Summary
Kompostmikrokosmos tar med sig den mikrobiella mångfalden som finns i naturen till laboratoriet för att underlätta mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Här finns protokoll för att sätta upp mikrokosmosexperiment, där experimenten visar förmågan att modulera miljömikrobiell mångfald för att utforska relationerna mellan miljömikrobiell mångfald och masktarmmikrobiomsammansättning.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans växer fram som en användbar modell för att studera de molekylära mekanismer som ligger till grund för interaktioner mellan värdar och deras tarmmikrobiomer. Medan experiment med välkarakteriserade bakterier eller definierade bakteriesamhällen kan underlätta analysen av molekylära mekanismer, är det viktigt att studera nematoder i deras naturliga mikrobiella sammanhang för att utforska mångfalden av sådana mekanismer. Samtidigt är isolering av maskar från naturen inte alltid möjlig, och även när det är möjligt begränsar provtagning från naturen användningen av den genetiska verktygslåda som annars finns tillgänglig för C. elegans-forskning. Följande protokoll beskriver en metod för mikrobiomstudier som använder kompostmikrokosmos för tillväxt i labbet i mikrobiellt olika och naturliknande miljöer.
Lokalt anskaffad jord kan berikas med produkter för att diversifiera de mikrobiella samhällen där maskar odlas och från vilka de skördas, tvättas och ytsteriliseras för efterföljande analyser. Representativa experiment visar förmågan att modulera det mikrobiella samhället i en gemensam jord genom att berika den med olika produkter och visar vidare att maskar uppvuxna i dessa distinkta miljöer monterar liknande tarmmikrobiomer som skiljer sig från sina respektive miljöer, vilket stöder uppfattningen om ett artspecifikt kärntarmmikrobiom. Sammantaget ger kompostmikrokosmos naturliknande miljöer i labb för mikrobiomforskning som ett alternativ till syntetiska mikrobiella samhällen eller till isolering av vilda nematoder.
Introduction
Nematoden Caenorhabditis elegans växer fram som en användbar modell för att studera interaktioner mellan värdar och deras tarmmikrobiomer 1,2. Som modell erbjuder den flera fördelar. För det första är bakteriefria eller gnotobiotiska djur lätta att få tag på och underhålla; Blekmedel kan användas för att döda gravidmaskar och tillhörande mikrober, vilket lämnar deras blekmedelsresistenta ägg oskadda för att växa som ålderssynkroniserade populationer som kan koloniseras av bakterier av intresse 3,4. Dessutom, när de odlas i närvaro av bakterier, intar C. elegans, en bakterivore, de påträffade bakterierna, med mottagliga arter smälta eller utsöndrade, medan resistenta och ihållande arter stabilt koloniserar masktarmen. Dessutom är C. elegans mestadels hermafroditiska och producerar populationer av genetiskt identisk avkomma, vilket minskar förvirrande genetisk variation. Tillsammans med tillgången på mutanta och transgena maskstammar erbjuder arbetet med C. elegans forskare en gnotobiotisk och genetiskt lätthanterlig modell för att undersöka den molekylära grunden för värd-mikrobinteraktioner 5,6,7,8.
Medan experiment med välkarakteriserade bakterier kan underlätta analysen av molekylära mekanismer, är det viktigt att identifiera och studera bakterierna som maskar interagerar med i naturen för att utforska mångfalden av sådana mekanismer, avslöja det naturliga sammanhanget för deras funktion och förstå de selektiva krafter som har format deras utveckling. Utanför laboratoriet finns C. elegans globalt i fuktiga tempererade klimat, där populationer tros genomgå en "boom-and-bust" livscykel, kännetecknad av snabb befolkningstillväxt när resurserna är rikliga, följt av en utvecklingsförskjutning till banbrytande, stresstoleranta dauers när resurserna är uttömda9. Även om de anses vara en jordnematod, är vildförökande C. elegans-populationer vanligast som matar på sönderdelande organiskt material som ruttnande blommor eller frukter, där bakteriepopulationer är rikliga och olika.
