Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Доклиническое тестирование лекарств в масштабируемых 3D-инженерных мышечных тканях

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64399
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Curi Bio Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол предоставляет методы создания 3D-инженерных тканей сердца и скелетных мышц и описывает их использование в доклинических методах скрининга лекарств. Описанные методы используют магнитно-сенсорную систему для облегчения одновременной оценки 24 тканей параллельно.

Abstract

Точное моделирование здоровых и болезненных состояний in vitro имеет жизненно важное значение для разработки новых стратегий лечения и терапии. При заболеваниях сердца и скелетных мышц сократительная сила и кинетика являются ключевыми показателями для оценки мышечной функции. Новые и усовершенствованные методы создания инженерных мышечных тканей (ЕМТ) из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток сделали моделирование заболеваний in vitro более надежным для сократительных тканей; Однако воспроизводимое изготовление тканей из взвешенных клеточных культур и измерение их сократимости является сложной задачей. Такие методы часто страдают от высокой частоты отказов и требуют сложных контрольно-измерительных приборов и настраиваемых процедур анализа данных. Новая платформа и устройство, использующее 3D EMT в сочетании с анализом сократимости без меток, с высокой степенью параллельности и автоматизации, обходят многие из этих препятствий. Платформа позволяет легко и воспроизводимо изготавливать 3D-ЕМТ с использованием практически любого источника ячеек. Затем сократительная способность тканей измеряется с помощью прибора, который одновременно измеряет 24 ткани без необходимости сложных процедур анализа программного обеспечения. Прибор может надежно измерять изменения силы микроньютонов, что позволяет проводить дозозависимый скрининг соединений для измерения влияния лекарственного средства или терапевтического средства на сократительный выход. Сконструированные ткани, изготовленные с помощью этого устройства, полностью функциональны, генерируя подергивания и столбнячные сокращения при электрической стимуляции, и могут быть проанализированы в продольном направлении в культуре в течение недель или месяцев. Здесь мы показываем данные ЕМТ сердечной мышцы при остром и хроническом дозировании известных токсикантов, включая препарат (BMS-986094), который был взят из клинических испытаний после смерти пациентов из-за непредвиденной кардиотоксичности. Также представлена измененная функция скелетных мышц в сконструированных тканях в ответ на лечение ингибитором миозина. Эта платформа позволяет исследователю интегрировать сложные, богатые информацией биоинженерные модельные системы в свой рабочий процесс по открытию лекарств с минимальным дополнительным обучением или навыками.

Introduction

Модели индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) все чаще становятся ключевыми игроками в доклиническом конвейере терапевтических открытий и разработок, а также в фундаментальных биологических исследованиях и моделировании заболеваний 1,2,3,4,5. Сократительные ткани, такие как сердечные и скелетные мышцы, полученные из ИПСК, обладают большим потенциалом для улучшения прогностической силы исследований человека in vitro, поскольку прямая оценка сократительной силы и кинетики мышц является количественным показателем для изучения общей функции тканей 4,6,7,8. Как правило, измерения сократительной силы были получены либо косвенно путем оптического отслеживания отклонения подложки 9,10, либо непосредственно путем прикрепления клеток/тканей к преобразователюсилы 4,11,12. Эти методы, хотя и точны, по своей сути имеют низкую пропускную способность и, как правило, требуют высококвалифицированных операторов для сбора и анализа данных.

Предыдущая работа показала, что зондирование магнитным полем обходит эти препятствия и обеспечивает альтернативный метод оценки сконструированной мышечной функции одновременно в нескольких тканевых конструкциях13. Платформа 3D-сократимости Mantarray (магнитометрический анализатор для eNgineered Tissue ARRAY) основана на этой технологии с использованием устройства, способного измерять сократительную способность сконструированных мышечных тканей в высокой степени параллельно, что использует сложность 3D-клеточных моделей с более высокой пропускной способностьюскрининга 14. Платформа позволяет проводить количественный мониторинг сократительной функции в тканях сердца и скелетных мышц без меток в режиме реального времени в стандартном инкубаторе клеточных культур или за его пределами, устраняя необходимость в оптической сократительной визуализации и анализе. Эта технология облегчает прямое сравнение здоровых и больных клеточных линий и позволяет измерять влияние препарата на сократительные ткани, устанавливая количественные данные о безопасности и эффективности новых и существующих терапевтических соединений in vitro.

Сконструированные 3D-мышечные ткани могут быть изготовлены между двумя стойками с высокой воспроизводимостью с использованием расходной литейной пластины Mantarray с 24 лунками (рис. 1). Один столб жесткий, а другой стойки гибкий и содержит небольшой магнит. Когда тканевая конструкция сжимается, она вытесняет гибкий стержень и встроенный магнит. Пластина EMT расположена внутри прибора, а последующее смещение измеряется с помощью массива магнитных датчиков на печатной плате под держателем пластины. Измеренные изменения магнитного поля преобразуются в абсолютную сократительную силу с помощью математического алгоритма. Прибор использует быструю частоту дискретизации данных, чтобы обеспечить сбор подробной информации о функциональной способности и зрелости исследуемого типа (ов) клеток, включая частоту сокращения, скорость и время распада. Эти функциональные измерения могут быть получены во всех 24 скважинах одновременно с магнитной чувствительной платформой или индивидуально и последовательно с использованием традиционных оптических методов.

В этом исследовании описывается высоковоспроизводимый метод инженерии 3D-скелетных мышц и сердечных микротканей в гидрогеле на основе фибрина. Во время короткой 80-минутной реакции тромбин катализирует превращение фибриногена в фибрин, обеспечивая каркас для развития мышечных клеток во взвешенной культуре15. Стромальные клетки помогают реконструировать матрикс, и ткани становятся сократительными, поскольку мышечные клетки образуют синцитий внутри гидрогеля. Сократительная способность этих тканей была проанализирована с использованием подхода магнитного зондирования как до, так и после воздействия соединения, что подтвердило правильность использования этого метода в исследованиях лекарственных препаратов «доза-реакция». Первичные человеческие миобласты из биопсии здорового донора были получены коммерчески и культивированы в 2D в соответствии с протоколами поставщика. Клетки были расширены с использованием среды для роста скелетных мышц через три прохода, чтобы получить достаточное количество клеток для изготовления 3D-тканей. Стромальные клетки и кардиомиоциты, полученные из hiPSC, культивировали в соответствии с протоколом поставщика в течение 3 дней, чтобы обеспечить восстановление после криоконсервации перед введением клеток в ткани. Приведены репрезентативные результаты, иллюстрирующие типы наборов данных, которые могут быть собраны с помощью платформы магнитного зондирования. Также рассматриваются распространенные ошибки, связанные с генерацией инженерных тканей с использованием этих методов.

