समुदायों के साथ काम करने के फायदों को संयोजित करने के लिए सूक्ष्म जगत पाइपलाइन की क्षमता का प्रदर्शन करती हैं।

प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि विभिन्न उपज प्रकारों के साथ एक आम मिट्टी को समृद्ध करना पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता को नियंत्रित करता है, इस पाइपलाइन का उपयोग करके अन्वेषण के लिए उपलब्ध माइक्रोबियल विविधता की सीमा को उजागर करता है। उत्पादन विकल्प विशेष रूप से महत्वपूर्ण नहीं है। पिछले काम ने मिट्टी को समृद्ध करने के लिए केले, सेब, संतरे, स्ट्रॉबेरी, हरी चाय की पत्तियों और आलू का उपयोग किया है, जिसके परिणामस्वरूप समान कीड़े बढ़ाने की दक्षता है। मिश्रित उपज का भी प्रभावी ढंग से उपयोग किया गया है। मुख्य विशेषता यह है कि विभिन्न उपज अलग-अलग तरीकों से किसी दिए गए मिट्टी में विविधता लाएगी।

पर्यावरणीय माइक्रोबियल विविधता में व्यापक भिन्नता के बावजूद, कृमि आंत माइक्रोबायोम काफी कम भिन्न होते हैं, जो कृमि आंत आला के महत्व को दोहराते हैं और कोर आंत माइक्रोबायोम की असेंबली के लिए मेजबान फ़िल्टरिंग करते हैं जो इसके मिट्टीके वातावरण से अलग है। इस पैटर्न को भारित यूनिफ्रैक पीसीओए विश्लेषण के साथ सबसे अच्छा देखा जाता है, यह दर्शाता है कि पर्यावरणीय मिट्टी और कृमि आंत माइक्रोबायोम के बीच अंतर ज्यादातर प्रमुख टैक्सा की सापेक्ष बहुतायत में अंतर से उपजा है।

यद्यपि यहां वर्णित प्रोटोकॉल 16 एस अनुक्रमण के लिए कीड़े की कटाई पर केंद्रित है, सूक्ष्म जगत का उपयोग रुचि के अतिरिक्त प्रश्नों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सूक्ष्म जगत से काटे गए कीड़े को बाद में रोगजनकों या विषाक्त पदार्थों सहित विभिन्न प्रतिकूल परिस्थितियों के लिए मेजबान प्रतिरोध पर एक विविध आंत माइक्रोबायोम के प्रभाव के लिए जांच की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, नए जीवाणु प्रजातियों और उपभेदों को जमीन पर काटे गए कीड़े से अलग और सुसंस्कृत किया जा सकता है, जिससे प्रयोग करने के लिए उपलब्ध बैक्टीरिया की वर्गीकरण और कार्यात्मक विविधता का विस्तार होता है।

जबकि प्रयोगशाला सेटिंग्स में अनुसंधान विधियां स्थिरता और प्रजनन क्षमता की तलाश करती हैं, सूक्ष्म जगत के साथ काम प्राकृतिक जैसे संदर्भ में मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए प्राकृतिक भिन्नता का लाभ उठाता है। फिर भी, यह भिन्नता कुछ चुनौतियां भी पैदा करती है। कुछ मिट्टी जिनमें अंतर्जात अकशेरुकी जीवों के उच्च स्तर शामिल हैं, को सूक्ष्म जगत की तैयारी से अवांछित जीवों को प्रभावी ढंग से खत्म करने के लिए अतिरिक्त सेंट्रीफ्यूजेशन, निस्पंदन और परीक्षा चरणों की आवश्यकता हो सकती है। इसके अतिरिक्त, मिट्टी में कम माइक्रोबियल बहुतायत कृमि आबादी में अवांछित ड्यूअर गठन को प्रेरित कर सकती है, जिससे माइक्रोबियल अर्क में वृद्धि या अधिक मात्रा में उत्पादन के साथ मिट्टी को समृद्ध करने की आवश्यकता होती है। प्रत्येक सूक्ष्म जगत प्रयोग के साथ, शोधकर्ता प्रकृति द्वारा प्रदान की गई पूर्ण टैक्सोनोमिक और कार्यात्मक विविधता का पता लगाना जारी रखते हैं, जिससे संक्रमण प्रतिरोध से लेकर पर्यावरणीय ज़ेनोबायोटिक्स के खिलाफ सुरक्षा तक नए माइक्रोबियल टैक्सा और कार्यात्मक क्षमताओं की खोज को सक्षम किया जा सके।

Disclosures

लेखकों के पास यह घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है कि वे इस लेख की सामग्री के लिए प्रासंगिक हैं।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि में वर्णित कार्य एनआईएच अनुदान आर01ओडी024780 और आर01एजी061302 द्वारा समर्थित था। केटी को रोज़ हिल्स फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले से ग्रीष्मकालीन स्नातक अनुसंधान फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 में कार्टून डिजाइन BioRender.com से प्राप्त किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMPure XP Reagent, 60 mL Beckman Coulter A63881 Supplementary File Step 1.3
Bleach (Sodium Hypochlorite) Sigma-Aldrich 7681-52-9 Step 6.5
DNeasy PowerSoil Pro Kit Qiagen 47016 Step 7 DNA extractions
dNTP set 10 mM Invitrogen 18427013 Supplementary Step 1.2
Easypet 3 Serological Pipette Controller Eppendorf 4430000018 Used to remove supernatant when specified
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets Fisher Scientific 07-000-368 Used to remove supernatant when specified
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500 Used to make M9
Levamisole Hydrochloride Fisher Scientific AC187870100 Step 6.4
M9 Minimal Media Solution Prepared in-house N/A Recipe in wormbook.org
MgSO4 Fisher Scientific M63-500 Used to make M9
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) Illumina FC-420-1002 Supplementary Step 1.7
MiniSeq System Illumina SY-420-1001 Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7
Na2HPO4 Fisher Scientific S374-500 Used to make M9
NaCl Fisher Scientific S271-3 Used to make M9
Nematode Growth Media (NGM) Prepared in-house N/A Recipe in wormbook.org
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) Illumina FC-131-1096 Library prep kit used; Supplementary Step 1.4
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 Supplementary Step 1.7
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530L Supplementary Step 1.2
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) Qiagen 13155 Step 7.3
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32851 Supplementary Steps 1.1 & 1.6
Qubit Fluorometer Invitrogen Q33238 Supplementary Steps 1.1 & 1.6
Triton X-100 Fisher Scientific BP-151 Used to prepare M9+T
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter Fisher Scientific NC9847287 Step 7.1

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References

  1. Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
  2. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285 (2017).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 7-8 (2006).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  6. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604 (2019).
  7. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  8. Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
  9. Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  10. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  11. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  12. Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622 (2016).
  13. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  14. Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
  15. Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343 (2022).
  16. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
  18. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
  19. Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
  20. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).

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जीव विज्ञान अंक 187
<em>केनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस</em> में माइक्रोबायोम अनुसंधान के लिए माइक्रोबियल रूप से विविध, प्राकृतिक जैसे वातावरण के रूप में कंपोस्ट माइक्रोकॉसम
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Trang, K., Bodkhe, R., Shapira, M.… More

Trang, K., Bodkhe, R., Shapira, M. Compost Microcosms as Microbially Diverse, Natural-like Environments for Microbiome Research in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (187), e64393, doi:10.3791/64393 (2022).

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