Studier av tarmmikrobiomet i nematoder isolerade från naturen har identifierat olika, men ändå karakteristiska, bakteriesamhällen 10,11, vars sammansättning ytterligare stöddes av studier utförda med maskar uppfödda i naturliknande mikrokosmosmiljöer 12,13. Tillsammans möjliggjorde sådana studier avgränsningen av ett kärnmaskmikrobiom2. Medan provtagningen av C. elegans-populationer i naturen representerar den mest direkta undersökningen av naturliga mask-mikrobinteraktioner, är det inte möjligt överallt och när som helst, eftersom det är begränsat till regioner och årstider med riklig nederbörd10,11. Alternativt, istället för att isolera maskar från deras naturliga livsmiljö, tar experiment med mikrokosmos den naturliga livsmiljön in i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmosmiljöer framställs av jord komposterad med olika frukter eller grönsaker, vilket möjliggör ytterligare diversifiering av det ursprungliga marksamhället. De erbjuder lätthanterliga experimentella metoder som kombinerar den mikrobiella mångfalden och den tredimensionella vilda jordmiljön med de experimentella fördelarna med en kontrollerad laboratorieanläggning och genetiskt definierade maskstammar. Protokollet nedan beskriver stegen i arbetet med kompostmikrokosmos, vilket visar deras användning för att förstå sammansättningen av ett karakteristiskt masktarmmikrobiom från olika miljöer.
Protocol
1. Beredning av kompost
- Skaffa kompost eller trädgårdsjord från någon lämplig källa och förvara inuti laboratoriet i en vanlig köksplastbehållare med hål skurna i locket för att släppa in luft. Plugga hålen med bomullsull för att hålla bananflugor och andra ryggradslösa djur ute (figur 1A).
OBS: Femhundra gram jord (passar i en 1.5 gallon behållare, mått: 30 cm x 20 cm x 10 cm) kommer att ge tillräckligt med material för 12 mikrokosmos. - Berika komposten eller jorden med hackade produkter eller en blandning av olika produkter i ett massförhållande på 1:2 mellan produkter och jord.
- Inkubera i 7-14 dagar vid 20-25 °C, blanda en gång om dagen och tillsätt M9-medium efter behov för att bibehålla fukt utan att göra det lerigt.
OBS: Jordar som inte är berikade med produkter stöder vanligtvis inte C. elegans tillväxt, men vilka specifika produkter som ska användas är upp till forskaren, med många typer och blandningar som kan stödja masktillväxt. Berikning med olika produkter kommer att främja diversifiering av bakteriesamhället på olika sätt, vilket möjliggör studier av tarmmikrobiomsammansättning från olika utgångspunkter (se diskussionsavsnittet).
2. Beredning av kompostmikrokosmos
- För varje mikrokosmos, tillsätt 10 g berikad kompost till en 30 ml glasbägare täckt med tennfolie och autoklav (figur 1B).
- För att förbereda mikrobiellt extrakt för att fylla på den autoklaverade komposten, börja med att tillsätta 30 g av samma kompost som användes i steg 2.1 till vart och ett av tre 50 ml rör och fyll med M9. Virvel i 1 min (figur 1C).
OBS: Detta bör ge tillräckligt med bakterier för nio mikrokosmos, var och en stöder utvecklingen av hundratals nematoder. - Centrifugera rören vid 560 × g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Var uppmärksam på att inte störa pelleten, ta bort supernatanterna med en serologisk pipett och kombinera i ett nytt 50 ml rör.
- Koncentrera bakterieextraktet genom centrifugering med maximal hastighet (2 000 × g) i 15 min vid RT. Återsuspendera pelletsen i tillräckligt med M9 för att ha 200 μL för varje mikrokosmos och 200 μL mer för att lägga till en platta som kommer att fungera som en synlig proxy för maskutveckling inuti mikrokosmos.
OBS: För nio mikrokosmos, återsuspendera till exempel den mikrobiella pelleten i 2 ml M9. - Tillsätt 200 μl av det koncentrerade mikrobiella extraktet till varje bägare av autoklaverad kompost, samt till en NGM-platta som kommer att fungera som den synliga proxyplattan.
- Inkubera mikrokosmos och proxyplatta i 24 timmar vid 20–25 °C före tillsats av maskar.
3. Höja maskar i kompostmikrokosmos
- Tillsätt 500-1000 ägg eller L1-larver3 till varje mikrokosmos och till proxyplattan (steg 2.7) för att påbörja experimentet (figur 1D).