Protocol

1. Протокол культивирования клеток

  1. Первичная культура миобластов человека
    1. Разбавьте внеклеточный матрикс (ECM) в соотношении 1:100 в 8 мл среды DMEM/F12 на льду.
    2. Нанесите 8 мл раствора ECM в одну колбу T175 и инкубируйте при 37 °C не менее 1 ч до посева клеток, но не более 24 ч. Убедитесь, что раствор ECM покрывает все дно колбы.
    3. Aliquot 5 мл среды для роста скелетных мышц в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. Разморозьте замороженный флакон с клетками (5,0 х 105 миобластов ) на водяной бане при 37 °C в течение 2 мин или до тех пор, пока лед не растает. Опрыскайте флакон 70% этанолом и перенесите его в шкаф биобезопасности (BSC).
    5. Перенесите клетки в аликвотированную среду с помощью P1000. Не растирать. Центрифугируют клетки при 300 х г в течение 3 мин.
    6. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 1 мл питательной среды с помощью пипетки P1000 для получения одноклеточной суспензии.
    7. Промойте колбу с покрытием ECM 15 мл DPBS. Аспирируйте DPBS, а затем добавьте в колбу 30 мл питательной среды.
    8. Добавьте 4 мл питательной среды в клетки, перемешайте и распределите клеточную суспензию в колбу Т-175. Убедитесь, что общий объем составляет 35 мл. Аккуратно сдвиньте колбу вдоль рабочей поверхности влево и вправо 5-6 раз, затем вперед и назад 5-6 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по поверхности колбы.
    9. Поместите колбу T-175 в инкубатор клеточных культур при температуре 37 °C и 5% CO2. Культивируйте клетки в течение 3 дней или до тех пор, пока они не достигнут слияния не более 70%, а затем проходите клетки.
  2. Пассаж первичных миобластов человека
    1. Разбавьте ECM в соотношении 1:100 в 30 мл среды DMEM/F12 на льду.
    2. Нанесите 10 мл раствора ECM в три колбы T225 и инкубируйте при 37 °C не менее 1 ч до посева клеток, но не более 24 ч. Убедитесь, что раствор ECM покрывает все дно колбы.
    3. Промойте клетки 15 мл DPBS. Аспирируйте и добавьте реагент диссоциации в соответствии с протоколом поставщика.
    4. Как только клетки будут подняты, остановите реакцию в соответствии с протоколом поставщика и соберите клетки в коническую трубку. Центрифугируют клетки при 300 х г в течение 3 мин.
    5. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 1 мл питательной среды с помощью пипетки P1000 для получения одноклеточной суспензии.
    6. Промойте колбу с покрытием ECM 15 мл DPBS. Аспирируйте DPBS, а затем добавьте 40 мл питательной среды в каждую колбу T225.
    7. Добавьте 14 мл питательной среды в клеточную суспензию, перемешайте и распределите 5 мл клеточной суспензии в каждую колбу T225. Убедитесь, что общий объем в каждой колбе составляет 45 мл. Аккуратно сдвиньте колбу по рабочей поверхности влево и вправо 5-6 раз, затем вперед и назад 5-6 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение.
    8. Поместите колбы в инкубатор клеточных культур при температуре 37 °C и 5% CO2.
    9. Культивируют клетки в течение 2-3 дней или до тех пор, пока они не достигнут не более 70% слияния, а затем прохождения. Разделите ячейки в соотношении 1:3 или 1:4 в каждом проходе и засейте между 3 x 103 и 1 x 104 ячейками / см2.
  3. Культура кардиомиоцитов, полученная из hiPSC
    1. Разбавьте ECM в соотношении 1:60 в 12 мл среды DMEM/F12 на льду.
    2. Наносят по 1 мл раствора ECM в каждую лунку из двух 6-луночных планшетов и инкубируют при 37 °C не менее 1 ч до посева клеток, но не более 24 ч.
    3. Разморозьте замороженный флакон с кардиомиоцитами на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2 минут или до тех пор, пока лед не растает.
    4. Опрыскайте флакон 70% этанолом и перенесите его в BSC.
    5. Используйте пипетку p1000 для переноса размороженных клеток в коническую пробирку объемом 50 мл.
    6. Промойте пустой криовиал 1 мл гальванической среды комнатной температуры (RT), чтобы восстановить оставшиеся клетки.
    7. Медленно дозируйте 1 мл ополаскивателя по каплям (одна капля каждые 5 с) в коническую пробирку клеток в течение 90 с. Непрерывно вращайте пробирку, чтобы перемешать ячейки во время медленного добавления среды.
    8. Медленно добавьте 8 мл гальванической среды с помощью серологической пипетки объемом 10 мл в коническую пробирку клеток объемом 50 мл.
    9. После того, как все средства будут распределены, аккуратно пипеткой вверх и вниз 3 раза, чтобы тщательно перемешать клетки. Подсчитывают клетки с помощью гемацитометра и трипанового синего.
    10. Центрифугируют клетки в конической пробирке объемом 50 мл в дозе 300 x g в течение 3 мин.
    11. После того, как клетки были гранулированы, аспирируйте надосадочную жидкость.
    12. С помощью пипетки p1000 перенесите 1 мл гальванической среды в пробирку и аккуратно разбейте гранулу, медленно пипетируя вверх и вниз 3-5 раз. Ресуспендируют клетки с дополнительной гальванической средой.
    13. Посев между 2-4 x 10 6 клетками на лунку 6-луночной пластины в 2 мл гальванической среды.
    14. Вымойте 6-луночные пластины с покрытием ECM DPBS (2 мл/лунка).
    15. Пипетка 2 мл клеточной суспензии на лунку 6-луночного планшета. Аккуратно перемещайте пластины вдоль рабочей поверхности влево и вправо 5-6 раз, затем вперед и назад 5-6 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по поверхностям пластин.
    16. Поместите планшет в инкубатор клеточных культур при температуре 37 °C и 5%CO2.
    17. Повторите шаги 1.3.3-1.3.16 для всех флаконов клеток, подлежащих размораживанию.
    18. На следующий день после нанесения покрытия замените поддерживающую среду на 3-5 мл (в зависимости от клеточной линии и плотности), а затем меняйте среду через день. Культивируют клетки в течение 3-4 дней перед отливкой в 3D-ткани.
  4. Культура стромальных клеток
    1. Нанесите 30 мл раствора ECM в колбу T175 и инкубируйте при 37 °C не менее 1 ч до посева клеток, но не более 24 ч.
    2. Аликвотируйте 5 мл среды стромальных клеток в коническую трубку объемом 15 мл.
    3. Разморозьте замороженный флакон со стромальными клетками на водяной бане при 37 °C в течение 2 минут или до тех пор, пока лед не растает.
    4. Опрыскайте флакон 70% этанолом и перенесите его в BSC.
    5. Используйте пипетку p1000, чтобы медленно добавить 1 мл среды стромальных клеток к размороженным клеткам во флаконе.
    6. Перенесите клеточную суспензию из флакона в оставшуюся талую среду в конической трубке. Используйте серологическую пипетку объемом 5 мл для смешивания клеток. Пипеткой вверх и вниз 3 раза.
    7. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и трипанового синего. Не раскручивайте клетки вниз.
    8. Промойте колбу T175 с покрытием ECM 15 мл DPBS.
    9. Перенесите стромальные клетки в колбу при плотности 3-4 х 103 клеток/см2. Аккуратно сдвиньте колбу вдоль рабочей поверхности влево и вправо 5-6 раз, затем вперед и назад 5-6 раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по поверхности колбы.
    10. На следующий день смените среду с 45 мл подогретой среды стромальных клеток. Культивируйте клетки в течение 3-4 дней перед отливкой в 3D-ткани.

