Summary
Denne protokol indeholder metoder til generering af 3D-manipuleret hjerte- og skeletmuskelvæv og beskriver deres anvendelse i prækliniske lægemiddelscreeningsmetoder. De beskrevne metoder anvender et magnetisk sensorsystem til at lette den samtidige vurdering af 24 væv parallelt.
Abstract
Nøjagtig modellering af sunde og sygdomstilstande in vitro er afgørende for udviklingen af nye behandlingsstrategier og terapi. For hjerte- og skeletmuskelsygdomme udgør kontraktil kraft og kinetik nøglemålinger til vurdering af muskelfunktion. Nye og forbedrede metoder til generering af manipulerede muskelvæv (EMT'er) fra inducerede pluripotente stamceller har gjort in vitro-sygdomsmodellering mere pålidelig for kontraktilt væv; Imidlertid er reproducerbart fremstilling af væv fra suspenderede cellekulturer og måling af deres kontraktilitet udfordrende. Sådanne teknikker er ofte plaget af høje fejlrater og kræver kompleks instrumentering og tilpassede dataanalyserutiner. En ny platform og enhed, der bruger 3D EMT'er i forbindelse med en etiketfri, meget parallel og automatiseringsvenlig kontraktilitetsanalyse, omgår mange af disse forhindringer. Platformen muliggør let og reproducerbar fremstilling af 3D EMT'er ved hjælp af stort set enhver cellekilde. Vævskontraktilitet måles derefter via et instrument, der samtidig måler 24 væv uden behov for komplekse softwareanalyserutiner. Instrumentet kan pålideligt måle mikronewtonændringer i kraft, hvilket muliggør dosisafhængig sammensat screening for at måle effekten af et lægemiddel eller terapeutisk på kontraktil output. Konstruerede væv fremstillet med denne enhed er fuldt funktionelle, genererer træk og tetaniske sammentrækninger ved elektrisk stimulering og kan analyseres i længderetningen i kultur over uger eller måneder. Her viser vi data fra hjertemuskel-EMT'er under akut og kronisk dosering med kendte toksiske stoffer, herunder et lægemiddel (BMS-986094), der blev trukket fra kliniske forsøg efter patientdødsfald på grund af uventet kardiotoksicitet. Ændret skeletmuskelfunktion i manipuleret væv som reaktion på behandling med en myosinhæmmer præsenteres også. Denne platform gør det muligt for forskeren at integrere komplekse, informationsrige bioengineered modelsystemer i deres lægemiddelopdagelsesworkflow med minimal yderligere træning eller færdigheder, der kræves.
Introduction
Inducerede pluripotente stamcellemodeller (iPSC) bliver i stigende grad nøgleaktører i den prækliniske pipeline for terapeutisk opdagelse og udvikling samt grundlæggende biologisk forskning og sygdomsmodellering 1,2,3,4,5. Kontraktilt væv, såsom hjerte- og skeletmuskulatur afledt af iPSC'er, har et stort potentiale for at forbedre den prædiktive effekt af humane in vitro-undersøgelser, da direkte vurdering af muskelkontraktil kraft og kinetik er kvantitative målinger til undersøgelse af den samlede vævsfunktion 4,6,7,8. Typisk er målinger af kontraktil kraft opnået enten indirekte ved optisk sporing af substratafbøjning 9,10 eller direkte ved fastgørelse af celler/væv til en krafttransducer4,11,12. Selvom disse metoder er nøjagtige, er de i sagens natur lave gennemløb og kræver typisk højt kvalificerede operatører til at indsamle og analysere data.
Tidligere arbejde har vist, at magnetfeltregistrering omgår disse forhindringer og giver en alternativ metode til at vurdere manipuleret muskelfunktion samtidigt på tværs af flere vævskonstruktioner13. Mantarray (Magnetometric Analyzer for eNgineered Tissue ARRAY) 3D Contractility Platform bygger på denne teknologi ved hjælp af en enhed, der er i stand til at måle kontraktiliteten af konstruerede muskelvæv på en meget parallel måde, der udnytter kompleksiteten af 3D-cellulære modeller med screening med højere gennemstrømning14. Platformen muliggør etiketfri, kvantitativ, realtidsovervågning af kontraktil funktion i hjerte- og skeletmuskelvæv i eller uden for en standard cellekulturinkubator, hvilket eliminerer behovet for optisk baseret kontraktil billeddannelse og analyse. Denne teknologi letter direkte sammenligning af sunde og syge cellelinjer og muliggør måling af et lægemiddels virkning på kontraktilt væv, etablering af kvantificerbare, in vitro, sikkerheds- og effektivitetsdata for nye og eksisterende terapeutiske forbindelser.
Konstrueret 3D-muskelvæv kan fremstilles mellem to stolper på en meget reproducerbar måde ved hjælp af Mantarray-forbrugspladen, 24-brønds støbeplade (figur 1). Den ene stolpe er stiv, mens den anden stolpe er fleksibel og indeholder en lille magnet. Når vævskonstruktionen trækker sig sammen, fortrænger den den fleksible stolpe og den indlejrede magnet. EMT-pladen er placeret inde i instrumentet, og postforskydning måles via en række magnetiske sensorer på et printkort under pladeholderen. De målte ændringer i magnetfeltet omdannes til absolut kontraktil kraft ved hjælp af en matematisk algoritme. Instrumentet anvender hurtige dataprøvetagningshastigheder for at muliggøre indsamling af detaljerede oplysninger om funktionskapacitet og modenhed af den eller de celletyper, der analyseres, herunder sammentrækningsfrekvens, hastighed og henfaldstid. Disse funktionelle målinger kan opnås på tværs af alle 24 brønde samtidigt med den magnetiske sensorplatform eller individuelt og sekventielt ved hjælp af traditionelle optiske metoder.
Denne undersøgelse beskriver en meget reproducerbar metode til konstruktion af 3D-skeletmuskulatur og hjertemikrovæv i en fibrinbaseret hydrogel. Under en kort 80-minutters reaktion katalyserer thrombin omdannelsen af fibrinogen til fibrin, hvilket giver et stillads for muskelceller at udvikle sig i suspenderet kultur15. Stromaceller hjælper med at ombygge matrixen, og væv bliver kontraktile, da muskelceller danner et syncytium i hydrogelen. Kontraktiliteten af disse væv blev analyseret ved hjælp af den magnetiske sensing tilgang, både før og efter sammensat eksponering, validerer denne modalitet til brug i dosis-respons lægemiddelundersøgelser. Primære humane myoblaster fra en sund donorbiopsi blev opnået kommercielt og dyrket i 2D i henhold til sælgerens protokoller. Celler blev udvidet ved hjælp af et skeletmuskelvækstmedium gennem tre passager for at generere tilstrækkelige cellenumre til at fremstille 3D-væv. Stromaceller og hiPSC-afledte kardiomyocytter blev dyrket i henhold til sælgerens protokol i 3 dage for at muliggøre genopretning fra kryopræservering, før celler blev kastet i væv. Der gives repræsentative resultater, der illustrerer de typer datasæt, der kan indsamles ved hjælp af den magnetiske sensorplatform. Almindelige faldgruber forbundet med generering af manipuleret væv ved hjælp af disse metoder behandles også.