OBS: Experimenten som beskrivs här använder N2-maskar av vildtyp. Andra C. elegans-stammar (och potentiellt andra nematoder) kan dock användas. - Höj maskarna till vuxen ålder vid 20 °C (vanligtvis 3 dagar).
Figur 1: Förbereda kompostmikrokosmos, höja maskar och skörda . (A) Berika lokal jord eller kompost med produkter och inkubera i 2 veckor. Kombinera (B) autoklaverad berikad jord med (C) mikrobiellt extrakt och (D) inkubera i minst 24 timmar innan du tillsätter synkroniserade L1s-maskar till mikrokosmos för att påbörja experimentet. (E, F) När du är redo att skörda, tillsätt kompost från mikrokosmos i en Baermann-trattstödcylinder och täck med M9. (G) Efter 15 minuter, släpp filtratet i ett 50 ml rör. Förkortning: sup. = supernatant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Förbereda en Baermann-tratt för att skörda maskar
- Montera en Baermann-tratt genom att fästa 5-8 cm styva gummislangar i slutet av en plasttratt.
- Skjut en klämma på slangen och kläm fast den.
- Placera i tratten ett 7 cm långt, 5 cm i diameter, cylindriskt PVC-rör med ett 1 mm nylonnät limmat i botten (figur 1E). Klä cylindern med två ark silkespapper.
- Placera Baermann-tratten i en kolv (figur 1F).
5. Skörda maskar från mikrokosmos och samla in respektive jordprover
- Tillsätt 20 ml M9 till mikrokosmos där maskarna höjdes, agitera blandningen och häll sedan blandningen från bägaren i den silkespappersfodrade cylindern i Baermann-trattinställningen. Tillsätt mer M9 för att helt sänka komposten i tratten.
OBS: C. elegans (N2) populationer når vuxen ålder i kompostmikrokosmos i samma takt som på vanliga agarplattor sådda med Escherichia coli. För ytterligare noggrannhet vid skörd av maskar i ett specifikt utvecklingsstadium, se proxyplattan från steg 3.3. - Efter 30 minuter lossar du klämman för att släppa ut filtratet som innehåller de skördade maskarna i ett 50 ml rör (figur 1G).
- Tillsätt mer M9 till cylindern och upprepa en andra omgång för att skörda fler maskar, och en gång till om ytterligare maskar krävs.
OBS: När du upprepar skörderundor, var försiktig så att du inte äventyrar silkespapperets integritet, vilket kan tillåta jordpartiklar att passera igenom. Högst fyra skörderundor bör isolera minst 50% av maskarna som ursprungligen tillsattes till mikrokosmos utan att äventyra mjukpappersintegriteten. - Koncentrera maskarna genom centrifugering vid 560 × g i 2 min (RT). Ta bort 35 ml av supernatanten med en serologisk pipett.
- Överför de återstående 15 ml till ett 15 ml rör och centrifugera igen vid 560 × g i 1 min för att ytterligare koncentrera maskarna. Ta bort 14 ml av supernatanten med en serologisk pipett.
- Parallellt samlar du 1 g av den återstående mikrokosmosjorden i ett 1,5 ml rör. Bearbeta jordproverna som innehåller miljöbakteriesamhället omedelbart eller förvara dem vid −20 °C för senare extraktion av nukleinsyror, enligt beskrivningen nedan för maskprover.
6. Tvättning och ytsterilisering av skördade maskar
- Överför 1 ml av de koncentrerade, skördade maskarna från steg 5,5 till ett 1,5 ml rör med en glaspipett. Inkubera i 2 minuter så att maskarna kan sätta sig i botten av röret. Ta bort supernatanten och lämna de nedre 100 μL ostörda.
- Tvätta 6x med 1,5 ml M9 + T (0,025% Triton-X i M9), så att maskarna kan sätta sig i botten varje gång.
- Överför de tvättade maskarna i en volym av 100 μL till ett nytt 1,5 ml rör med en glaspipett.