2. Подготовка материала

  1. Фибриноген
    ПРИМЕЧАНИЕ: При восстановлении фибриногена позаботьтесь о том, чтобы максимально увеличить площадь поверхности, на которую наслаивается порошок фибриногена. В этом протоколе количество используемого разбавителя было оптимизировано в соответствии с размером используемого контейнера, т. е. использовалось ровно столько разбавителя, чтобы покрыть дно посуды. Например, слой 0,5 г фибриногена поверх 10 мл PBS в 100-миллиметровой чашке, а не в 50-литровой центрифужной пробирке. Максимизация площади поверхности разбавителя уменьшит время, необходимое для восстановления фибриногена и уменьшит потенциальное слипание белка.
    1. Восстановления
      1. Перенесите 10 мл PBS в чашку для культивирования клеток диаметром 100 мм и нагрейте до 37 °C в инкубаторе для клеточных культур.
      2. Слой 0,5 г порошка фибриногена по всей поверхности теплого PBS и держать при 37 °C до полного растворения фибриногена. На это должно уйти не более 2 ч. Растворяющийся порошок можно аккуратно взбалтывать, но не стоит энергично встряхивать блюдо.
    2. Стерильная фильтрация
      1. Как только порошок полностью растворится, пропустите раствор через фильтр 100 мкм и соберите его в коническую трубку объемом 50 мл, чтобы удалить любые комки гелеобразного фибриногена.
      2. Налейте отфильтрованный раствор в шприц объемом 10 мл, укупоренный фильтром 0,2 мкм. Протолкните раствор через фильтр и соберите его в новую коническую трубку объемом 50 мл. Возможно, потребуется заменить фильтр более одного раза, чтобы стерилизовать все 10 мл раствора.
      3. Аликвотировать 300 мл стерильного фибриногена в микроцентрифужные пробирки по 1,5 мл и хранить при -20 °C. Разморозьте аликвоты на льду или при температуре 4 °C по мере необходимости. Избегайте повторного замораживания/оттаивания.
  2. Тромбин
    1. Добавьте 6 мл PBS и 4 мл diH2O непосредственно в один флакон с тромбином (1 KU), чтобы получить исходный раствор тромбина 100 ЕД / мл.
    2. Фильтр стерилизуют с помощью аликвотного фильтра 0,2 мкм и хранят при -20 °C в пластиковых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл в виде адсорбции тромбина на стекле. Избегайте повторного замораживания/оттаивания.
  3. Раствор поли (этиленеймина) (PEI)
    ВНИМАНИЕ: PEI токсичен. Используйте соответствующие СИЗ в соответствии с указаниями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PEI поставляется в виде 50% раствора по массе. Он очень вязкий и трудно поддается пипетке. Сделайте 0,1% раствор из 10% исходного раствора, а не непосредственно из 50% раствора по массе.
    1. Отмерьте 5 мл 50% раствора PEI по массе в конической пробирке объемом 50 мл.
    2. Добавьте 20 мл diH2O и перемешайте, чтобы получить 10% исходный раствор. Этот высококонцентрированный исходный раствор не может быть стерильно отфильтрован.
    3. Чтобы приготовить 0,1% раствор для клеточной культуры, добавьте 5 мл 10% сырья к 495 мл diH2O. Стерильный фильтр с помощью фильтрующей колбы объемом 500 мл и храните при ЛТ не более 1 недели.
  4. Глутаровый альдегид
    ВНИМАНИЕ: Глутаровый альдегид токсичен. Используйте соответствующие СИЗ в соответствии с указаниями производителя.
    1. Глутаровый альдегид поставляется в виде 25% раствора. Чтобы получить 0,01% раствор, добавьте 40 мкл к 99,6 мл diH2O. Стерильный фильтр и храните при 4 ° C не более 1 недели.
  5. Постподготовка
    1. Поместите комплект для литья расходных материалов в стерильный культуральный колпак. Литейный комплект содержит крышку, опорную решетку, вмещающую 24 пары стоек (по одной паре стоек на скважину 24-луночной плиты), и специализированное 24-луночное дно пластины, содержащее 24 литейных колодца. Каждая литейная скважина содержит траншею на дне скважины для удержания клеточных/гидрогелевых компонентов и формования их в трубчатую ткань по мере полимеризации гидрогеля (рис. 1B).
    2. Заполните лунки 24-луночного планшета 1,5 мл / лунку 0,1% раствора PEI и поместите столбы в пластину так, чтобы кончики каждой пары столбов были погружены в воду. Оставьте на 10 минут. PEI отложит положительный заряд на штифты, чтобы белки в гидрогеле прочно прикрепились к штифтам во время отливки ткани.
    3. Заполните лунки второй 24-луночной пластины 2 мл/лунка стерильного diH2O и перенесите столбы. Оставьте на 1 минуту.
    4. В третьей 24-луночной пластине заполните лунки 1,5 мл/лунка 0,01% глутарового альдегида (GA) и перенесите столбы. Оставьте на 30 минут. GA зафиксирует положительный заряд от PEI на столбах.
    5. Пока столбы находятся в глутаровом альдегиде, аспирируйте лунки diH2 O, промойте 2 мл / лунку стерильного diH 2 O, аспират и залейте 2 мл / лунку стерильного diH2O. Вместо ополаскивания можно использовать свежую пластину с 24 лунками.
    6. По истечении 30 минут перенесите столбы в 2 мл/лунку стерильного диГ2O. Оставьте на 1 минуту.
    7. Аспирируйте diH 2 Oи добавьте еще 2 мл / лунку стерильного diH2O. Оставьте на 5 минут.
    8. Переложите столбы на 24-луночную пластину для высыхания (примерно 15 мин).
    9. После высыхания соберите литейный комплект. Перепленьте края пленкой, чтобы закрыть крышку и пластину вместе, а затем храните при температуре 4 °C до 72 часов до посева клеток. Более длительное время хранения, вероятно, возможно, но не было протестировано.