Protocol
1. Cellekulturprotokol
- Primær human myoblastkultur
- Den ekstracellulære matrix (ECM) fortyndes i forholdet 1:100 i 8 ml DMEM/F12-medium på is.
- Der påføres 8 ml ECM-opløsning på en T175-kolbe og inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time før cellesåning, dog højst 24 timer. Sørg for, at ECM-opløsningen dækker hele kolbebunden.
- Alikvote 5 ml af skeletmuskulaturens vækstmedium til et 15 ml konisk rør.
- Optø et frosset hætteglas med celler (5,0 x 105 myoblaster) i et vandbad ved 37 °C i 2 minutter, eller indtil isen lige er smeltet. Sprøjt hætteglasset med 70% ethanol og overfør det til et biosikkerhedsskab (BSC).
- Overfør cellerne til det aliquoterede medium ved hjælp af en P1000. Triturer ikke. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 3 min.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 1 ml vækstmedium med en P1000-pipette for at opnå en enkeltcellesuspension.
- Den ECM-belagte kolbe vaskes med 15 ml DPBS. Opsug DPBS, og tilsæt derefter 30 ml vækstmedium til kolben.
- Der tilsættes 4 ml vækstmedium til cellerne, blandes og fordeles cellesuspensionen i T-175-kolben. Sørg for, at den samlede lydstyrke er 35 ml. Kolben skubbes forsigtigt langs arbejdsfladen til venstre og højre 5-6 gange efterfulgt af frem og tilbage 5-6 gange for at sikre en jævn fordeling af cellerne på kolbens overflade.
- T-175-kolben anbringes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2. Dyrk cellerne i 3 dage, eller indtil de ikke når mere end 70% sammenløb, og passér derefter cellerne.
- Passerende primære humane myoblaster
- ECM fortyndes i forholdet 1:100 i 30 ml DMEM/F12-substrat på is.
- 10 ml ECM-opløsning påføres tre T225-kolber, og der inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time før cellesåning, dog højst 24 timer. Sørg for, at ECM-opløsningen dækker hele kolbebunden.
- Vask cellerne med 15 ml DPBS. Aspirer og tilsæt dissociationsreagenset i henhold til leverandørens protokol.
- Når cellerne er løftet, skal du stoppe reaktionen i henhold til leverandørens protokol og samle cellerne i et konisk rør. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 3 min.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 1 ml vækstmedium med en P1000-pipette for at opnå en enkeltcellesuspension.
- Den ECM-belagte kolbe vaskes med 15 ml DPBS. Opsug DPBS, og tilsæt derefter 40 ml vækstmedium til hver T225-kolbe.
- Der tilsættes 14 ml vækstmedium til cellesuspensionen, blandes og fordeles 5 ml cellesuspension i hver T225-kolbe. Sørg for, at det samlede volumen i hver kolbe er 45 ml. Kolben skubbes forsigtigt langs arbejdsfladen til venstre og højre 5-6 gange efterfulgt af frem og tilbage 5-6 gange for at sikre en jævn fordeling.
- Kolberne anbringes i cellekulturkuvøsen ved 37 °C og 5% CO2.
- Kulturceller i 2-3 dage, eller indtil de ikke når mere end 70% sammenløb, og derefter passage. Opdel cellerne i 1:3 eller 1:4 ved hver passage og frø mellem 3 x 103 og 1 x 104 celler/cm2.
- hiPSC-afledt kardiomyocytkultur
- ECM fortyndes i forholdet 1:60 i 12 ml DMEM/F12-substrat på is.
- Der påføres 1 ml ECM-opløsning i hvert hul med to plader med 6 huller, og der inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time før cellesåning, dog højst 24 timer.
- Optø et frosset hætteglas med kardiomyocytter i et vandbad ved 37 °C i 2 minutter, eller indtil isen lige er smeltet.
- Sprøjt hætteglasset med 70% ethanol og overfør det til BSC.
- Brug en p1000-pipette til at overføre de optøede celler til et 50 ml konisk rør.
- Skyl det tomme kryovialt med 1 ml belægningsmedium ved stuetemperatur (RT) for at genvinde eventuelle resterende celler.
- Fordel langsomt 1 ml skyllemedie dråbevis (en dråbe hver 5. s) i det koniske rør af celler i løbet af 90 s. Rør røret kontinuerligt for at blande cellerne under den langsomme medietilsætning.
- Der tilsættes langsomt 8 ml af pletteringsmediet ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette til det 50 ml koniske cellerør.
- Når alle medier er dispenseret, pipetteres forsigtigt op og ned 3 gange for at blande cellerne grundigt. Tæl celler ved hjælp af et hæmacytometer og trypanblåt.
- Centrifuger cellerne i det 50 ml koniske rør ved 300 x g i 3 min.
- Efter pelletering af cellerne aspireres supernatanten.
- Brug en p1000-pipette til at overføre 1 ml af pletteringsmediet til røret, og bryd forsigtigt pillen op ved langsomt at pipettere op og ned 3-5 gange. Resuspender cellerne med et ekstra pletteringsmedium.
- Frø mellem 2-4 x 10 6 celler pr. hul i en6 brøndplade i 2 ml af pletteringsmediet.
- Vask de ECM-belagte 6-brøndsplader med DPBS (2 ml/brønd).
- Pipette 2 ml cellesuspension pr. hul i en plade med 6 huller. Flyt pladerne forsigtigt langs arbejdsfladen til venstre og højre 5-6 gange efterfulgt af frem og tilbage 5-6 gange for at sikre en jævn fordeling af celler på pladeoverfladerne.
- Pladen anbringes i cellekulturkuvøsen ved 37 °C og 5% CO2.
- Gentag trin 1.3.3-1.3.16 for alle hætteglas med cellerne, der skal optøes.
- Skift til 3-5 ml (afhængigt af cellelinje og densitet) vedligeholdelsesmedium den næste dag efter plettering, og skift derefter mediet hver anden dag. Kulturceller i 3-4 dage før støbning i 3D-væv.
- Stromal cellekultur
- 30 ml ECM-opløsning påføres en T175-kolbe og inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time før cellesåning, dog højst 24 timer.
- Alikvote 5 ml stromale cellemedium i et 15 ml konisk rør.