OBS: Vid denna tidpunkt i protokollet borde ungefär 30 minuter ha gått sedan den första tvätten (steg 6.2). Att låta maskarna förbli utan mat i minst 1 timme före tillsats av levamisol rekommenderas för att möjliggöra utsöndring av övergående bakterier och fullständig matsmältning av matbakterier. - Tillsätt 100 μl 25 mM levamisolhydroklorid för att förlama maskarna. Inkubera i 5 minuter vid RT.
- Tillsätt 200 μl 4% blekmedelslösning. Inkubera i 2 min.
- Ta bort supernatanten, lämna de nedersta 150 μL ostörda och tvätta 3x med M9 + T, som ovan.
OBS: För att minimera kontaminering av proverna rekommenderas att använda filtrerad M9 + T (genom ett 0,2 μm filter) och att bära handskar från och med denna tidpunkt. - Efter tvätten, ta 50 μl av de återstående 150 μL från den sista tvätten och plattan på en LB-platta, inkubera vid 25 °C i 48 timmar för att bekräfta effektivt avlägsnande av externa bakterier.
OBS: Att observera upp till 30 kolonier i den sista tvätten (som representerar 60 externa bakterieceller totalt kvar i provet) är tillåtet och förväntas endast ha ett marginellt bidrag till den analyserade mikrobiomkompositionen, med tanke på de tusentals bakterier som vanligtvis koloniserar varje vuxen mask15. När fler observeras kan provintegriteten äventyras. - Använd de ytsteriliserade maskarna omedelbart (t.ex. för att extrahera levande bakterier för odling [CFU-räkningar]) eller förvara vid −20 ° C för efterföljande extraktion av nukleinsyror.
7. DNA-extraktion
OBS: Följande steg beskriver DNA-extraktion av de skördade maskarna med hjälp av ett kommersiellt kit utformat för extraktion av mikrobiellt DNA från jord (se materialförteckning), med modifieringar som beskrivs nedan för att underlätta extraktionen av mikrobiellt DNA från maskar.
- Överför provet som innehåller ytsteriliserade maskar (avfrostning vid RT vid behov) till rören som tillhandahålls av satsen och ersätt de medföljande glaspärlorna med ungefär 30-50 zirkoniumoxidpärlor med en diameter på ungefär 30-50 1 mm (se materialtabell).
OBS: De observerade DNA-utbytena är högre med zirkoniumoxidpärlor än med glaspärlorna som tillhandahålls av satsen. Även om orsaken bakom denna observation förblir obestämd, kan zirkoniumpärlor bryta upp nematodkannan mer effektivt och frigöra fler bakterier. - För kompostprover, tillsätt ungefär 250 mg av den uppsamlade jorden till satsens rör utan att byta ut glaspärlorna.
- Efter tillsats av buffertlösningen som tillhandahålls av satsen till alla prover, homogenisera med en effekthomogenisator vid RT (se materialtabell) i två omgångar med 2 000 varv / min i 30 s vardera, pausa i 30 s däremellan.
- Slutför de återstående DNA-reningsstegen enligt kitprotokollet. Eluera maskproverna i högst 50 μL elueringsbuffert för att säkerställa DNA-koncentrationer som är tillräckligt höga för sekvensering.
Representative Results
För att utforska förmågan att diversifiera samhället av jordmikrokosmos jämförde vi de mikrobiella samhällena i kompostmikrokosmos som framställts genom att berika samma ursprungliga jord, en kompost av industriell kvalitet tillgänglig från staden Berkeley, Kalifornien, med olika produkter: äpplen, paprika, apelsiner eller potatis (var och en i tre exemplar). Vi jämförde vidare de mikrobiella samhällena i varje kompostmiljö med tarmmikrobiomet av vildtyp C. elegans uppvuxna i respektive mikrokosmos. Analysen utfördes med DNA-prover extraherade från ungefär 500 ytsteriliserade vuxna per mikrokosmos och från 250 mg kompostprover från respektive mikrokosmos.
Karakterisering av miljöjord- och masktarmmikrobiomerna förlitade sig på nästa generations sekvensering av V4-regionen i den bakteriella 16S rRNA-genen. Sekvensering av biblioteksförberedelser uppnåddes med hjälp av standardsatserna och utfördes enligt tillverkarens instruktioner, med sekvensering utförd på en kommersiell sequencer (se materialförteckning). Demultiplexerade sekvenser bearbetades med DADA2, tilldelades taxonomi baserat på referensdatabasen SILVA v132 och analyserades med fylosq16,17,18 (se tilläggsfil 1, kompletterande figur S1, kompletterande figur S2, kompletterande figur S3, tilläggstabell S1 och tilläggstabell S2 För en detaljerad beskrivning av sekvenseringen och analysen. Den fullständiga beräkningspipelinen är tillgänglig i GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Rådata finns tillgängliga på NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).