3. Протокол тканевого литья

  1. Подготовка литейных плит
    1. Предварительно охладите комплект для литья тканей при температуре 4 °C.
    2. Перенесите ведро льда в BSC. На льду приготовьте 50 мкл раствора тромбина (3 мкл запаса тромбина + 47 мкл среды ЕМТ) на лунку, которую нужно отлить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите шаг 3.2.1 для получения подробной информации о среде EMT.
    3. Достаньте охлажденный набор для литья из холодильника и поместите его на холодный блок или лед внутри колпака для клеточных культур. Положите литейную пластину плашмя на лед и переместите опорную решетку с литейной пластины на новую стерильную 24-луночную пластину.
    4. Пипеткой вводят 50 мкл раствора тромбина в каждую предварительно охлажденную лунку литейной пластины.
    5. Соберите комплект и верните его в холодильник до тех пор, пока он не понадобится для отливки ткани. Отливают ткани в течение 3 ч после тромбина в дополнение к лункам.
  2. Подготовка клеток
    1. Приготовьте базовую среду EMT, стерильный фильтр и оставьте на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если клеточная литейная среда содержит FBS, используйте термоинактивированный FBS, так как он может взаимодействовать с фибриногеном и вызывать преждевременную полимеризацию.
      1. Подготовьте среднюю для сердечной ЕМТ: добавьте 500 мл среды RPMI, 10 мл B27 и 2,5 г аминокапроновой кислоты. (Необязательно) Добавьте 10 мМ ингибитора ROCK (добавляйте только в среду EMT, используемую для литья тканей, а не весь объем 500 мл).
      2. Подготовьте скелетную среду для ЕМТ: добавьте 50 мл среды F10 и 0,25 г аминокапроновой кислоты (АКА) для первичных ЕМТ и 0,1 г АСА для ЕМТ, полученных из ИПСК.
    2. Нагрейте реагент для диссоциации клеточной культуры до 37 °C. Нагрейте равный объем среды EMT, чтобы разбавить диссоциативный реагент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы используемая протеаза была полностью инактивирована. Активная протеаза будет мешать 3D-формированию тканей и постадгезивному устройству.
    3. Промойте ячейки (рис. 1А) с помощью PBS. Используйте 2 мл / лунку для 6-луночной пластины. Используйте 6 мл, 15 мл и 15 мл для чашки диаметром 100 мм, колбы T175 и колбы T225 соответственно.
    4. Добавьте нагретый реагент для диссоциации клеточной культуры, чтобы поднять клетки, и инкубировать при 37 ° C в течение 5 минут или до тех пор, пока клетки не поднимутся. Для посева сердца используйте реагент для 10-кратной диссоциации. Для стромальных клеток и миобластов скелетных мышц используйте реагент для диссоциации 1x. Используйте 1 мл на лунку для 6-луночной тарелки, 3 мл для чашки 100 мм, 8 мл для колбы T175 и 10 мл для колбы T225.
    5. Проверяйте культуры каждые 2-3 минуты, постукивая по боковой стороне тарелки.
    6. После того, как клетки поднимутся, перенесите их в коническую пробирку объемом 50 мл и тритурируйте с помощью пипетки P1000, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию.
    7. Вымойте тарелку или колбу с дополнительной средой EMT, чтобы собрать оставшиеся клетки и добавить их в коническую трубку. Используйте 1 мл на лунку среды EMT для 6-луночной пластины, 2 мл для чашки 100 мм, 5 мл для колбы T175 и 5 мл для колбы T225.
    8. Тритуируйте клетки, чтобы обеспечить одноклеточную суспензию.
    9. Добавьте среду EMT, чтобы остановить процесс диссоциации, а затем возьмите образцы клеточных суспензий для подсчета клеток. Используйте 1 мл на лунку для 6-луночной тарелки, 3 мл для чашки 100 мм, 8 мл для колбы T175 и 10 мл для колбы T225.
    10. Вращайте клетки при 200 х г в течение 4 мин. Выполняйте подсчет клеток с помощью гемацитометра и трипанового синего, пока суспензии центрифугируются.
    11. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в 5 мл основной среды EMT, чтобы удалить остаточный реагент диссоциации.
    12. Центрифугируют клетки при 200 х г в течение 4 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и приготовьте клеточные суспензии с соответствующей плотностью.
    13. Увеличение продолжительности жизни и функции 3D-ЕМТ скелетных мышц с добавлением 10%-20% белков ECM в среду ЕМТ14,16.
    14. Кардиомиоциты, полученные из семенных стволовых клеток, и их стромальные клетки в 5 х 10 5 клеток и7,5 х 104 клеток на тканевую конструкцию соответственно. Засейте миобласты скелетных мышц в количестве 7,5 x 10,5 клеток на тканевую конструкцию.
    15. Сердечные ткани
      1. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют стромальные клетки с плотностью 2,5 х 10,6 клеток на мл в среде ЕМТ и помещают их на лед. Используйте 30 мкл этой суспензии на ЕМТ.
      2. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют КМ с плотностью 8,3 х 10,6 клеток на мл в среде ЕМТ и помещают их на лед. Используйте 60 мкл этой суспензии на ЕМТ.
    16. Ткани скелетных мышц
      1. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки скелетных мышц с плотностью 8,3 х 10,6 клеток на мл в среде ЕМТ и положите их на лед. Используйте 90 мкл этой суспензии на ЕМТ.
    17. Рассчитайте объемы каждого клеточного раствора, необходимые для получения желаемого количества тканей (например, 60 мкл подготовленных КМ и 30 мкл подготовленных стромальных клеток или 90 мкл клеток скелетных мышц на ЕМТ).
    18. Пипеткой нанесите рассчитанные объемы клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.
    19. Добавьте 10 мкл фибриногена на ЕМТ в клеточную суспензию и держите ее на льду.
    20. Общее количество реагентов и объемы клеток на ЕМТ: Убедитесь, что каждая ЕМТ содержит 90 мкл клеток, 10 мкл фибриногена и 50 мкл раствора тромбина.
  3. Тканевое литье
    1. Перенесите набор для отливки тканей в колпак для культивирования клеток и снимите крышку (стойка решетки, содержащая гибкие и жесткие стойки, должна оставаться на литейной пластине; Рисунок 1В). Литейная пластина со стойкой решетки должна лежать ровно на льду.
    2. Смешайте клеточную/фибриногенную смесь и наберите 100 мкл пипеткой P200.
    3. Добавьте 100 мкл смеси в лунки, приготовленные с 50 мкл раствора тромбина, и тритурат 5 раз, чтобы хорошо перемешать. Не проталкивайте пипетку дальше первой упора и не снимайте наконечник после растирания, чтобы избежать образования пузырьков.
    4. На этом этапе и до тех пор, пока опорная решетка не будет готова к подъему с литейной пластины (этап 3.3.10), любое движение решетки может поставить под угрозу долгосрочное прикрепление ткани к штифтам. Держите решетку и литейную колодец одновременно указательным и большим пальцами одной руки, чтобы избежать движения решетки.
    5. Повторите то же самое со свежим наконечником P200 для каждой ткани, пока все ткани не будут отлиты. Смешайте клеточную суспензию в конической пробирке объемом 15 мл перед отливкой каждой ткани, так как клетки быстро оседают.
    6. Аккуратно перенесите семенной комплект в инкубатор, следя за тем, чтобы решетка не сдвинулась. Перемещение решетки после посева может привести к снижению успешности переноса тканей из литейных лунок. Инкубировать при 37 °C в течение 80 мин, независимо от типа клеток. Это начнет полимеризацию гидрогеля и позволит белкам прикрепляться к столбам.
    7. Тем временем подготовьте свежую 24-луночную пластину с 2 мл / лунку среды EMT для сердечных тканей. При желании 10 мМ ингибитор ROCK может быть добавлен в среду ЕМТ. Инкубируйте тарелку при 37 °C, чтобы нагреть среду.
    8. Приготовьте 2 мл/лунку питательной среды, содержащей 5 г/л аминокапроновой кислоты (0,2 мм стерильно отфильтрованную) для первичных тканей скелетных мышц или 2 г/л ACA для ЕМТ, полученных из iPSC. Инкубируйте тарелку при 37 °C, чтобы нагреть среду.
    9. После инкубации осторожно добавьте 1 мл среды EMT к краю литейных лунок и инкубируйте еще 10 мин при 37 ° C, независимо от типа ячейки. Это вытеснит гидрогель с краев отливки и позволит легко переносить ткань.
    10. Через 10 мин осторожно поднимите стоечную решетку и перенесите ткани из литейной пластины на подготовленную 24-луночную пластину со средой (рис. 1В). Верните планшеты с тканями в инкубатор клеточных культур при температуре 37 °C.
  4. Содержание
    1. Через 24 часа переложите отлитые ткани в свежую 24-луночную пластину с 2 мл/лунку среды EMT (без ингибитора ROCK, если он был включен) и инкубируйте при 37 ° C. Для клеток скелетных мышц переключите питательную среду на среду дифференцировки, чтобы способствовать слиянию миобластов.
    2. Переносите сердечные ткани в свежие лунки с 2 мл/лунка среды ЕМТ каждые 2-3 дня.
    3. Каждые 2-3 дня переносят ткани скелетных мышц в свежие лунки с дифференцировочной средой 2 мл/лунка, содержащей 5 г/л аминокапроновой кислоты (0,2 мм стерильно отфильтрованную). Используйте 2 г / л ACA для тканей, полученных из iPSC.
    4. Чтобы помочь в смене среды, перенесите пострешетку на свежую 24-луночную пластину, а не меняйте среду в той же пластине, чтобы не повредить 3D-ткани. Подготовьте вторую 24-луночную пластину со средой EMT и перенесите ткани в свежую среду. Держите тарелку со старой средой рядом с активной культурой, чтобы использовать ее для следующей смены среды. Переносите пострешетку вперед и назад между двумя пластинами на протяжении всего периода культуры. В качестве альтернативы используйте свежую тарелку для каждой смены среды.
    5. Измерьте сокращение ЭМТ либо с помощью оптического слежения за прогибом после (рис. 1D), либо с помощью магнитного чувствительного оборудования13,14. Сердечные ткани начинают биться самопроизвольно через 3-4 дня в культуре. Ткани скелетных мышц обычно сокращаются при стимуляции электрическим полем после 7 дней в культуре.