- Optø et frosset hætteglas med stromale celler i et vandbad ved 37 °C i 2 minutter, eller indtil isen lige er smeltet.
- Sprøjt hætteglasset med 70% ethanol og overfør det til BSC.
- Brug en p1000-pipette til langsomt at tilsætte 1 ml stromalcellemediet til de optøede celler i hætteglasset.
- Overfør cellesuspensionen fra hætteglasset til det resterende optøningsmedie i det koniske rør. Brug en 5 ml serologisk pipette til at blande cellerne. Pipette op og ned 3 gange.
- Tæl cellerne ved hjælp af et hæmacytometer og trypanblåt. Drej ikke celler ned.
- Den ECM-belagte T175-kolbe vaskes med 15 ml DPBS.
- Stromale celler overføres til kolben med en massefylde på 3-4 x 103 celler/cm2. Kolben skubbes forsigtigt langs arbejdsfladen til venstre og højre 5-6 gange efterfulgt af frem og tilbage 5-6 gange for at sikre en jævn fordeling af cellerne på kolbens overflade.
- Skift medie næste dag med 45 ml opvarmet stromalcellemedium. Dyrk cellerne i 3-4 dage, før de støbes i 3D-væv.
2. Materiale forberedelse
- Fibrinogen
BEMÆRK: Når du rekonstituerer fibrinogen, skal du sørge for at maksimere mængden af overfladeareal, som fibrinogenpulveret lægges på. I denne protokol blev mængden af fortyndingsmiddel, der blev brugt, optimeret til størrelsen på beholderen, der blev brugt, dvs. lige nok fortyndingsmiddel blev brugt til at dække bunden af skålen. For eksempel lag 0,5 g fibrinogen over 10 ml PBS i en 100 mm skål snarere end et 50 ml centrifugerør. Maksimering af mængden af overfladeareal af fortyndingsmidlet vil reducere den tid, der er nødvendig for at rekonstituere fibrinogenet og reducere potentiel sammenklumpning af protein.- Rekonstituering
- Der overføres 10 ml PBS til en 100 mm cellekulturskål og opvarmes til 37 °C i en cellekulturkuvøse.
- Der lægges 0,5 g fibrinogenpulver på lag over hele overfladen af varm PBS og opbevares ved 37 °C, indtil fibrinogen er helt opløst. Dette bør ikke tage mere end 2 timer. Det opløsende pulver kan forsigtigt hvirvles, men ryst ikke skålen kraftigt.
- Steril filtrering
- Når pulveret er helt opløst, køres opløsningen gennem et 100 μm filter og opsamles i et 50 ml konisk rør for at fjerne eventuelle klumper af geleret fibrinogen.
- Hæld den filtrerede opløsning i en 10 ml sprøjte dækket med et 0,2 μm filter. Skub opløsningen gennem filteret og saml den i et nyt 50 ml konisk rør. Det kan være nødvendigt at skifte filter mere end én gang for at sterilisere alle 10 ml opløsning.
- Der anvendes en prøve på 300 ml sterilt fibrinogen i 1,5 ml mikrocentrifugeglas og opbevares ved -20 °C. Alikvoterne optøs på is eller ved 4 °C efter behov. Undgå gentagen frysning/optøning.
- Rekonstituering
- Thrombin
- Der tilsættes 6 ml PBS og 4 ml diH2O direkte i et hætteglas med thrombin (1 KU) til en 100 E/ml stamopløsning.
- Filtersteriliser med et 0,2 μm filter, alikvote, og opbevar ved -20 °C i 1,5 ml plastmikrocentrifugerør, da trombinadsorberer til glas. Undgå gentagen frysning/optøning.
- Poly(ethylenamin) opløsning (PEI)
FORSIGTIG: PEI er giftigt. Brug passende PV som angivet af producenten.
BEMÆRK: PEI leveres som en 50% w / v-opløsning. Det er meget tyktflydende og vanskeligt at pipette. Lav en 0,1 % opløsning fra en 10 % stamopløsning i stedet for direkte fra 50 % w/v-opløsningen.- Mål 5 ml 50% w / v PEI-opløsning i et 50 ml konisk rør.
- Der tilsættes 20 ml diH2O og blandes, så der opnås en 10% stamopløsning. Denne stærkt koncentrerede stamopløsning kan ikke sterilfiltreres.
- For at fremstille en 0,1% opløsning til cellekultur tilsættes 5 ml 10% lager til 495 ml diH2O. Sterilt filter ved hjælp af en 500 ml filterkolbe og opbevares ved RT i højst 1 uge.
- Glutaraldehyd
FORSIGTIG: Glutaraldehyd er giftigt. Brug passende PV som angivet af producenten.- Glutaraldehyd leveres som en 25% opløsning. For at lave en 0,01% opløsning tilsættes 40 μL til 99,6 ml diH2O. Sterilt filter og opbevares ved 4 °C i højst 1 uge.
- Efter forberedelse
- Anbring forbrugsvævsstøbesæt inde i en steril kulturhætte. Støbesættet indeholder et låg, et stolpegitter med 24 par stolper (et par stolper pr. brønd på en plade med 24 brønde) og en specialiseret pladebund med 24 brønde indeholdende 24 støbebrønde. Hver støbebrønd indeholder en grøft i bunden af brønden for at holde celle / hydrogelkomponenterne og forme dem til et rørformet væv, når hydrogelen polymeriserer (figur 1B).
- Fyld brøndene på en plade med 24 brønde med 1,5 ml / brønd af en 0,1% PEI-opløsning og læg stolper i pladen, så spidserne af hvert par stolper er nedsænket. Lad det sidde i 10 min. PEI vil deponere en positiv ladning på stolperne, så proteiner i hydrogelen fastgøres fast til stolperne under vævsstøbning.
- Brøndene i en anden plade med 24 brønde fyldes med 2 ml/hul steril diH2O, og stolperne overføres. Lad det sidde i 1 min.
- I en tredje plade med 24 brønde fyldes brøndene med 1,5 ml / brønd 0,01% glutaraldehyd (GA) og overføres stolperne. Lad det sidde i 30 min. GA vil fastsætte den positive ladning fra PEI til stolperne.
- Mens stolperne sidder i glutaraldehyd, aspireres diH2O-brøndene, vaskes med 2 ml/brønd steril diH2O, aspireres og genopfyldes med 2 ml/brønd sterildiH2O. En frisk plade med 24 brønde kan bruges i stedet for skylning.
- Når 30 minutter er gået, overføres stolperne til 2 ml / brønd med steril diH2O. Lad det sidde i 1 min.
- DiH 2 O suges op, og der tilsættes yderligere 2 ml/hul steril diH2O. Lad det sidde i 5 min.