I genomsnitt erhölls 73 220 sekvenser per prov. Dessa sekvenser representerar 15 027 ampliconsekvensvarianter (ASV), som spänner över 27 phyla- och 216 familjer, inklusive familjer som anses vara en del av kärnan C. elegans tarmmikrobiom13, såsom Rhizobiaceae, Burkholderiaceae och Bacillaceae. Enterobacteriaceae och Pseudomonadaceae, som tidigare visat sig vara dominerande medlemmar, var en minoritet den här gången, men berikades fortfarande (2-10 gånger) jämfört med deras respektive markmiljöer. Jämförelser baserade på både oviktade och viktade UniFrac19,20-avstånd visade god reproducerbarhet bland mikrokosmos tredubbla berikade med samma produkter, vilket indikeras av nära klustring. Däremot är miljöjordmikrobiomer berikade med olika produkter grupperade från varandra, vilket visar förmågan att diversifiera ett initialt mikrobiellt samhälle genom tillsats av olika produkter (figur 2).
I jämförelser av masktarmsmikrobiomer och miljösamhällen visade huvudkoordinatanalys (PCoA) med antingen oviktade eller viktade UniFrac-avstånd distinkt klustring av masktarmmikrobiomer bort från deras respektive miljöer för varje mikrokosmostyp (figur 2). Medan PCoA baserat på oviktade UniFrac-avstånd inte skilde mellan jord- och maskmikrobiomer (figur 2A), avslöjade kluster baserat på viktade avstånd en tydlig separation av masktarm och kompostmikrobiomer (figur 2B). Dessa resultat stöder en process där värdfiltrering arbetar med miljötillgänglighet för att forma ett tarmmikrobiom som inte är helt skilt från sin miljökälla med avseende på närvaron av taxa men modulerar deras överflöd genom att berika för en delmängd av de tillgängliga taxa, vilket i slutändan resulterar i ett kärnmasktarmmikrobiom som delas mellan maskar uppvuxna i olika miljöer.
Figur 2: Masktarmsmikrobiomer som samlas bort från sina respektive produktionsdiversifierade mikrobiella miljöer. Mikrobiomkompositionen bestämdes med 16S-sekvensering, och samhällen från mikrokosmos berikade med de angivna produkterna eller från maskar uppvuxna i dem grupperades med PCoA baserat på (A) oviktade eller (B) viktade UniFrac-avstånd. Axlar som visas är de som förklarar den största variationen i gemenskapens sammansättning mellan prover (N = 3 för varje mikrokosmostyp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Nästa generations sekvensering och dataanalys. Här presenteras stegen för biblioteksförberedelse, sekvensering i labbet och dataanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Ett exempel på ett kvalitetskontrolldiagram för omvänd läsning från ett prov. X-axeln (cykeln) visar nukleotidpositionen längs den lästa sekvensen. Den vänstra Y-axeln visar kvalitetsresultatet. Gråskalevärmekartan representerar frekvensen för kvalitetspoängen vid varje nukleotidposition; Den gröna linjen visar mediankvalitetspoängen vid varje nukleotidposition; den övre orange linjen visar kvartilerna i kvalitetspoängfördelningen; den nedre röda linjen visar procentandelen sekvensläsningar som förlängde den nukleotidpositionen (höger Y-axel, här 100%). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Felprocent för olika urval. Felfrekvensen i de olika proverna (svarta prickar) bör minska med ökande kvalitetspoäng för varje möjlig basparersättning som avbildas, vilket återspeglar den förväntade trenden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Ett exempel på PCoA baserat på viktade UniFrac-avstånd. Gruppnamnen som visas i förklaringen representerar de produkter som används för att berika komposten som används i de olika mikrokosmos. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S1: Sekventiell sekvensfiltrering. en Antal sekvensläsningar före filtrering. b-d Varje kolumn representerar antalet sekvensläsningar som återstår efter ett filtreringssteg: filtrering av lågkvalitativa läsningar (steg 2.5), denoisingalgoritm utförd av dada() (steg 2.8), sammanslagning av framåt- och bakåtläsningar (steg 2.9) och borttagning av chimärer (steg 2.11). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S2: Metadatatabell. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att studera tarmmikrobiomet hos nematoder uppvuxna i naturliknande miljöer, vilket erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt för isolering av maskar från naturen eller för att höja dem på syntetiska samhällen.