Representative Results

Клетки были отлиты в сконструированные мышечные ткани в 2-стоечной расходной пластине (рис. 1). Успешные ЕМТ будут казаться единообразными, а матрица будет равномерно распределена между постами (рис. 2А). Матрица также должна обернуться вокруг обеих стоек, создавая эквивалентные опорные точки для ткани. Отказы в литье редки при этом методе и обычно очевидны при визуальном осмотре. Неудачное производство ЕМТ может варьироваться от катастрофических отказов, таких как отслоение тканей от стоек (рис. 2B), до более тонких структурных дефектов, таких как пузырьки воздуха и неплотное крепление к штифтам (рис. 2C, D). Ткани с незначительными дефектами все еще могут быть жизнеспособными, но данные из этих тканей должны быть тщательно изучены, чтобы убедиться, что они сопоставимы с бескомпромиссными ЕМТ. Например, пузырьки воздуха в ЕМТ могут быть выдавлены по мере того, как ткань уплотняется с течением времени, превращая полностью функциональную конструкцию без сократительных недостатков. Однако эти ткани должны оцениваться в каждом конкретном случае, так как расположение пузырьков воздуха может повлиять на функциональное восстановление. Например, пузырьки воздуха, образующиеся на столбах, могут влиять на прикрепление тканей, что может препятствовать долгосрочному прилеганию к столбу.

Ткани начинают уплотняться в течение первых 24 часов, поскольку клетки реконструируют матрицу внутри гидрогеля (рис. 3). Уплотнение является постепенным процессом и обычно протекает в течение первых 2-4 недель культивирования. В целом, уплотнение тканей согласуется между техническими и биологическими репликами (рис. 4). Для некоторых клеточных линий нормально уплотнять матрикс больше, чем другие, поскольку ткани созревают с течением времени. Процент миогенных клеток в конструкции влияет на скорость и общую степень уплотнения ЕМТ. Общее миогенное содержание как для клеточных линий сердца, так и для клеток скелетных мышц должно быть выше 80%, чтобы свести к минимуму различия между искусственно созданными тканями. Это особенно важно при сравнении сократительных сил и кинетики по клеточным линиям.

В течение первых нескольких дней после гипса кардиомиоциты начинают самопроизвольно биться в культуре, ритмично сгибая гибкий штифт при каждом сокращении мышцы. Скелетные мышцы сокращаются в ответ на электрическую стимуляцию к 7-му дню после начала дифференцировки. Полевая стимуляция применялась к тканям скелетных мышц с помощью внешнего стимулятора, прикрепленного к специальной крышке электрода с 24 лунками. Крышка, изготовленная с парой угольных электродов для каждой лунки, находится поверх 24-луночной пластины тканей, одновременно стимулируя каждую ЕМТ, чтобы вызвать мышечные сокращения. Тканям вводили стимуляцию с использованием стимула 10 В в течение 10 мс длительности импульса с частотой 1 Гц во время функциональных измерений. Сократительные ткани указывают на скелетные миобласты, которые слились, образуя миотрубки с функциональными саркомерами и сократительным механизмом. Скелетные ЕМТ окрашиваются положительно для тяжелой цепи миозина (MyHC), а дистрофин локализуется на мембране миотрубки, выявляя классическую форму кольца при поперечном иммуногистохимическом анализе (рис. 5). После того, как ЕМТ функционируют, сократимость может ежедневно измеряться в магнитном чувствительном приборе, отслеживая силу и кинетику по мере развития и созревания конструкций с течением времени. Как сердечные, так и скелетные мышечные ткани остаются сократительными в течение нескольких недель или месяцев в 3D-культуре (рис. 6), и их можно использовать для широкого спектра исследований сократимости.

Подход магнитной детекции может быть использован для одновременного измерения острых и хронических эффектов структурных кардиотоксикантов, таких как доксорубицин (рис. 7) и BMS-986094 (рис. 8), а также других препаратов, влияющих на сократимость мышц. Также можно использовать методы оптического слежения для обнаружения сокращений, но при изучении острых эффектов лекарств необходимо соблюдать осторожность, поскольку измерения должны проводиться последовательно. Увеличенная продолжительность жизни сердечных и скелетных ЕМТ в 3D-культуре позволяет проводить долгосрочные исследования лекарств в этих тканях. Это позволяет пользователям исследовать эффекты повторного дозирования, а также продолжительное длительное воздействие соединений, которые могут проявлять кардиотоксические эффекты с течением времени, как это происходит с доксорубицином. Доксорубицин (докс) является противораковым химиотерапевтическим препаратом17. Количество препарата, вводимого пациентам, варьируется в зависимости от типа рака, возраста пациента, роста и веса пациента, а также других факторов. По этой причине важно проверить влияние докса в широком диапазоне концентраций и графиков доставки. Здесь ЕМТ сердца лечили в течение 27 дней тремя отдельными концентрациями (0,1 мкМ, 1 мкМ и 10 мкМ) докса (рис. 7). Группы были дополнительно стратифицированы путем лечения ЕМТ в каждой концентрации либо болюсным лечением, либо непрерывным введением со сменой среды каждые 72 часа. Уэллс, получавший болюсное лечение доксом, подвергался воздействию препарата в три отдельных момента времени, что позволяло восстанавливаться между дозами. Две самые высокие дозы болюса и непрерывного воздействия показали немедленное и длительное прекращение генерации сократительной силы на протяжении всего исследования. Средние и самые низкие концентрации оказывали различное воздействие на ткани в зависимости от метода введения. При самой низкой концентрации препарата болюсная группа не показала отличий от контрольной группы. Однако сократительная сила уменьшилась после 2 недель непрерывного воздействия. Средняя концентрация препарата оказала интересный эффект. В то время как непрерывное дозирование уменьшало силу в течение первых нескольких дней лечения и продолжалось на протяжении всего эксперимента, болюсная группа показала восстановление сократительной силы до контрольных уровней, когда лекарство было вымыто через 3 дня. Однако второй болюс препарата вызвал полное прекращение действия силы с последующим отсутствием восстановления (рис. 7), что указывает на то, что многократное дозирование в этой концентрации может оказывать кардиотоксическое действие у пациентов, получавших этот препарат. Широкий охват этого исследования, как во времени, так и в экспериментальных условиях, подчеркивает полезность 3D-инженерных тканей в скрининге токсичности, поскольку они остаются сократительными и реагируют на химическое воздействие в течение длительных периодов времени, что позволяет проводить долгосрочные исследования лекарств в одном наборе мышечных тканей. Это облегчает не только идентификацию соединений, которые могут оказывать кардиотоксическое действие при хроническом воздействии, но и выявление потенциальных кардиотоксических сроков введения.