- Overfør stolperne til en plade med 24 brønde for at tørre (ca. 15 min).
- Når det er tørt, samles støbesættet igen. Parafilm kanterne for at forsegle låget og pladen sammen, og opbevar derefter ved 4 °C i op til 72 timer før cellesåning. Længere opbevaringstider er sandsynligvis mulige, men er ikke blevet testet.
3. Protokol for vævsstøbning
- Forberedelse af støbeplade
- Tissuestøbesættet forkøles ved 4 °C.
- Overfør en spand is til BSC. På is fremstilles 50 μL trombinopløsning (3 μL trombinstamme + 47 μL EMT-medium) pr. hul, der skal støbes.
BEMÆRK: Se trin 3.2.1 for detaljer om EMT-medium. - Fjern det afkølede støbesæt fra køleskabet, og læg det på en kold blok eller is inde i cellekulturhætten. Læg støbepladen fladt på is og flyt stolpegitteret fra støbepladen til en ny, steril plade med 24 brønde.
- Der pipetteres 50 μL trombinopløsning i hvert forkølet hul på støbepladen.
- Saml sættet igen, og sæt det tilbage i køleskabet, indtil det er nødvendigt til vævsstøbning. Vævene støbes inden for 3 timer efter trombud over brøndene.
- Celle forberedelse
- Forbered EMT-basemedium, sterilt filter og lad det stå på is.
BEMÆRK: Hvis cellespecifikt støbemedium indeholder FBS, skal du bruge varmeinaktiveret FBS, da det kan interagere med fibrinogen og forårsage for tidlig polymerisation.- Forbered hjerte EMT-medium: Tilsæt 500 ml RPMI-medium, 10 ml B27 og 2,5 g aminocapronsyre. (Valgfrit) Tilsæt 10 mM ROCK-hæmmer (tilsæt kun til EMT-mediet, der anvendes til støbning af væv og ikke hele 500 ml volumen).
- Forbered skelet-EMT-medium: Tilsæt 50 ml F10-medium og 0,25 g aminocapronsyre (ACA) til primære EMT'er og 0,1 g ACA til iPSC-afledte EMT'er.
- Dissociationsreagenset af cellekulturkvalitet opvarmes til 37 °C. Opvarm et lige så stort volumen EMT-medium for at fortynde dissociationsreagenset.
BEMÆRK: Det er afgørende, at den anvendte proteas er helt inaktiveret. Aktiv protease vil forstyrre 3D-vævsdannelse og postvedhæftning. - Cellerne (figur 1A) vaskes med PBS. Brug 2 ml / brønd til en 6-brønds plade. Brug 6 ml, 15 ml og 15 ml til henholdsvis en 100 mm opvaskemaskine, T175-kolbe og T225-kolbe.
- Der tilsættes dissociationsreagens af den opvarmede cellekultur for at løfte cellerne og inkubere ved 37 °C i 5 minutter, eller indtil cellerne har løftet sig. Til hjertekulturer skal du bruge 10x dissociationsreagenset. Til stromale celler og skeletmuskelmyoblaster skal du bruge et 1x dissociationsreagens. Brug 1 ml / hul til en 6-brønds plade, 3 ml til en 100 mm skål, 8 ml til en T175-kolbe og 10 ml til en T225-kolbe.
- Kontroller kulturerne hvert 2-3 minut ved at banke på siden af pladen.
- Når cellerne er løftet, overføres de til et 50 ml konisk rør og tritureres med en P1000-pipette for at sikre en enkeltcellesuspension.
- Vask pladen eller kolben med et ekstra EMT-medium for at samle de resterende celler og tilsæt dem til det koniske rør. Brug 1 ml / hul af EMT-mediet til en 6-brønds plade, 2 ml til en 100 mm skål, 5 ml til en T175-kolbe og 5 ml til en T225-kolbe.
- Triturere cellerne for at sikre en enkelt cellesuspension.
- Tilføj EMT-medium for at afslutte dissociationsprocessen, og tag derefter prøver af cellesuspensionerne til celletællinger. Brug 1 ml / hul til en 6-brønds plade, 3 ml til en 100 mm skål, 8 ml til en T175-kolbe og 10 ml til en T225-kolbe.
- Drej cellerne ved 200 x g i 4 min. Udfør celletællinger ved hjælp af et hæmacytometer og trypanblåt, mens suspensioner centrifugeres.
- Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 5 ml EMT-basemedium for at fjerne det resterende dissociationsreagens.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 4 min. Supernatanten suges til syn, og cellesuspensionerne fremstilles ved passende densiteter.
- Forøg levetiden og funktionen af 3D skeletmuskulatur EMT'er med tilsætning af 10% -20% ECM-proteiner i EMT-mediet14,16.
- Frøstamcelleafledte kardiomyocytter og deres stromale celler ved henholdsvis 5 x 10 5 celler og7,5 x 104 celler pr. Vævskonstruktion. Frø skeletmuskulaturens myoblaster ved 7,5 x 105 celler pr. Vævskonstruktion.
- Hjertevæv
- Supernatanten suges til syn, og stromale celler resuspenderes med en densitet på 2,5 x 106 celler pr. ml i EMT-medium og lægges på is. Brug 30 μL af denne suspension pr. EMT.
- Supernatanten suges til syn, og CM'erne resuspenderes med en densitet på 8,3 x 106 celler pr. ml i EMT-medium og lægges på is. Brug 60 μL af denne suspension pr. EMT.
- Skeletmuskulatur væv
- Supernatanten suges op, og skeletmuskelcellerne resuspenderes med en densitet på 8,3 x 106 celler pr. ml i EMT-medium og lægges på is. Brug 90 μL af denne suspension pr. EMT.
- Beregn volumenerne af hver celleopløsning, der kræves for at udgøre det ønskede antal væv (f.eks. 60 μL af de fremstillede CM'er og 30 μL af de fremstillede stromale celler eller 90 μL af skeletmuskelcellerne pr. EMT).
- Pipette de beregnede volumener af celler i et 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 10 μL fibrinogen pr. EMT til cellesuspensionen og hold den på is.
- Samlede reagenser og cellevolumener pr. EMT: Sørg for, at hver EMT har 90 μL celler, 10 μL fibrinogen og 50 μL trombinopløsning.
- Forbered EMT-basemedium, sterilt filter og lad det stå på is.
- Støbning af væv
- Overfør vævsstøbesættet til en cellekulturhætte, og fjern låget (stolpegitter med fleksible og stive stolper skal forblive på støbepladen; Figur 1B). Hold støbepladen med stolpegitter liggende fladt på is.
- Bland celle/fibrinogenblandingen, og træk 100 μL op med en P200-pipette.