De tusentals potentiella bakteriearter som fångats i det representativa mikrokosmosexperimentet återspeglar den mikrobiella mångfalden som maskarna har utvecklats med och visar mikrokosmos rörledningens förmåga att kombinera fördelarna med att arbeta med en modellvärdorganisme och fördelarna med att arbeta med naturliga, olika mikrobiella samhällen.
De representativa resultaten visar att anrikning av en gemensam jord med olika produkttyper modulerar miljömikrobiell mångfald och belyser utbudet av mikrobiell mångfald som är tillgänglig för prospektering med hjälp av denna pipeline. Producera val är inte särskilt viktigt. Tidigare arbete har använt bananer, äpplen, apelsiner, jordgubbar, gröna teblad och potatis för att berika jorden, vilket resulterar i liknande maskhöjningseffektivitet. Blandade produkter har också använts effektivt. Nyckelfunktionen är att olika produkter kommer att diversifiera en viss jord på olika sätt.
Trots den stora variationen i miljömikrobiell mångfald varierar masktarmens mikrobiomer betydligt mindre, vilket rekapitulerar vikten av masktarmnischen och värdfiltreringen för montering av ett kärntarmmikrobiom som skiljer sig från dess markmiljö13. Detta mönster observeras bäst med viktad UniFrac PCoA-analys, vilket visar att skillnaderna mellan miljöjord och masktarmmikrobiomer främst härrör från skillnader i det relativa överflödet av nyckeltaxa.
Även om protokollet som beskrivs här fokuserar på att skörda maskar för 16S-sekvensering, kan mikrokosmos användas för att utforska ytterligare frågor av intresse. Till exempel kan maskar som skördats från mikrokosmos därefter undersökas för effekten av ett varierat tarmmikrobiom på värdresistens mot olika negativa tillstånd, inklusive patogener eller toxiner. Alternativt kan nya bakteriearter och stammar isoleras och odlas från markskördade maskar, vilket utökar den taxonomiska och funktionella mångfalden av bakterier som är tillgängliga att utföra experiment med.
Medan forskningsmetoder i laboratoriemiljöer söker konsistens och reproducerbarhet, utnyttjar arbetet med mikrokosmos den naturliga variationen för att utforska värd-mikrobinteraktioner i ett naturligt liknande sammanhang. Denna variation innebär dock också vissa utmaningar. Vissa jordar som innehåller höga nivåer av endogena ryggradslösa djur kan kräva ytterligare centrifugerings-, filtrerings- och undersökningssteg för att effektivt eliminera oönskade organismer från mikrokosmosberedningen. Dessutom kan låg mikrobiell förekomst i jord inducera oönskad dauerbildning i maskpopulationer, vilket kräver en ökning av mikrobiellt extrakt eller berikar jord med en större mängd produkter. Med varje mikrokosmosexperiment som utförs fortsätter forskarna att utforska den fullständiga taxonomiska och funktionella mångfalden som tillhandahålls av naturen, vilket möjliggör upptäckten av nya mikrobiella taxa och funktionella förmågor som sträcker sig från infektionsresistens till skydd mot miljöxenobiotika.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att förklara som är relevanta för innehållet i denna artikel.
Acknowledgments
Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av NIH-bidrag R01OD024780 och R01AG061302. K.T. stöddes vidare av ett Summer Undergraduate Research Fellowship från University of California, Berkeley, finansierat av Rose Hills Foundation. Tecknade mönster i figur 1 erhölls från BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
| Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
| DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
| dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
| Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
| Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
| Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
| M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
| MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
| MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
| Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
| PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
| Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |
References
- Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285 (2017).
- Stiernagle, T.
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604 (2019).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
- Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
- Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343 (2022).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