Тестирование токсичности in vitro в сконструированных мышечных тканях человека является одним из способов обеспечения безопасности пациентов в клинических испытаниях. BMS-986094 является ингибитором нуклеотидной полимеразы (NS5B), используемым для лечения гепатита С. Препарат находился в фазе II клинической разработки, когда Bristol-Myers Squibb прекратил разработку из-за нескольких случаев неожиданной сердечной недостаточности у пациентов18,19. Здесь BMS-986094 был применен к сердечным врачам скорой помощи, чтобы проверить, будут ли 3D-инженерные мышечные ткани развивать кардиотоксическую реакцию на препарат (рис. 8). Применялись три различные концентрации препарата, и ткани контролировались в течение 13 дней. Сократительная сила снижалась при добавлении препарата дозозависимым образом (рис. 8А). Частота подергивания также значительно пострадала, поскольку частота ударов замедлилась и в конечном итоге прекратилась, как и ожидалось, при продолжении воздействия кардиотоксического соединения (p < 0,05, рис. 8B). Эти результаты демонстрируют, как 3D-инженерные мышечные ткани человека могут быть использованы для облегчения вывода новых лекарств на рынок и выявления соединений, которые в конечном итоге терпят неудачу из-за кардиотоксичности. Более того, эта технология потенциально может спасти жизни, подвергая воздействию опасные лекарства до того, как они будут введены пациентам в клинических испытаниях.

Способность измерять влияние острых и хронически применяемых лекарств на сократительную ткань человека является жизненно важным первым шагом при исследовании терапевтических средств на предмет безопасности и эффективности. Однако важно знать, что концентрация применяемых лекарств физиологически важна и подходит для тестирования in vitro . Скелетные мышечные ткани были использованы для установления значения IC50 для 2,3-бутандионмоноксима (BDM) на полной кривой доза-реакция. Этот препарат является хорошо охарактеризованным ингибитором АТФазы миозина-II20 скелетных мышц. BDM ингибирует мышечные сокращения, предотвращая образование миозинового поперечного моста с актиновой нитью в саркомерах21. Результаты, показанные здесь, показывают дозозависимое снижение абсолютной силы при применении препарата и полное восстановление сократительной силы при вымывании препарата, что указывает на то, что временный эффект предотвращает мышечные сокращения, а не просто убивает клетки в ткани (рис. 9A). Кроме того, была измерена полная кривая доза-реакция по семи исследованным концентрациям, установив IC50 3,2 мМ в этих микротканях человека (рис. 9B).

Figure 1
Рисунок 1: Отливка EMT в 2-постовой расходуемой пластине Mantarray на 24 лунки . (A) Миогенные и стромальные клетки культивировали на 2D-поверхностях перед отливкой тканей. (B) Клетки поднимают с 2D-поверхностей и смешивают с белками внеклеточного матрикса с образованием гидрогелей в отдельных отверстиях для литья пластин, показанных на врезке. (C) 24-луночная пластина, содержащая инженерные ткани в каждой лунке. (D) Репрезентативные ткани, демонстрирующие расслабленные и сокращенные инженерные мышцы, сравнивающие смещение магнитного столба (зеленые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Успешное и неудачное ЕМТ-литье . (A) Идеальная сконструированная мышечная ткань через 24 часа после отливки, равномерно уплотненная вокруг стержней с однородным клеточно-матричным составом по всей ткани. (B) Неудачная ЕМТ, показывающая отслоение гидрогеля от гибкого поста. (C) ЕМТ, содержащая пузырьки воздуха по всей ткани. (D) Неравномерное осаждение тканей вокруг обоих столбов. Ткань слабо прикреплена к гибкой стойке с одной стороны. Масштабные линейки имеют размер 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Уплотнение в сконструированной мышечной ткани с течением времени. (A) Конструкция EMT показана через 1 день после отливки. Ткани переносятся в среду для дифференцировки, начиная с 0-го дня слияния клеток и гидрогелевого уплотнения. (Б-Е) Та же ЕМТ на 7-й и 21-й день показала немного меньшую общую длину между двумя стойками с течением времени и меньшую ширину при измерении через среднюю часть ЕМТ. Масштабные линейки имеют размер 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Диаметр ЭМТ с течением времени. Четыре пластины тканей отслеживались в течение 21 дня, сравнивая диаметр ЕМТ во время уплотнения. Каждую ткань измеряли через среднюю часть каждую неделю с помощью оптической микроскопии. Временные точки показывают постоянный размер ЕМТ между пластинами. Максимальное уплотнение достигается на 21-й день, когда происходит стабилизация ремоделирования матрицы. В таблице показано стандартное отклонение (% от общего) уплотнения внутри каждой пластины тканей и среднее отклонение для всех пластин. Цветные слитки представляют собой отдельные пластины. Полосы погрешностей - это SD EMT внутри пластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Иммуногистохимия сконструированных тканей скелетных мышц. ЕМТ фиксировали на 10-й день посева и вводили в парафин. Тонкие поперечные срезы (7 мкм) окрашивали антителами против тяжелой цепи миозина и дистрофина перед визуализацией. Зеленый = MyHC, красный = дистрофин, синий = DAPI. Увеличение объектива 40Х; Масштабная линейка составляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Сократительная сила в сконструированных мышечных тканях с течением времени. (A) Средняя абсолютная сила подергивания, измеренная с помощью сердечных ЕМТ с 7-го по 63-й день в культуре; n = 3 на группу. (B) Средняя абсолютная сила подергивания в скелетных ЕМТ, полученная из первичной клеточной линии с 7-го по 53-й день в культуре; n = 3. Полосы погрешностей являются SD для обоих графиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Острое и хроническое лечение доксорубицином в сконструированной мышечной ткани. Три отдельные концентрации дозы dox, 0,1 мкМ, 1 мкМ и 10 мкМ, доставлялись либо болюсно, либо непрерывно вводились в сконструированные мышечные ткани в течение 27 дней. Болюсные дозы препарата добавляли при смене среды на 0, 12 и 24 день, отмеченные зелеными стрелками на оси X. Препарат добавляли в носитель при каждой смене носителя для непрерывного дозирования, отмеченного черными и зелеными стрелками на оси X. Процентное изменение силы по сравнению с исходными значениями (до лечения) находится на оси Y, а время в днях лечения - на оси X. Светло-оранжевый = непрерывный контроль ДМСО, темно-оранжевый = болюсный контроль ДМСО, светло-зеленый = 0,1 мкМ докс непрерывный, темно-зеленый = 0,1 мкМ докс болюсный, светло-синий = 1 мкМ докс непрерывный, темно-синий = 1 мкМ докс болюсный, светло-желтый = 10 мкМ докс непрерывный, темно-желтый = 10 мкМ докс болюс. Полосы погрешностей - SD; n = 3 на условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Хроническое лечение BMS-986094 в сконструированной мышечной ткани. ЕМТ обрабатывали 0,4 мкМ (зеленый), 2 мкМ (темно-синий) и 10 мкМ (светло-голубой) BMS-986094 в течение 13 дней. (A) Сократительная сила подергивания (ось Y) снижается при всех концентрациях препарата в первые 2 дня, тогда как контрольные ткани при ДМСО продолжают усиливаться с течением времени (ось X). (B) Частота сердечных сокращений, или частота подергивания, прекращается в зависимости от дозы в тандеме с прекращением сократительной силы, показанной на графике A. Контрольные ткани в ДМСО (серый) поддерживают регулярную частоту ударов на протяжении всего эксперимента. Полосы погрешностей - SD; n = 3 на условие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 9
Рисунок 9: Доза-реакция на BDM в сконструированных тканях скелетных мышц . (A) Абсолютная сила подергивания уменьшается дозозависимым образом, когда первичные клеточные ЕМТ подвергаются воздействию 2,3-бутандионмоноксима (BDM) на 16-й день в 3D-культуре. Абсолютная сила подергивания возвращается к значениям, близким к исходным значениям, когда препарат вымывается. (B) Абсолютная сила подергивания, нормализованная к исходным значениям, уменьшается дозозависимым образом при воздействии BDM, что дает полную кривую доза-реакция и значение IC50 ; n = 4 на дозу. Полосы погрешностей являются SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В этом исследовании описываются методы создания 3D-инженерных тканей сердца и скелетных мышц в наборе для литья расходных материалов на 24 лунки. Следуя этим методам, можно последовательно достичь полного массива из 24 тканей без сбоев литья для последующего скрининга лекарств. Критическими соображениями для достижения такого результата являются обеспечение того, чтобы во время литья все этапы выполнялись на льду для предотвращения преждевременной полимеризации гидрогелей, удаление реагента диссоциации клеток перед отливкой ткани, тщательное смешивание суспензии клетки и гидрогеля для каждой ткани, замена наконечников пипеток между тканями и использование термоинактивированного FBS (если он вообще используется). Кроме того, важно следить за тем, чтобы стойка решетки не перемещалась после начала отливки и аккуратно переносилась после образования гидрогелей.