- Der tilsættes 100 μL af blandingen til huller, der er fremstillet med 50 μL trombinopløsning, og tritureres 5 gange for at blande godt. Skub ikke pipetten forbi det første stop, og fjern spidsen efter triturering for at undgå at skabe bobler.
- På dette stadium, og indtil stolpegitteret er klar til at blive løftet fra støbepladen (trin 3.3.10), kan enhver bevægelse af gitteret kompromittere vævets langsigtede fastgørelse til stolperne. Hold både gitteret og støbebrøndpladen samtidigt ved hjælp af pegefingeren og tommelfingeren på den ene hånd for at undgå bevægelse af gitteret.
- Gentag med en frisk P200-spids for hvert væv, indtil alt væv er støbt. Bland cellesuspension i et 15 ml konisk rør, inden hvert væv støbes, da cellerne sætter sig hurtigt.
- Overfør forsigtigt det frøede kit til inkubatoren, og sørg for ikke at flytte gitteret. Bevægelse af gitter efter såning kan resultere i nedsat succes med at overføre væv ud af støbebrøndene. Der inkuberes ved 37 °C i 80 minutter, uanset celletype. Dette vil begynde polymerisationen af hydrogelen og tillade proteiner at binde til stolperne.
- I mellemtiden skal du forberede en frisk 24-brøndplade med 2 ml / brønd af EMT-mediet til hjertevæv. 10 mM ROCK-hæmmer kan tilsættes til EMT-mediet, hvis det ønskes. Pladen inkuberes ved 37 °C for at opvarme mediet.
- Der fremstilles 2 ml/hul vækstmedium indeholdende 5 g/l aminocapronsyre (0,2 mm sterilfiltreret) til primært skeletmuskelvæv eller 2 g/l ACA til iPSC-afledte EMT'er. Pladen inkuberes ved 37 °C for at opvarme mediet.
- Efter inkubation tilsættes forsigtigt 1 ml EMT-substrat til kanten af støbehullerne og inkuberes i yderligere 10 minutter ved 37 °C, uanset celletype. Dette vil løsne hydrogelen fra kanterne af støbebrønden og muliggøre let overførsel af vævet.
- Efter 10 minutter løftes stolpegitteret forsigtigt og overføres vævene fra støbepladen til en forberedt 24-brøndplade med medium (figur 1C). Pladerne med væv hældes tilbage i cellekulturkuvøsen ved 37 °C.
- Vedligeholdelse
- Efter 24 timer overføres det støbte væv til en frisk plade med 24 hullers dybde med 2 ml/hul EMT-mediet (uden ROCK-hæmmeren, hvis den medtages) og inkuberes ved 37 °C. For skeletmuskelceller skal du skifte vækstmediet til differentieringsmediet for at fremme myoblastfusion.
- Overfør hjertevævet til friske brønde med 2 ml / brønd EMT-medium hver 2-3 dage.
- Overfør skeletmuskelvævet til friske huller med 2 ml / brønddifferentieringsmedium indeholdende 5 g / l aminocapronsyre (0,2 mm sterilfiltreret) hver 2.-3. dag. Brug 2 g/l ACA til iPSC-afledt væv.
- For at hjælpe med mellemstore ændringer skal du overføre stolpegitteret til en frisk 24-brønds plade i stedet for at skifte mediet i samme plade for at undgå at beskadige 3D-vævene. Forbered en anden 24-brøndplade med EMT-mediet og overfør vævene til det friske medium. Opbevar pladen med det gamle medium sammen med den aktive kultur til brug for den næste medieændring. Overfør stolpegitteret frem og tilbage mellem de to plader i hele dyrkningsperioden. Alternativt kan du bruge en frisk plade til hvert medieskift.
- Mål EMT-sammentrækningen enten via optisk sporing af postafbøjning (figur 1D) eller magnetisk sensorhardware13,14. Hjertevæv begynder at slå spontant efter 3-4 dage i kultur. Skeletmuskelvæv er typisk kontraktilt med elektrisk feltstimulering efter 7 dage i kultur.
Representative Results
Celler blev støbt ind i manipuleret muskelvæv i 2-post forbrugsplade (figur 1). Succesfulde EMT'er vises ensartede, og matrixen fordeles jævnt mellem stillingerne (figur 2A). Matricen skal også vikles rundt om begge stolper og producere ækvivalente ankerpunkter for vævet. Fejl i støbning er sjældne med denne metode og er normalt indlysende med en visuel inspektion. Mislykket EMT-produktion kan variere fra katastrofale fejl, såsom vævsfrigørelse fra stolperne (figur 2B) til mere subtile strukturelle fejl, såsom luftbobler og løs fastgørelse til stolperne (figur 2C, D). Væv med mindre fejl kan stadig være levedygtige, men dataene fra disse væv bør undersøges omhyggeligt for at sikre, at de er sammenlignelige med kompromisløse EMT'er. For eksempel kan luftbobler i en EMT presses ud, når vævet komprimeres over tid, hvilket giver en fuldt funktionel konstruktion uden kontraktile mangler. Disse væv skal dog vurderes fra sag til sag, da luftboblernes placering kan påvirke funktionel genopretning. Luftbobler, der genereres ved stolperne, kan for eksempel påvirke vævsfastgørelse, hvilket kan hindre langsigtet overholdelse af stolpen.
Væv begynder at komprimere inden for de første 24 timer, da celler ombygger matrixen i hydrogelen (figur 3). Komprimering er en gradvis proces og fortsætter normalt i løbet af de første 2-4 uger af kulturen. Samlet set er vævskomprimering konsistent mellem tekniske og biologiske replikater (figur 4). Det er normalt, at nogle cellelinjer komprimerer matrixen mere end andre, da væv modnes over tid. Procentdelen af myogene celler i en konstruktion påvirker hastigheden og den samlede grad af EMT-komprimering. Det samlede myogene indhold for både hjerte- og skeletmuskelcellelinjer bør være over 80% for at minimere variation mellem manipuleret væv. Dette er især vigtigt, når man sammenligner kontraktile kræfter og kinetik på tværs af cellelinjer.