Основные модификации включают использование различных типов клеток для достижения сердечной и скелетной ЕМТ и легирование гидрогелей переменными концентрациями белков базальной мембраны для стимулирования клеточного созревания и стабильности тканей. Благотворное влияние такого допинга должно проверяться в каждом конкретном случае, но было показано, что при определенных обстоятельствах он улучшает функциональные результаты и долговечность тканей14,16,22. Также следует отметить, что перечисленные плотности клеток являются ориентировочными и, возможно, должны быть оптимизированы для различных клеточных линий. Альтернативные гидрогелевые композиции также могут рассматриваться как средство для модификации структурных и функциональных свойств достигнутых ЭМТ23,24,25. Нативное мышечное микроокружение также содержит поддерживающие типы клеток, способствующие васкуляризации, иннервации и отложению матрикса для поддержки миоцитов по форме и функции26,27. В то время как система, описанная здесь, в настоящее время включает фибробласты в 3D-ткани сердца, дополнительные типы клеток могут создать более физиологически значимую модель для изучения безопасности и эффективности терапевтических соединений in vitro. Ранее ряд поддерживающих типов клеток был успешно интегрирован в 3D-инженерные ткани, представляя собой захватывающий шаблон для будущих исследований с использованием платформы сократимости магнитного зондирования28,29,30.

Поиск и устранение неисправностей для этого протокола сосредоточено на образовании ненадежных или непоследовательных тканей в процессе литья. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков в гидрогелях во время их отливки, в то же время способствуя равномерному распределению клеток во время смешивания. Эксперименты по оптимизации, вероятно, потребуются для каждого нового типа клеток, чтобы определить идеальную плотность клеток, соотношение клеток и состав матрицы.

Основным ограничением для этого метода является значительное количество клеток, необходимых для создания полной пластины из 24 ЕМТ. Для данных, представленных здесь, было использовано 15 миллионов кардиомиоцитов и 18 миллионов скелетных миобластов на одну пластину. Некоторые исследователи могут не иметь доступа к таким большим пулам клеточного материала, что может препятствовать их способности использовать эту платформу в полной мере. Если конечные пользователи не имеют доступа к аппаратному обеспечению магнитного зондирования, измерения прогибов после необходимо выполнять оптически, что значительно снижает пропускную способность и предотвращает одновременную регистрацию мышечных сокращений в нескольких лунках. Тем не менее, аппаратное обеспечение Mantarray преодолевает эти ограничения, предлагая первую коммерческую систему, способную к непрерывному, неинвазивному анализу сокращения ЕМТ одновременно в нескольких конструкциях.

Магнитное зондирование в 24 скважинах облегчает лонгитюдные исследования функционального развития ЕМТ в режиме реального времени и позволяет точно измерять острые реакции на химические, экологические или генетические манипуляции. В то время как магнитное зондирование имеет ряд преимуществ, таких как одновременное измерение в нескольких тканях, и не требует сложного анализа данных, оптические методы обнаружения позволяют одновременно измерять физиологические показатели, такие как поток кальция или картирование напряжения. Тем не менее, наборы данных, такие как те, которые проиллюстрированы в разделе результатов, демонстрируют широту применения этой технологии в области разработки лекарств. Учитывая, что немногие анализы на рынке предлагают средства для прямой оценки сократительного выхода в сконструированных мышцах, эти методы обладают потенциалом для революции в процессе доклинических разработок.