Inden for de første par dage efter støbning begynder kardiomyocytter spontant at slå i kultur og bøjer rytmisk den fleksible post med hver muskelkontraktion. Skeletmuskulaturkonstruktioner trækker sig sammen som reaktion på elektrisk stimulering på dag 7 efter start af differentiering. Feltstimulering blev anvendt på skeletmuskelvæv via en ekstern stimulator fastgjort til et brugerdefineret 24-brønds elektrodelåg. Låget, fremstillet med et par carbonelektroder til hver brønd, sidder oven på vævspladen med 24 brønde og stimulerer samtidig hver EMT til at fremkalde muskelsammentrækninger. Væv blev pacet ved hjælp af en 10 V stimulus for 10 ms pulsvarighed ved 1 Hz under funktionelle målinger. Kontraktile væv indikerer skeletmyoblaster, der er smeltet sammen og danner myorør komplet med funktionelle sarkomerer og kontraktile maskiner. Skelet-EMT'er pletter positivt for myosin tung kæde (MyHC) og dystrophin er lokaliseret til myorørmembranen og afslører en klassisk ringform i tværsnitsimmunohistokemisk analyse (figur 5). Når EMT'er er funktionelle, kan kontraktilitet måles dagligt i det magnetiske sensorinstrument, sporingskraft og kinetik, når konstruktionerne udvikler sig og modnes over tid. Både hjerte- og skeletmuskelvæv forbliver kontraktilt i uger til måneder i 3D-kultur (figur 6), og de kan bruges til en lang række kontraktilitetsundersøgelser.
Den magnetiske detektionsmetode kan bruges til samtidig at måle akutte og kroniske virkninger af strukturelle kardiotoksiske midler, såsom doxorubicin (figur 7) og BMS-986094 (figur 8) samt andre lægemidler, der påvirker muskelkontraktilitet. Optiske sporingsmetoder til sammentrækningsdetektion kan også bruges, men man skal være forsigtig, når man studerer akutte lægemiddeleffekter, da målinger skal tages sekventielt. Den forlængede levetid for hjerte- og skelet-EMT'er i 3D-kultur muliggør langsigtede lægemiddelundersøgelser i disse væv. Dette giver brugerne mulighed for at undersøge virkningerne af gentagen dosering, samt fortsat, langvarig eksponering for forbindelser, der kan vise kardiotoksiske virkninger over tid, som forekommer med doxorubicin. Doxorubicin (dox) er et kemoterapilægemiddelmod kræft 17. Mængden af lægemiddel administreret til patienter varierer afhængigt af typen af kræft, patientens alder, patientens højde og vægt samt andre faktorer. Af denne grund er det vigtigt at teste effekten af dox på tværs af en lang række koncentrationer og leveringsplaner. Her blev hjerte-EMT'er behandlet i løbet af 27 dage med tre separate koncentrationer (0,1 μM, 1 μM og 10 μM) dox (figur 7). Grupperne blev stratificeret yderligere ved at behandle EMT'er ved hver koncentration med enten en bolusbehandling eller kontinuerlig administration med en medium ændring hver 72 timer. Wells givet bolusbehandlinger af dox blev udsat for lægemidlet på tre separate tidspunkter, hvilket muliggjorde genopretning mellem dosering. De to højeste doser bolus og kontinuerlig eksponering viste en øjeblikkelig og langvarig ophør af kontraktil kraftgenerering gennem hele studiet. Den midterste og laveste koncentration havde varierende virkning på vævene afhængigt af administrationsmetoden. I den laveste koncentration af lægemidlet viste bolusgruppen ingen forskel fra kontrollerne. Imidlertid faldt kontraktil kraft efter 2 ugers kontinuerlig eksponering. Mellemklassekoncentrationen af lægemidlet havde en interessant effekt. Mens kontinuerlig dosering reducerede kraften i løbet af de første par dage af behandlingen og varede gennem hele eksperimentet, viste bolusgruppen en genopretning af kontraktil kraft tilbage til kontrolniveauer, når lægemidlet blev vasket ud efter 3 dage. Imidlertid forårsagede den anden bolus af lægemidlet en fuldstændig ophør af kraft efterfulgt af ingen bedring (figur 7), hvilket indikerer, at gentagen dosering ved denne koncentration kan have en kardiotoksisk virkning hos patienter behandlet med dette lægemiddel. Det brede omfang af denne undersøgelse, både i tid og eksperimentelle forhold, fremhæver nytten af 3D-manipulerede væv i toksicitetsscreening, da de forbliver kontraktile og reagerer på kemisk eksponering over længere perioder, hvilket giver mulighed for langsigtede lægemiddelundersøgelser inden for et enkelt sæt muskelvæv. Dette letter ikke kun identifikation af forbindelser, der kan have en kardiotoksisk virkning med kronisk eksponering, men også detektering af potentiel kardiotoksisk administrationstidspunkt.
In vitro toksicitetstest i manipuleret humant muskelvæv er en måde at hjælpe med at holde humane patienter sikre i kliniske forsøg. BMS-986094 er en nukleotidpolymerase (NS5B) hæmmer, der anvendes til behandling af hepatitis C. Lægemidlet var i klinisk fase II-udvikling, da Bristol-Myers Squibb ophørte med udviklingen på grund af flere tilfælde af uventet hjertesvigt hos patienter18,19. Her blev BMS-986094 anvendt på hjerte-EMT'er for at teste, om 3D-konstruerede muskelvæv ville udvikle en kardiotoksisk reaktion på lægemidlet (figur 8). Tre forskellige koncentrationer af lægemidlet blev påført, og væv blev overvåget over 13 dage. Kontraktil kraft faldt med tilsætning af lægemidlet på en dosisafhængig måde (figur 8A). Twitch-frekvensen blev også signifikant påvirket, da slaghastigheden faldt og til sidst stoppede som forventet med fortsat eksponering for den kardiotoksiske forbindelse (p < 0,05, figur 8B). Disse resultater viser, hvordan 3D-manipuleret humant muskelvæv kan bruges til at lette at bringe nye lægemidler på markedet og markere forbindelser, der i sidste ende fejler på grund af kardiotoksicitet. Desuden kan denne teknologi potentielt redde liv ved at afsløre farlige lægemidler, før de sættes i patienter i kliniske forsøg.
Evnen til at måle effekten af akutte og kronisk anvendte lægemidler på humant kontraktilt væv er et vigtigt første skridt, når man undersøger terapi for sikkerhed og effektivitet. Det er imidlertid vigtigt at vide, at koncentrationen af anvendte lægemidler er fysiologisk relevant og egnet til in vitro-test . Skeletmuskelvæv blev anvendt til at fastsætte en IC50-værdi for 2,3-butandionmonoxim (BDM) i en fuld dosis-responskurve. Dette lægemiddel er en velkarakteriseret ATPase-hæmmer af skeletmuskulatur myosin-II20. BDM hæmmer muskelsammentrækninger ved at forhindre dannelse af myosintværbro med actinfilamentet i sarkomerer21. Resultaterne vist her afslører et dosisafhængigt fald i absolut kraft, når lægemidlet påføres og fuldstændig genopretning af kontraktil kraft, når lægemidlet vaskes ud, hvilket indikerer, at den forbigående effekt forhindrer muskelsammentrækninger og ikke blot dræber celler i vævet (figur 9A). Desuden blev der målt en fuld dosis-responskurve på tværs af de syv undersøgte koncentrationer, hvilket etablerede en IC50 på 3,2 mM i disse humane mikrovæv (figur 9B).
Figur 1: EMT-støbning i 2-stolpe-Mantarray-forbrugspladen med 24 brønde . (A) Myogene og stromale celler blev dyrket på 2D-overflader før vævsstøbning. (B) Celler løftes fra 2D-overflader og blandes sammen med ekstracellulære matrixproteiner for at danne hydrogeler i de enkelte pladestøbebrønde vist i indsatsen. C) plade med 24 brønde indeholdende manipuleret væv i hver brønd. (D) Repræsentativt væv, der viser afslappet og kontraheret konstrueret muskel, sammenligning af forskydning af magnetposten (grønne bjælker). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Vellykket og mislykket EMT-støbning . (A) Ideelt konstrueret muskelvæv 24 timer efter støbning ensartet komprimeret omkring stolperne med homogen celle/matrixsammensætning i hele vævet. (B) Mislykket EMT, der viser frigørelse af hydrogelen fra den fleksible stolpe. (C) EMT indeholdende luftbobler i hele vævet. (D) Ulige vævsaflejring omkring begge stillinger. Væv er løst forankret til den fleksible stolpe på den ene side. Vægtstænger er 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Komprimering i manipuleret muskelvæv over tid. (A) EMT-konstruktion vist 1 dag efter støbning. Væv overføres til differentieringsmedium, begyndende dag 0 af cellefusion og hydrogelkomprimering. (B-E) Den samme EMT på dag 7 til dag 21 viser en lidt kortere samlet længde mellem de to stolper over tid og mindre bredde målt gennem den midterste del af EMT. Vægtstænger er 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: EMT-diameter over tid. Fire plader af væv blev sporet over 21 dage og sammenlignede EMT-diameter gennem komprimering. Hvert væv blev målt gennem midtersektionen hver uge ved hjælp af optisk mikroskopi. Tidspunkter viser ensartet EMT-størrelse mellem plader. Maksimal komprimering nås på dag 21, da matrixombygning stabiliseres. Tabellen viser standardafvigelsen (% af totalen) for komprimering inden for hver vævsplade og den gennemsnitlige afvigelse for alle plader. Farvede stænger er individuelle plader. Fejlbjælker er SD for EMT'er inden for plader. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Immunhistokemi af det konstruerede skeletmuskelvæv. EMT'er blev fastsat på dag 10 i kulturen og indlejret i paraffin. Tynde tværsnit (7 μm) blev farvet med antistoffer mod myosin tung kæde og dystrophin før billeddannelse. Grøn = MyHC, rød = Dystrofin, blå = DAPI. Objektiv forstørrelse er 40X; Skalabjælken er 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kontraktil kraft i manipuleret muskelvæv over tid. (A) Gennemsnitlig absolut trækkraft målt fra hjerte-EMT'er fra dag 7 til dag 63 i kultur; n = 3 pr. gruppe. (B) Gennemsnitlig absolut trækkraft i skelet-EMT'er afledt af en primær cellelinje på dag 7 til dag 53 i kultur; n = 3. Fejlbjælker er SD for begge grafer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Akut og kronisk doxorubicinbehandling i det manipulerede muskelvæv. Tre separate dosiskoncentrationer af dox, 0,1 μM, 1 μM og 10 μM, blev leveret enten i bolus eller administreret kontinuerligt til manipuleret muskelvæv i løbet af 27 dage. Bolusdoser af lægemidlet blev tilføjet ved medieændringer på dag 0, 12 og 24, noteret af de grønne pile på X-aksen. Lægemidlet blev tilføjet til medierne ved hver medieændring til kontinuerlig dosering, bemærket af de sorte og grønne pile på X-aksen. Den procentvise ændring i kraft fra baselineværdier (præmedicinsk behandling) er på Y-aksen, og tiden i behandlingsdage er på X-aksen. Lys orange = DMSO kontinuerlig kontrol, mørk orange = DMSO boluskontrol, lysegrøn = 0,1 μM dox kontinuerlig, mørkegrøn = 0,1 μM dox bolus, lyseblå = 1 μM dox kontinuerlig, mørkeblå = 1 μM dox bolus, lysegul = 10 μM dox kontinuerlig, mørkegul = 10 μM dox bolus. Fejlbjælker er SD; n = 3 pr. betingelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Kronisk behandling med BMS-986094 i manipuleret muskelvæv. EMT'er blev behandlet med 0,4 μM (grøn), 2 μM (mørkeblå) og 10 μM (lyseblå) BMS-986094 over 13 dage. (A) Kontraktil trækkraft (Y-akse) falder ved alle lægemiddelkoncentrationer i de første 2 dage, mens kontrolvævene i DMSO fortsætter med at blive stærkere over tid (X-aksen). (B) Hjerterytmen eller trækfrekvensen ophører på en dosisafhængig måde i takt med ophør af kontraktil kraft vist i graf A. Kontrolvæv i DMSO (grå) opretholder en regelmæssig slaghastighed under hele eksperimentet. Fejlbjælker er SD; n = 3 pr. betingelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Dosisrespons på BDM i manipuleret skeletmuskelvæv . (A) Absolut trækkraft falder på en dosisafhængig måde, når primære celleafledte EMT'er udsættes for 2,3-butandionmonoxim (BDM) på dag 16 i 3D-kultur. Absolut trækkraft vender tilbage til nær baselineværdier, når lægemidlet vaskes ud. (B) Absolut trækkraft normaliseret til basislinjeværdier falder på en dosisafhængig måde, når den udsættes for BDM, hvilket giver en fuld dosis-responskurve og IC50-værdi ; n = 4 pr. dosis. Fejlbjælker er SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne undersøgelse beskriver metoder til generering af 3D-konstrueret hjerte- og skeletmuskelvæv i et 24-brønds forbrugsstof. Ved at følge disse metoder er det muligt konsekvent at opnå et komplet udvalg af 24 væv uden støbefejl til efterfølgende lægemiddelscreening. Kritiske overvejelser for at opnå et sådant resultat er at sikre, at alle trin under støbning udføres på is for at forhindre for tidlig polymerisation af hydrogelerne, fjernelse af celledissociationsreagens inden vævsstøbning, grundig blanding af celle- og hydrogelsuspensionen for hvert væv, udskiftning af pipettespidser mellem væv og anvendelse af varmeinaktiveret FBS (hvis det overhovedet anvendes). Det er også vigtigt at sikre, at stolpegitteret ikke flyttes, når støbningen starter og overføres forsigtigt, når hydrogeler er dannet.
Større ændringer omfatter brugen af forskellige celletyper til at opnå hjerte versus skeletale EMT'er og doping af hydrogeler med variable koncentrationer af kældermembranproteiner for at fremme cellulær modning og vævsstabilitet. De gavnlige virkninger af sådan doping skal testes fra sag til sag, men har vist sig at forbedre funktionelle resultater og vævets levetid under visse omstændigheder14,16,22. Det er også bemærkelsesværdigt, at de anførte celletætheder er vejledende og muligvis skal optimeres til forskellige cellelinjer. Alternative hydrogelsammensætninger kan også overvejes som et middel til at ændre de strukturelle og funktionelle egenskaber af de opnåede EMT'er23,24,25. Det indfødte muskelmikromiljø indeholder også understøttende celletyper til fremme af vaskularisering, innervering og matrixaflejring for at understøtte myocytter i form og funktion26,27. Mens systemet beskrevet her i øjeblikket inkorporerer fibroblaster i 3D-hjertevæv, kan yderligere celletyper skabe en mere fysiologisk relevant model til at studere sikkerheden og effekten af terapeutiske forbindelser in vitro. Tidligere er en række understøttende celletyper med succes blevet integreret i 3D-manipulerede væv, der præsenterer en spændende skabelon til fremtidig undersøgelse ved hjælp af den magnetiske sensing kontraktilitetsplatform28,29,30.
Fejlfinding for denne protokol centrerer sig om dannelsen af upålidelige eller inkonsekvente væv under støbeprocessen. Der skal udvises forsigtighed for at undgå bobledannelse i hydrogelerne, når de støbes, samtidig med at cellerne stadig lettes jævn fordeling under blanding. Optimeringseksperimenter vil sandsynligvis være nødvendige for hver ny celletype for at identificere ideelle celletætheder, celleforhold og matrixsammensætning.
En væsentlig begrænsning for denne teknik er det betydelige antal celler, der kræves for at etablere en fuld plade på 24 EMT'er. For de data, der præsenteres her, blev 15 millioner kardiomyocytter og 18 millioner skeletmyoblaster brugt pr. Plade. Visse forskere har muligvis ikke adgang til så store puljer af cellulært materiale, hvilket kan hæmme deres evne til at bruge denne platform i fuldt omfang. Hvis slutbrugerne ikke har adgang til magnetisk sensorhardware, skal målinger af efterbøjninger udføres optisk, hvilket reducerer gennemstrømningen betydeligt og forhindrer samtidig registrering af muskelsammentrækninger på tværs af flere brønde. Mantarray-hardwaren overvinder imidlertid disse begrænsninger for at tilbyde det første kommercielle system, der er i stand til kontinuerlig, ikke-invasiv analyse af EMT-sammentrækning samtidigt på tværs af flere konstruktioner.
Magnetisk sensing på tværs af 24 brønde letter langsgående undersøgelser af EMT-funktionel udvikling i realtid og muliggør nøjagtig måling af akutte reaktioner på kemisk, miljømæssig eller genetisk manipulation. Mens magnetisk sensing har flere fordele, såsom samtidig måling på tværs af flere væv, og ikke kræver kompliceret dataanalyse, muliggør optiske detektionsmetoder samtidig måling af fysiologiske målinger såsom calciumflux eller spændingskortlægning. Datasæt som dem, der er illustreret i resultatafsnittet, viser imidlertid bredden af applikationer, som denne teknologi har i lægemiddeludviklingsområdet. I betragtning af at få assays på markedet tilbyder midlerne til at udføre en direkte vurdering af kontraktil output i konstruerede muskler, har disse metoder potentialet til at revolutionere den prækliniske udviklingspipeline.
Disclosures
Alle forfattere er medarbejdere og kapitalejere i Curi Bio Inc., det firma, der kommercialiserer Mantarray-hardwaren og tilhørende software.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af finansiering fra Food and Drug Administration (U01 FD006676-01 tildelt Health and Environmental Sciences Institute) og af finansiering fra National Institutes of Health (HL151094 til Dr. Geisse). Vi takker Dr. Alec S. T. Smith for hans hjælp med udarbejdelsen af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | CELLTREAT | 229485 | |
| 100 mm cell culture dish | ThermoFisher | 150466 | |
| 50 mL Steriflip filter | MilliporeSigma | SCGP00525 | |
| 500 mL filter flask | MilliporeSigma | S2GVU05RE | |
| 6-aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| Cardiosight Maintenance Medium | NEXEL | CM-002A | |
| Cardiosight Plating Medium | NEXEL | CM-020A | |
| C-Pace EM stimulator | IonOptix | EM | |
| Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit | Primary - DIFF | ||
| Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit | Curi Bio | Primary - MAINT | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Gibco | 10566-016 | |
| Dnase | Sigma | 11284932001 | |
| DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Dystrophin antibody | Abcam | ab154168 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | 10082147 | Must be heat-inactivated |
| Fibrinogen (Bovine) | Sigma | E8630 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Ham's F10 | Gibco | 11550043 | |
| Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
| HS-27A Fibroblasts | ATCC | CRL-2496 | |
| Human Skeletal Muscle Myoblasts | Lonza | CC-2580 | |
| Luer Lock 0.2 µm syringe filter | Corning | 431219 | |
| Luer Lock 10 mL syringe | BH Supplies | BH10LL | |
| Mantarray Instrument | Curi Bio | MANTA-24-B1 | System |
| Mantarray Plate Kits | Curi Bio | MA-24-SKM-5 | Pack of 5 kits |
| Mantarray stimulation lid | Curi Bio | EM | |
| Matrigel (ECM) | Corning | 356231 | |
| Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes | NEXEL | C-002 | |
| Optical Microscope | Nikon Ti2E | MEA54000 | |
| Pan Myosin Heavy Chain antibody | DSHB | MF-20 | |
| Poly(ethyleneimine) | Sigma | P3143 | |
| ROCK inhibitor | StemCell Technologies | Y-27632 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) | Lonza | CC-3245 | |
| Standard 24-well plates | Greiner | M8812 | Other manufacturer's plates will not fit |
| Standard 6-well plates | ThermoFisher | 140675 | |
| Stromal medium (DMEM + 20% FBS) | |||
| T175 Filter Flask | ThermoFisher | 159910 | |
| T225 Filter Flask | ThermoFisher | 159934 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| Trypan Blue solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 | |
| TrypLE Select Enzyme (10x) | Thermo Scientific | A1217702 | |
| TrypLE Select Enzyme (1x) | Thermo Scientific | 12563011 |
References
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
- Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
- Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
- Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
- Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
- Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
- Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
- Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
- Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
- Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
- Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
- Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
- Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
- Scheraga, H. A.
- Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
- Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
- Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
- Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
- Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
- Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
- Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
- Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
- Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
- Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
- Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
- Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
- Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
- Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
- Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).