Disclosures

Все авторы являются сотрудниками и акционерами Curi Bio Inc., компании, которая занимается коммерциализацией оборудования Mantarray и связанного с ним программного обеспечения.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана финансированием Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (U01 FD006676-01, присужденное Институту наук о здоровье и окружающей среде) и финансированием Национальных институтов здравоохранения (HL151094 доктору Гейссе). Мы благодарим д-ра Алека С. Т. Смита за помощь в подготовке этой рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer  CELLTREAT 229485
100 mm cell culture dish ThermoFisher 150466
50 mL Steriflip filter MilliporeSigma  SCGP00525
500 mL filter flask MilliporeSigma  S2GVU05RE
6-aminocaproic acid Sigma A2504
B27 Gibco 17504044
Cardiosight Maintenance Medium NEXEL CM-002A
Cardiosight Plating Medium NEXEL CM-020A
C-Pace EM stimulator  IonOptix  EM
Curi Bio Muscle Differentiation Media Kit Primary - DIFF
Curi Bio Muscle Maintenance Media Kit Curi Bio Primary - MAINT
DAPI Invitrogen D1306
DMEM, high glucose, GlutaMAX Gibco 10566-016
Dnase Sigma 11284932001
DPBS Gibco 14190-250
Dystrophin antibody  Abcam ab154168
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Scientific 10082147 Must be heat-inactivated
Fibrinogen (Bovine) Sigma E8630
Glutaraldehyde Sigma 354400
Ham's F10 Gibco 11550043
Hemacytometer  Sigma  Z359629
HS-27A Fibroblasts ATCC CRL-2496
Human Skeletal Muscle Myoblasts  Lonza  CC-2580
Luer Lock 0.2 µm syringe filter Corning 431219
Luer Lock 10 mL syringe BH Supplies BH10LL
Mantarray Instrument Curi Bio MANTA-24-B1 System
Mantarray Plate Kits Curi Bio MA-24-SKM-5 Pack of 5 kits
Mantarray stimulation lid  Curi Bio EM
Matrigel (ECM) Corning 356231
Nexel Cardiosight-S, Cardiomyocytes NEXEL C-002
Optical Microscope Nikon Ti2E MEA54000
Pan Myosin Heavy Chain antibody  DSHB MF-20
Poly(ethyleneimine) Sigma P3143
ROCK inhibitor StemCell Technologies Y-27632
RPMI Gibco 11875-093
Skeletal Muscle Growth Medium (SkGM-2) Lonza CC-3245
Standard 24-well plates Greiner M8812  Other manufacturer's plates will not fit
Standard 6-well plates ThermoFisher 140675
Stromal medium (DMEM + 20% FBS)
T175 Filter Flask ThermoFisher 159910
T225 Filter Flask ThermoFisher 159934
Thrombin Sigma T4648
Trypan Blue solution, 0.4% ThermoFisher 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Scientific A1217702
TrypLE Select Enzyme (1x) Thermo Scientific 12563011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4, 150 (2013).
  2. Mudera, V., Smith, A. S. T., Brady, M. A., Lewis, M. P. The effect of cell density on the maturation and contractile ability of muscle derived cells in a 3D tissue-engineered skeletal muscle model and determination of the cellular and mechanical stimuli required for the synthesis of a postural phenotype. Journal of Cellular Physiology. 225 (3), 646-653 (2010).
  3. Vandenburgh, H., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Human Gene Therapy. 7 (17), 2195-2200 (1996).
  4. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nature Communications. 9 (1), 126 (2018).
  5. Fleming, J. W., et al. Bioengineered human skeletal muscle capable of functional regeneration. BMC Biology. 18 (1), 145 (2020).
  6. Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs. eLife. 4, 04885 (2015).
  7. Urciuolo, A., et al. Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale. PLOS One. 15 (5), 0232081 (2020).
  8. Afshar, M. E., et al. A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength. Scientific Reports. 10, 6918 (2020).
  9. Sakar, M. S., et al. Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators. Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).
  10. Vila, O. F., et al. Quantification of human neuromuscular function through optogenetics. Theranostics. 9 (5), 1232-1246 (2019).
  11. Khodabukus, A., Baar, K. Defined electrical stimulation emphasizing excitability for the development and testing of engineered skeletal muscle. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (5), 349-357 (2011).
  12. Vandenburgh, H., et al. Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle & Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
  13. Bielawski, K. S., Leonard, A., Bhandari, S., Murry, C. E., Sniadecki, N. J. Real-time force and frequency analysis of engineered human heart tissue derived from induced pluripotent stem cells using magnetic sensing. Tissue Enineering Part C Methods. 22 (10), 932-940 (2016).
  14. Smith, A. S. T., et al. High-throughput, real-time monitoring of engineered skeletal muscle function using magnetic sensing. bioRxiv. , 492879 (2022).
  15. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  16. Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle. Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).
  17. Carvalho, C., et al. Doxorubicin: the good, the bad and the ugly effect. Current Medicinal Chemistry. 16 (25), 3267-3285 (2009).
  18. Ahmad, T., et al. Cardiac dysfunction associated with a nucleotide polymerase inhibitor for treatment of hepatitis C. Hepatology. 62 (2), 409-416 (2015).
  19. Gill, M., et al. From the cover: Investigative nonclinical cardiovascular safety and toxicology studies with BMS-986094, an NS5b RNA-dependent RNA polymerase inhibitor. Toxicological Sciences. 155 (2), 348-362 (2017).
  20. Ostap, E. M. 2,3-Butanedione monoxime (BDM) as a myosin inhibitor. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 23 (4), 305-308 (2002).
  21. Fryer, M. W., Gage, P. W., Neering, I. R., Dulhunty, A. F., Lamb, G. D. Paralysis of skeletal muscle by butanedione monoxime, a chemical phosphatase. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 411 (1), 76-79 (1988).
  22. Fleming, J. W., et al. Functional regeneration of tissue engineered skeletal muscle in vitro is dependent on the inclusion of basement membrane proteins. Cytoskeleton. 76 (6), Hoboken. 371-382 (2019).
  23. Capel, A. J., et al. Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).
  24. Tsui, J. H., et al. Tunable electroconductive decellularized extracellular matrix hydrogels for engineering human cardiac microphysiological systems. Biomaterials. 272, 120764 (2021).
  25. Tsui, J. H., et al. Conductive silk-polypyrrole composite scaffolds with bioinspired nanotopographic cues for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry B. 6 (44), 7185-7196 (2018).
  26. Gabella, G. Muscle cells, nerves, fibroblasts and vessels in the detrusor of the rat urinary bladder. Journal of Smooth Muscle Research. 55 (0), 34-67 (2019).
  27. Christov, C., et al. Muscle satellite cells and endothelial cells: close neighbors and privileged partners. Molecular Biology of the Cell. 18 (4), 1397-1409 (2007).
  28. Bersini, S., et al. Engineering an environment for the study of fibrosis: A 3D human muscle model with endothelium specificity and endomysium. Cell Reports. 25 (13), 3858-3868 (2018).
  29. Gilbert-Honick, J., et al. Engineering functional and histological regeneration of vascularized skeletal muscle. Biomaterials. 164, 70-79 (2018).
  30. Maffioletti, S. M., et al. Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering. Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).

Tags

Биоинженерия выпуск 194
Доклиническое тестирование лекарств в масштабируемых 3D-инженерных мышечных тканях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berry, B. J., Luttrell, S. M.,… More

Berry, B. J., Luttrell, S. M., Moerk, C. T., Macadangdang, J., Perez, J., Gray, K., Ghazizadeh, H., Kharoufeh, S., Nelsen, B., Geisse, N. A. Preclinical Drug Testing in Scalable 3D Engineered Muscle Tissues. J. Vis. Exp. (194), e64399, doi:10.3791/64399 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter