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Bioengineering

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

Abstract

A inativação gênica é fundamental para o estudo da função gênica e representa uma estratégia promissora para o tratamento de uma ampla gama de doenças. Entre as tecnologias tradicionais, a interferência do RNA sofre com a revogação parcial do alvo e a exigência de tratamentos ao longo da vida. Em contraste, nucleases artificiais podem impor inativação gênica estável através da indução de uma quebra de fita dupla de DNA (DSB), mas estudos recentes estão questionando a segurança dessa abordagem. A edição epigenética direcionada por meio de repressores transcricionais projetados (ETRs) pode representar uma solução, pois uma única administração de combinações específicas de ETR pode levar a silenciamento durável sem induzir quebras de DNA.

ETRs são proteínas contendo um domínio programável de ligação ao DNA (DBD) e efetores de repressores transcricionais de ocorrência natural. Especificamente, uma combinação de três ETRs equipados com o domínio KRAB do ZNF10 humano, o domínio catalítico do DNMT3A humano e DNMT3L humano, mostrou induzir estados epigenéticos repressivos hereditários no gene alvo do ETR. A natureza hit-and-run dessa plataforma, a falta de impacto na sequência de DNA do alvo e a possibilidade de reverter ao estado repressivo por desmetilação de DNA sob demanda, tornam o silenciamento epigenético uma ferramenta revolucionária. Uma etapa crítica é a identificação da posição adequada das ETRs no gene alvo para maximizar o silenciamento no alvo e minimizar o silenciamento fora do alvo. Realizar essa etapa no cenário pré-clínico final ex vivo ou in vivo pode ser complicado.

Tomando o sistema CRISPR/Cas9 cataliticamente morto como um DBD paradigmático para ETRs, este artigo descreve um protocolo que consiste na triagem in vitro de RNAs guia (gRNAs) acoplados à combinação triplo-ETR para silenciamento eficiente no alvo, seguido pela avaliação do perfil de especificidade genômica de top hits. Isso permite reduzir o repertório inicial de gRNAs candidatos a uma pequena lista de promissores, cuja complexidade é adequada para sua avaliação final no cenário de interesse terapeuticamente relevante.

Introduction

A inativação gênica tem tradicionalmente desempenhado um papel fundamental no estudo da função gênica em modelos celulares e animais. Além disso, nas últimas duas décadas, com o surgimento da terapia gênica, ela tem sido proposta como uma abordagem potencialmente revolucionária para tratar doenças causadas por mutações de ganho de função1, doenças infecciosas2 ou patologias nas quais o silenciamento de um gene pode compensar um defeito hereditário em outro3. Finalmente, a inativação genética de reguladores-chave da aptidão celular e do controle funcional tem sido proposta para aumentar a eficiência de produtos celulares para imunoterapia do câncer4 e medicina regenerativa5.

Dentre as diferentes tecnologias para realizar a inativação gênica, uma das mais promissoras é osilenciamento epigenético direcionado6,7. No centro dessa tecnologia estão os chamados repressores transcricionais projetados (ETRs), proteínas quiméricas que consistem em um domínio programável de ligação ao DNA (DBD) e um domínio efetor (ED) com função repressiva epigenética. Proteínas de dedo de zinco (ZFPs)8, efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs)9 ou DBDs baseados em CRISPR/dCas910 podem ser projetados para conectar seletivamente o DE à sequência promotor/intensificadora do gene alvo a ser silenciado. Uma vez lá, a DE da ETR realiza sua atividade silenciadora impondo marcas epigenéticas repressivas indutoras de heterocromatina, como modificações de histonas (metilação de H3K9 11,12 ou H3K27 13, desacetilação de H3 ou H4 14) e metilação do DNA CpG 15, de acordo com o domínio repressivo utilizado.

Em particular, inspirados pelos processos moleculares de repressão transcricional permanente de retrovírus endógenos que ocorrem no embrião pré-implantação16, uma combinação de três ETRs foi gerada para explorar os seguintes DEs: i) o domínio Krüppel-associated box (KRAB) do ZNF10 humano; ii) o domínio catalítico da DNA metiltransferase 3A humana de novo (DNMT3A); e iii) o DNA humano metiltransferase 3-like (DNMT3L). O KRAB é um domínio repressivo conservado compartilhado por várias ZFPs em vertebrados superiores17,18, cuja atividade de silenciamento é baseada principalmente em sua capacidade de recrutar KAP1 19-uma proteína scafold que então interage com vários outros indutores de heterocromatina 20 - compreendendo o complexo de remodelamento e desacetilação de nucleossomos (NuRD) 21, a histona metiltransferase H3K9 SETDB1 22 e o leitor de metilação H3K9 HP1 23, 24, entre outros.

DNMT3A transfere ativamente grupos metil no DNA em sequências CpG25. A atividade catalítica de DNMT3A é aumentada por sua associação física com DNMT3L, um parálogo restrito a embriões e células germinativas de DNMT3A que não possui o domínio catalítico responsável pela transferência de grupo metilo26,27. A metilação do DNA em regiões ricas em CpG - referidas como ilhas CpG (CGIs) - embutidas nos elementos promotores/potencializadores de genes de mamíferos é geralmente associada ao silenciamento da transcrição28. É importante ressaltar que, uma vez depositada, a metilação da CpG pode ser herdada de forma estável ao longo da mitose por um complexo molecular baseado em UHRF1-DNMT129.

A superexpressão estável dos ETRs na célula-alvo pode ser problemática, provavelmente devido aos riscos crescentes de atividade fora do alvo e supressão de interatores endógenos de seus locais-alvo fisiológicos ao longo do tempo. Entretanto, a expressão transitória de metades de ETR único pode falhar em induzir silenciamento de longa duração com alta eficiência30, dificultando sua aplicação terapêutica. Portanto, um avanço seminal no campo foi a evidência de que a combinação das três ETRs baseadas em KRAB-, DNMT3A- e DNMT3L pode sinergizar e, mesmo quando apenas temporariamente co-entregue, impor à sequência promotora do gene alvo H3K9 e metilação de CpG. Estes são então lidos e propagados pela célula através da mitose, levando ao silenciamento hereditário em múltiplas linhagens celulares humanas e murinas, bem como células primárias cultivadas ex vivo 30.

É importante ressaltar que o silenciamento epigenético imposto pelas ETRs pode ser revertido sob demanda por desmetilação de DNA direcionada (por exemplo, recrutamento da desmetilase de DNA TET1 baseada em CRISPR/dCas9 no locus silenciado) ou farmacológica (administração do inibidor de DNA metiltransferase 5-Aza)30, um antídoto potencial em caso de eventos adversos relacionados à ETR. ETRs all-in-one contendo os três DEs baseados em KRAB-, DNMT3A- e DNMT3L também foram descritos, mostrando eficiências de silenciamento significativas em linhagens celulares31,32 contra a grande maioria dos genes codificadores de proteínas. Além disso, vários estudos empregando as ETRs relataram um alto perfil de segurança, sem grande atividade fora do alvo em termos de metilação de novo da CpG ou alteração da acessibilidade da cromatina30,31,32. No entanto, uma análise dedicada do perfil de especificidade de ETRs equipados com um DBD recém-projetado é recomendada antes de aplicações clínicas.

Do ponto de vista clínico, o silenciamento epigenético direcionado pode fornecer vantagens críticas tanto para knockdown baseado em RNA (RNAi)33 quanto para ruptura gênica baseada em nuclease artificial8. Em contraste com o RNAi, o silenciamento epigenético direcionado pode induzir a revogação total de seu alvo por célula e não requer tratamento periódico para garantir o silenciamento a longo prazo; em contraste com a ruptura gênica, ela deixa a sequência de DNA inalterada, evitando a geração de quebras de fita dupla de DNA (DSBs). Os DSBs podem, então, induzir apoptose e parada do ciclo celular, potencialmente levando a uma seleção contra células com uma via p53 funcional 34,35 e, especialmente em configurações de edição gênica multiplex, rearranjos cromossômicos35. Além disso, ao transmitir o resultado irreversível em mosaico do reparo DSB de DNA mediado por junção final não homóloga36, a ruptura gênica não pode evitar o reparo no quadro do alvo em sequências codificadoras funcionais como um dos resultados finais e, em contraste com o silenciamento epigenético, não pode ser apagada sob demanda.

Finalmente, o silenciamento epigenético tem o potencial de ampliar a gama de elementos genéticos direcionáveis para classes totalmente ou pelo menos parcialmente refratárias ao RNAi e à ruptura gênica, como elementos regulatórios não transcritos e RNAs não codificantes30,32. O primeiro passo crítico para qualquer aplicação de silenciamento epigenético direcionado é projetar um painel de ETRs cobrindo as diferentes sequências regulatórias do gene alvo e identificar as de melhor desempenho. O número de ETRs a serem testadas pode ser crucial, considerando a crescente porção do genoma que pode ser alvo das tecnologias programáveis de ligação ao DNA constantemente em desenvolvimento37. Realizar a triagem das ETRs diretamente no tipo celular para silenciar terapeuticamente o gene alvo representaria a opção mais relevante. No entanto, telas de alto rendimento podem ser tecnicamente complicadas em células primárias devido à sua sobrevivência limitada em cultura e sua capacidade de engenharia muitas vezes subótima. Telas em grande escala podem ser ainda mais inviáveis in vivo.

Uma alternativa mais prática consiste em realizar uma triagem inicial de um grande painel de ETRs em linhagens celulares facilmente projetáveis no início e, em seguida, apenas validar as mais promissoras no tipo celular terapeuticamente relevante. Uma questão paralela é a seleção de uma leitura apropriada para medir a eficiência de silenciamento dos ETRs. A avaliação direta do transcrito ou dos níveis de proteína do gene alvo por RT-qPCR, western blot ou ELISA pode ser cara e demorada e pode não ter sensibilidade suficiente, limitando sua aplicação em escalas de alto rendimento. A geração de linhagens celulares repórteres projetadas ad hoc nas quais um fluoróforo é colocado sob o controle transcricional das sequências regulatórias do gene alvo permite a exploração da abordagem baseada em citometria de fluxo para ler o silenciamento epigenético no nível de célula única e em ritmo de alto rendimento.

Seguindo essas considerações gerais, este artigo descreve um protocolo que consiste na triagem in vitro arranjada de ETRs para eficiência de silenciamento no alvo, seguido pela avaliação da atividade off-target do genoma dos principais hits. Esse fluxo de trabalho permite reduzir o repertório inicial de ETRs candidatas a uma pequena lista de promissoras, cuja complexidade é adequada para sua avaliação final no tipo celular de interesse terapeuticamente relevante.

Entre os diferentes DBDs programáveis que podem ser explorados para gerar ETRs, este protocolo se concentrará na tecnologia baseada em CRISPR/dCas9, devido à facilidade de projetar gRNAs abrangendo o promotor do gene alvo em uma escala de alto rendimento. No entanto, o mesmo fluxo de trabalho conceitual descrito abaixo pode ser adotado para avaliar a eficiência e a especificidade de ETRs equipadas com outros DBDs.

Protocol

1. Engenharia de uma linhagem celular repórter baseada em fluorescência para monitorar a atividade transcricional do gene alvo por citometria de fluxo

  1. Identificar linhagens celulares que expressam o gene alvo a ser silenciado. Procure o gene alvo a ser silenciado no Atlas38 de Proteínas Humanas e navegue pela seção "Linha celular" para identificar as linhagens representativas do tecido somático de interesse (por exemplo, uma linhagem celular hepática se os alvos finais forem hepatócitos hepáticos). Alternativamente, interrogue um banco de dados de sequenciamento de RNA disponível publicamente (RNA-Seq) (por exemplo, NCBI GEO).
  2. Entre os candidatos, priorizar linhagens celulares para as quais protocolos eficientes de entrega gênica transitória - instrumentais para entrega de ETR - estão disponíveis.
    OBS: Dentre as diferentes modalidades, a nucleofeção representa uma das melhores opções, pois garante alta eficiência de transfecção. Aqui, células K-562 de eritrleucemia humana foram escolhidas para gerar uma linhagem celular relatando a atividade transcricional do gene beta-2-microglobulina (B2M) (doravante referido como célulasB2M TdTomato K-562).
  3. Priorizar ainda mais os candidatos a evitar linhagens celulares em que o gene alvo é essencial para a viabilidade celular, pois isso prejudica a manutenção de células com silenciamento estável do gene alvo em cultura. Se não for relatado anteriormente, para ter uma noção da essencialidade do gene alvo no tipo de célula de escolha, gerar um controle de ruptura genética transfectando as células com nuclease Cas9 e um gRNA visando um dos primeiros éxons codificadores do gene.
    NOTA: A ruptura genética é um evento estável por definição; A contra-seleção de células interrompidas ao longo do tempo indica que o gene alvo é essencial para a fisiologia da célula selecionada.
    1. Identificar a isoforma de splicing alvo preferencialmente utilizada na linhagem celular selecionada (a isoforma NM_004048.4 do gene B2M é alvo neste protocolo).
    2. Identificar um gRNA que possa cortar de forma eficaz e específica no primeiro éxon codificante da isoforma alvo (por exemplo, Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, que é uma ferramenta de seleção de gRNA on-line válida e fácil de usar).
    3. Para as células K-562, transfectar 1 μg de plasmídeo codificador de spCas9 (hCas9; ver Tabela de Materiais) e 250 ng de plasmídeo codificador de gRNA (phU6-gRNA; ver Tabela de Materiais) por 5 × 105 células através de nucleofeção (de acordo com as instruções do fabricante).
    4. Cultivar as células (células K-562 a 37 °C sob 5% de CO2 em RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino [FBS], L-glutamina e penicilina/estreptomicina [100 U/mL]) e monitorar os níveis de ruptura gênica ao longo do tempo explorando um kit de detecção de mutação (siga as instruções do fabricante).
  4. Clone um molde doador para integração mediada por recombinação homóloga de um repórter fluorescente sob o controle transcricional do gene alvo de interesse (Figura 1).
    1. Identificar a região do gene alvo para integrar o de expressão do fluoróforo.
      NOTA: Evite visar elementos transcricionalmente relevantes, tais como ilhas CpG e regiões enriquecidas para acetilação H3K27 (marcador de promotores ativos e potenciadores). Alterar esses elementos regulatórios (potencialmente importantes para serem visados pelos ETRs para instruir o silenciamento epigenético) torna a linhagem celular repórter menos preditiva da regulação fisiológica do gene alvo.
      1. Se o gene alvo não codificar para uma proteína secretada, funda o repórter ao último códon do gene alvo através de um peptídeo de autoclivagem 2A para manter a funcionalidade do gene alvo.
      2. Se o gene alvo codificar para uma proteína secretada, para evitar a secreção potencial do repórter, coloque o repórter em uma região intrônica do gene alvo. A integração forçada do repórter na transcrição emendada através de um site aceitador de emenda (SA) e a tradução subsequente através de uma sequência de entrada interna do ribossomo (IRES) prejudica a funcionalidade do gene alvo.
    2. Use Chopchop para selecionar o corte de gRNA na região alvo (aqui, um gRNA é selecionado para atingir a sequência 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ do primeiro íntron do gene B2M ).
    3. Projetar um modelo de doador para o local de corte do gRNA consistindo em: i) um braço de homologia esquerdo (n pares de bases [pb] correspondentes à região a montante do local de corte do gRNA); ii) um de expressão transgênica livre de promotores (no caso aqui mostrado, um SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A) favorecendo o splicing com o primeiro íntron do gene B2M ); e iii) um braço de homologia à direita (n bp correspondente à região a jusante do sítio de corte do gRNA).
      NOTA: O comprimento dos braços de homologia necessários para induzir efetivamente a recombinação homóloga pode variar entre diferentes tipos de células (100-500 pb é uma faixa adequada para células K-562).
  5. Entregue o sistema de nuclease CRISPR/Cas9 e o molde do doador dentro da linhagem celular alvo. Para as células K-562, transfectar 1 μg de plasmídeo codificador de spCas9 (hCas9; ver Tabela de Materiais), 250 ng de plasmídeo codificador de gRNA (phU6-gRNA; ver Tabela de Materiais) e 1 μg de plasmídeo codificador de modelo de doador por 5 × 105 células por nucleofeção (de acordo com as instruções do fabricante).
  6. Cultivar as células por pelo menos 14 dias (para células K-562) e monitorar os níveis de expressão do repórter fluorescente ao longo do tempo usando um citômetro de fluxo (ativar o canal de ficoeritrina (PE) para medir a intensidade de fluorescência do repórter tdTomato e seguir as instruções do fabricante para realizar citometria de fluxo).
    NOTA: O modelo do doador - especialmente se baseado em plasmídeo - pode conter sequências promotoras crípticas, levando à expressão do repórter fluorescente a partir de cópias não integradas do doador. A cultura das células permite diluir essas cópias não integradas por divisão celular e, finalmente, manter a expressão do repórter apenas a partir das cópias doadoras integradas no genoma alvo.
  7. Clone reporter-positive cells through fluorescence activated cell sorting (FACS) em nível de célula única. Para este protocolo, ative o canal de PE para medir a intensidade de fluorescência do repórter tdTomato e siga as instruções do fabricante para classificar células K-562 tdTomato-positivas por poço de uma placa de 96 poços.
  8. Após a expansão celular em cultura (tipicamente 20-30 dias para células K-562), os clones positivos do repórter de triagem por PCR selecionam um com uma integração bi-alélica do do repórter dentro do locus alvo.
    NOTA: Isso maximiza a expressão do repórter e facilita a resolução adicional entre as células que expressam o repórter e as células silenciadas pelo repórter por citometria de fluxo no tratamento com ETR.
    1. Extrair DNA genômico de 1 × 105 células por clone positivo usando um kit de extração de DNA (seguindo as instruções do fabricante).
    2. Amplificar a região alvo B2M com iniciadores forward (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') e reverse (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') seguindo as instruções do kit de amplificação por PCR. A temperatura de anelamento para este par de primers é de 47,7 °C com DNA polimerases à base de Taq e concentrações de primers de 0,5 μM.
    3. Analise o produto de PCR usando eletroforese em gel de agarose a 1% (seguindo as instruções do fabricante). Tela para clones mostrando a banda relacionada à integração do tdTomato no locus alvo B2M (3.413 pb), sem a banda relacionada ao locus alvo selvagem (1.027 pb).

2. Projetando gRNAs para silenciamento epigenético baseado em CRISPR/dCas 9 do gene alvo

  1. Procure o gene alvo no navegador do genoma UCSC40 e extraia a sequência de nucleotídeos de regiões potencialmente reguladoras de sua atividade transcricional, como ilhas CpG e locais enriquecidos para acetilação de H3K27 (marcador de promotores ativos e potencializadores).
    NOTA: De acordo com um estudo recente, a melhor região alvo é uma janela de 1 kilobase (kb) centrada no local de início da transcrição do gene alvo32.
  2. Cole as sequências selecionadas na ferramenta on-line Chopchop e selecione a repressão como a finalidade dos gRNAs a serem recuperados. Aguarde até que Chopchop forneça uma lista de gRNAs mapeados na sequência genética de interesse e listados de acordo com uma pontuação considerando tanto o número de partidas fora do alvo quanto a eficiência prevista no alvo (Figura 2).
  3. Selecione pelo menos 10 gRNAs por sequência alvo. Se possível, tente selecionar gRNAs que abrangem toda a região a ser interrogada, sem correspondências completas com outras sequências intragênicas ao longo do genoma.

3. Entrega transitória arranjada de ETRs baseados em CRISPR/dCas 9 na linha celular do repórter

  1. Entre os sistemas de liberação de transgenes previamente relatados para a linhagem celular alvo, escolha aqueles que permitem apenas a expressão transgênica transitória, maximizando a eficiência de entrega e minimizando a toxicidade relacionada à manipulação celular. No caso das células K-562, tanto a nucleofeção do plasmídeo quanto a do RNAm são altamente recomendadas, com a produção de plasmídios representando uma alternativa tecnicamente mais fácil e barata.
  2. Clone os gRNAs selecionados na seção 2 e ETRs baseados em CRISPR/dCas9 no sistema de liberação de transgenes de escolha. Veja as etapas a seguir para um protocolo para clonar os ETRs em DNAs plasmidiais.
    NOTA: Plasmídeos que codificam separadamente para dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A e dCas9:DNMT3L30 não estão disponíveis no Addgene. Eles foram clonados substituindo o transativador VP160 do plasmídeo pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (ver Tabela de Materiais) pela sequência de codificação de domínio KRAB, DNMT3A ou DNMT3L30. Um plasmídeo que codifica para um ETR tudo-em-um, denominado CRISPRoff-v2.132, está disponível (ver Tabela de Materiais).
    1. Transformar plasmídeos que codificam para as ETRs em células de E. coli quimicamente competentes (seguindo as instruções do fabricante). Selecionar as colônias para a presença do plasmídeo portador de ETR por digestão de enzimas de restrição e sequenciamento de Sanger e, finalmente, escolher uma das colônias positivas para a produção de DNA plasmidial Midiprep (seguindo as instruções do fabricante).
    2. Clone os gRNAs dentro da espinha dorsal phU6-gRNA (Figura 3).
      1. Usando software de planejamento de biologia molecular, acrescente uma sequência de 5'-CACCG-3' a montante do protoespaçador (a primeira variável 20 nucleotídeos [nt] do gRNA selecionado) para gerar um oligo in silico de 25 nt-longos, referido como SGfw.
      2. Similarmente, acrescente uma sequência 5'-AAAC-3' a montante do complemento reverso do protoespaçador do gRNA selecionado e um 5'-C-3' a jusante dele para gerar um oligo de 25 nt-long referido como SGrv.
      3. Ordenar as sequências SGfw e SGrv como oligos de DNA de fita simples sem sal, ressuspensos em água a 100 μM.
      4. Adicionar 1 μL de cada oligo a 2 μL de tampão de recozimento (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) e 16 μL de água.
      5. Realizar o recozimento do oligo colocando a solução em um termociclador programado para iniciar a 95 °C por 10 min. Em seguida, resfriar gradualmente até 25 °C ao longo de 45 min.
      6. Diluir 1 μL dos oligos recozidos com 99 μL de água livre de nuclease e, em seguida, ligar 1 μL desta diluição com 50 ng de plasmídeo phU6-gRNA previamente digerido com a enzima de restrição BsaI (siga as instruções dos fornecedores de kits de BsaI e ligase para o procedimento de digestão e ligadura).
      7. Transformar 20 μL de células de E. coli quimicamente competentes com 2 μL do produto de ligadura (siga as instruções do fabricante para o procedimento de transformação).
      8. Escolha várias colônias para a produção de Miniprep de DNA plasmidial (siga as instruções do fornecedor) e controle a clonagem bem-sucedida do protoespaçador por sequenciamento de Sanger com o seguinte primer correspondente ao promotor U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Escolha uma das colônias positivas para a produção de DNA plasmidial Midiprep (seguindo as instruções do fabricante).
  3. Forneça os gRNAs selecionados e ETRs baseados em CRISPR/dCas9 na linha celular do repórter na matriz (um gRNA específico por condição) (Figura 3).
    NOTA: Como um caso representativo, o fluxo de trabalho para a nucleofeção de plasmídeos que codificam para dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L e gRNAs visando a ilha B2M CpG em célulasB2M TdTomato K-562 é mostrado nas etapas a seguir.
    1. Preparar tubos separados contendo 500 ng de cada um dos plasmídeos codificadores dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- e dCas9:DNMT3L, mas diferindo para o gRNA a ser testado (125 ng de um plasmídeo codificador de gRNA por tubo). Incluir uma condição de nucleofeção livre de gRNA e ETR como amostra simulada. Execute a tela com pelo menos três réplicas técnicas por amostra.
    2. Pellet 5 × 105 B2M TdTomato K-562 células por tubo e nucleofect-los com a mistura de plasmídios (seguindo as instruções do fabricante).
    3. Ressuspender as células em 200 μL de meio de cultura de células de mamíferos RPMI-1640 previamente aquecido e colocá-las de volta na incubadora.

4. Analisando a atividade transcricional do gene alvo ao longo do tempo

  1. Utilizar citometria de fluxo para medir a porcentagem de células silenciadas em diferentes momentos após a entrega das ETRs (Figura 4). Use células do tipo selvagem (WT) - que não possuem a sequência codificadora de fluoróforos - para definir o limite de células negativas do repórter. Use a amostra tratada com simulação para definir o portão para células positivas do repórter.
    NOTA: Conforme sugerido na etapa 1.3, inclua um controle de interrupção genética no experimento. Isso pode ser útil tanto para monitorar a eficiência da entrega de CRISPR quanto para a aptidão das células privadas do gene alvo; A perda do silenciamento transcricional e da ruptura genética ao longo do tempo pode ser atribuída à essencialidade do gene alvo no tipo celular de escolha. Inclua pontos de tempo de curto (dia 3, dia 7, dia 10) e de longo prazo (dia 21, dia 35) para obter uma indicação da eficiência aguda e de longo prazo do silenciamento.
  2. Identifique os três principais gRNAs em termos de eficiência de silenciamento de longo prazo. Use o FACS para selecionar a subpopulação de repórteres negativos mantida de forma estável nessas amostras. Além disso, realizar FACS das amostras a granel tratadas simuladamente para mantê-las sob o mesmo tratamento que as amostras de teste para permitir a comparação adequada nas análises subsequentes.

5. Avaliação da especificidade do tratamento com ETR por RNA-seq e imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP)-seq

  1. Use RNA-seq para avaliar qualquer eventual desregulação transcricional genômica ampla após a entrega de ETR.
    1. Tanto para a subpopulação silenciada pelo repórter das amostras tratadas com os três gRNAs de melhor desempenho quanto para as células tratadas simuladamente, extraia o RNA usando kits disponíveis comercialmente. Avaliar a qualidade e concentração do RNA usando kits disponíveis comercialmente.
    2. Realizar fragmentação de RNA, retrotranscrição e preparação de bibliotecas usando kits disponíveis comercialmente para a preparação de bibliotecas de RNA-seq (seguindo as instruções do fabricante).
    3. Realizar quantificação de bibliotecas e controle de qualidade utilizando instrumentos de controle de qualidade compatíveis com sequenciamento de última geração e eletroforese digital.
    4. Bibliotecas de sequência em um sequenciador de próxima geração seguindo as instruções do fabricante, com um protocolo de extremidade emparelhada de 100 pb e visando uma média de 45 M de leituras/amostra.
    5. Alinhe as tags de leitura ao genoma de referência apropriado e quantifique a expressão da transcrição. Realizar alinhamento na sequência tdTomato e quantificá-la separadamente.
      NOTA: Aqui, o alinhador STAR (v 2.3.0)43, com parâmetros padrão, acoplado ao pacote Rsubread44 é usado.
    6. Realizar análise dos dados de RNA-seq de acordo com as melhores práticas publicadas45.
      NOTA: O pacote R/Bioconductor edgeR46 é usado aqui, aplicando um filtro de pelo menos uma contagem por milhão (cpm) em pelo menos três amostras para descartar genes de baixa expressão. Como alternativa, a função filterByExpr no edgeR pode ser usada.
    7. Avaliar a expressão gênica diferencial usando um modelo log-linear generalizado binomial negativo implementado edgeR (função glmFit)47. Definir um limiar de 0,01 em valores de p ajustados (correção de Benjamini-Hochberg [BH]) para reter genes diferencialmente regulados.
  2. Avaliar qualquer eventual atividade de metilação de CpG fora do alvo das ETRs por MeDIP-seq.
    1. Tanto para a subpopulação silenciada pelo repórter das amostras tratadas com os três principais gRNAs quanto para as células tratadas simuladamente, extraia o DNA genômico usando kits disponíveis comercialmente (seguindo as instruções dos fabricantes).
    2. Sonicate 500 ng de DNA genômico usando um ultrasonicator e os seguintes parâmetros: Dever: 20 %; PIP: 175; Ciclos por Burst: 200; Tempo: 40 s.
    3. Preparar bibliotecas de sequenciamento com os kits disponíveis comercialmente para MeDIP-seq (seguindo as instruções do fabricante).
    4. Após a etapa de ligadura do adaptador, quantificar bibliotecas por ensaio fluorométrico e verificar a eficiência da ligadura por qPCR usando kits de quantificação de bibliotecas disponíveis comercialmente (seguindo as instruções do fabricante).
    5. Obtenha pools de bibliotecas misturando bibliotecas selecionadas aleatoriamente para reduzir vieses técnicos. Use uma quantidade de biblioteca igual (ng) para cada biblioteca para equilibrar os pools. A cada pool, adicione o DNA de controle de spike-in metilado e não metilado fornecido no kit. Para fins de controle, manter um volume de 10% da biblioteca, rotulado como "entrada" e não imunoprecipitado. Realizar imunoprecipitação nos 90% restantes da biblioteca usando o anticorpo monoclonal direcionado contra a 5-metilcitosina fornecido no kit MeDIP-seq.
    6. Purificar bibliotecas enriquecidas e de entrada usando os kits para purificação do produto de imunoprecipitação de 5-metilcitosina, seguindo as instruções do fabricante.
    7. Avalie a eficiência do enriquecimento realizando PCR quantitativo em tempo real no pico interno de controles usando primers fornecidos com o kit. Para cada imunoprecipitação (IP), calcular a especificidade de enriquecimento a partir da recuperação de ADN metilado e não metilado, utilizando os valores de limiar de ciclo (Ct) de MeDIP e fracções de entrada obtidas a partir da reacção de qPCR (ver equações 1 e 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      Observação : considere bibliotecas IP para ser bem-sucedido se os valores de especificidade são ≥0,95.
    8. Amplifique as bibliotecas usando kits de preparação de bibliotecas MeDIP-seq, seguindo as instruções dos fabricantes, e realize a quantificação e análise de distribuição de tamanho de biblioteca do produto.
    9. Execute o sequenciamento de bibliotecas em sequenciadores de próxima geração. Utilizar sequenciamento de extremidade pareada, com comprimento de leitura de 100 pb, visando uma média de 30 M de leituras/amostra.
    10. Alinhar as etiquetas de leitura de sequenciamento ao genoma de referência apropriado (por exemplo, hg38) usando bwa (v 0.7.5 ou superior)48 e, em seguida, identificar picos usando MACS (v 2.0.10 ou superior)49, permitindo a identificação de picos amplos (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Crie um conjunto comum de regiões a partir de diferentes amostras usando a ferramenta de multiinterseção50 da BEDTools, habilitando a opção de clustering.
    12. Calcule a cobertura por amostra na lista de regiões finais usando o multicov da BEDTools, descartando leituras duplicadas.
    13. Realizar análise da contagem de matrizes usando edgeR. Aplique um filtro de pelo menos uma contagem por milhão (cpm) em pelo menos três amostras para descartar regiões pouco enriquecidas.
      Observação : alternativa, a função filterByExpr no edgeR pode ser usada.
    14. Identifique a metilação diferencial adotando o modelo log-linear generalizado implementado em edgeR (função glmFit) e normalizando usando a normalização de quantil condicional51 para corrigir o conteúdo GC por região. Selecione regiões diferencialmente metiladas aplicando um limiar de 0,01 em valores de p ajustados por BH. Realize a análise das sequências repetidas da seguinte forma.
      Observação : consulte o guia do usuário edgeR para obter a lista completa de opções e parâmetros (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Filtre os resultados do MeDIP-seq para um valor p nominal <0,01 e crie dois conjuntos de regiões: selecione regiões com logFC >1 no primeiro conjunto e regiões com logFC <-1 no segundo conjunto.
      2. Recupere a anotação RepeatMasker para o genoma escolhido como um arquivo de cama e conte o número de elementos em cada conjunto. Converta a contagem como uma proporção sobre o número de regiões para cada conjunto de dados.
      3. Extrair a proporção de metiloma que se sobrepõe a cada classe de repetições e realizar um teste Qui-quadrado para detectar qualquer enriquecimento significativo.
  3. Avaliar se regiões diferencialmente transcritas ou diferencialmente metiladas entre amostras tratadas com ETR e simuladas mapeiam para a ligação de gRNA fora do alvo prevista in silico.
    1. Use o CRISPR design suite52 como a ferramenta de previsão de ligação de gRNA fora do alvo.
    2. Para cada região putativa fora do alvo, observe o local de início de transcrição (TSS) mais próximo e a região metilada mais próxima. Considere como um verdadeiro efeito fora do alvo uma região associada a um gene regulado com FDR <0,01 e uma distância ao TSS menor que 10 Kb, ou uma região metilada regulada com FDR <0,01 e uma distância menor que 1 Kb.
    3. Identificar o número e as características das regiões transcricionalmente alteradas ou sobremetiladas em amostras tratadas com cada um dos três gRNAs de melhor desempenho em comparação com amostras tratadas simuladamente (Figura 5) para identificar as mais específicas entre os gRNAs. Classifique o impacto potencial de um local fora do alvo na fisiologia das células-alvo na seguinte ordem (do mais impactante para o menos impactante):
      i) Gene intragênico, da região reguladora fisiologicamente expressa
      ii) Gene intragênico, da região exônica, fisiologicamente expresso
      iii) Gene intragênico, intrônico da região intrônica-fisiologicamente expresso
      iv) Gene intragênico, região regulatória não expressa
      v) Gene intragênico, região exônica não expressa
      vi) Gene intragênico, região intrônica, não expressa
      vii) Região intergênica

Representative Results

Após a entrega de um modelo de doador para integração mediada por recombinação homóloga do repórter fluorescente no locus alvo acoplado ao sistema CRISPR/Cas9 (por exemplo, por nucleofeção plasmidial no caso de células K-562), células positivas para repórteres aparecem na amostra tratada (Figura 1, abaixo). Se isso não ocorrer, verifique novamente a precisão do projeto e da clonagem do modelo do doador e dos reagentes CRISPR/Cas9. Se confirmado, tente otimizar as doses de reagentes e o próprio protocolo de entrega.

Uma vez que a linhagem celular repórter é obtida, selecione sequências promotoras/potencializadoras do gene alvo e projete um painel de gRNAs correspondentes. Utilizar ferramentas de predição in silico, como o Chopchop, tanto para identificar as sequências de gRNA quanto classificá-las em termos de eficiência e especificidade previstas (Figura 2). Se nenhum gRNAs for recuperado, controle a presença do motivo canônico Cas9 protoespaçador adjacente (PAM) (5'-NGG-3') na sequência alvo. Se nenhuma sequência PAM estiver presente, considere mudar para ETRs com base em variantes Cas9 alternativas independentes de PAM (ainda não há ETRs publicadas com essas variantes) ou mudar para plataformas de domínio de ligação de DNA alternativas, como ZFPs53 ou TALEs30. No entanto, se apenas gRNAs com baixa eficácia/especificidade prevista forem recuperados, considere 1) testar esses gRNAs de baixa qualidade ou 2) expandir a sequência de DNA alvo, em busca de melhores gRNAs. Após a entrega transitória da combinação tripla de ETR (ou CRISPRoff; v2.1) juntamente com gRNAs, realize análises longitudinais de citometria de fluxo para a expressão do repórter fluorescente, muitas vezes observando um pico de repressão do repórter em análises agudas, que é então pelo menos parcialmente reabsorvido devido à diluição mitótica dos plasmídeos codificadores de ETR ao longo do tempo (Figura 4C). Se a combinação ETRs/gRNA efetivamente depositar metilação de CpG no locus alvo, a repressão permanente do repórter ocorrerá em uma fração considerável de células tratadas (Figura 4C). Diferentes gRNAs podem apresentar eficiência variável de silenciamento a longo prazo (Figura 4B,C).

Para avaliações de especificidade genômica ampla, use MeDIP-seq para identificar as regiões diferencialmente metiladas entre células nas quais o alvo foi silenciado a longo prazo e células não tratadas. Idealmente, um gRNA altamente específico induzirá apenas um pico de metilação de novo da CpG no local alvo (Figura 5). Caso contrário, pode-se considerar caracterizar a atividade off-target dos gRNAs classificados em uma posição inferior na lista de eficiência no alvo.

Figure 1
Figura 1: Integração de um repórter tdTomato sob os elementos regulatórios do gene B2M humano por reparo dirigido por homologia. Topo: Esquema da estratégia para integrar um repórter fluorescente tdTomato no primeiro íntron do gene B2M humano por reparo dirigido por homologia induzido por CRISPR/Cas9. Abaixo: dot plots representativos de células K-562 pré e pós-integração do repórter tdTomato no primeiro íntron do gene B2M . Abreviações: HA = homologia braço; HDR = reparo dirigido por homologia; IRES = sítio de entrada interno do ribossomo; pa = BGH poli(A); SA = local aceitador de emendas; WT = tipo selvagem; 3XSTOP = três códons de parada em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Identificação in silico de gRNAs visando a ilha CpG do gene B2M , classificados para eficiência e especificidade previstas. A interface de saída do Chopchop mostrando gRNAs visando a ilha CpG embutida na sequência promotora do gene B2M , classificada tanto para o número de sequências fora do alvo com incompatibilidades 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) ou 3 (MM3) quanto para a eficiência prevista no alvo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Clonagem e nucleofeção arranjada de gRNAs para silenciamento epigenético mediado por dCas9 ETR. Topo: clonagem de protoespaçador oligomediado em um plasmídeo humano U6-gRNA expressando. Parte inferior: tela arranjada de gRNAs direcionados a B2M para silenciamento epigenético baseado em CRISPR/dCas9 por nucleofeção plasmidial em células K-562B2M/tdTomato . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Triagem de gRNAs indutores efetivos de silenciamento de longo prazo do gene B2M. (A) Topo: esquemas do geneB2M tdTomato representados na área ampliada, a ordem relativa e a orientação de ligação de ETRs baseados em dCas9 complexados com gRNAs. Parte inferior: gráficos de pontos representativos das células B2MtdTomato K-562 antes (esquerda) ou depois (direita) do silenciamento ETR. Análises aos 30 dias pós-transfecção com plasmídeos codificadores para os gRNAs e a combinação tripla dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Atividade de silenciamento dos gRNAs indicados (em pools ou como gRNAs individuais) visando a ilha CpG de B2M (setas vermelhas no esquema superior indicam orientação dos gRNAs) em célulasde k-562 B2M tdTomato no dia 30 pós-transfecção. Os dados mostram a porcentagem de células tdTomato-negativas (média ± EPM; n = quatro transfecções independentes para cada condição de tratamento). (C) Análise temporal-curso de células B2MtdTomato K-562 após transfecção com plasmídeos expressando a combinação tripla de ETR e os gRNAs indicados de origem B2M CpG ou mock (transfecção livre de gRNA e ETR). Os dados mostram a porcentagem de células tdTomato-negativas (média ± EPM; n = três transfecções independentes para cada condição de tratamento). Dados não publicados. Painéis A e B adaptados de Amabile et al.30. Abreviações: CGI = ilha CpG; IRES = sítio de entrada interno do ribossomo; pa = BGH poli(A); SA = local aceitador de emendas; DP = área doadora de emenda; TSS = local de início da transcrição; UT = não transfectado; 3XSTOP = 3 códons de parada em tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Análise genômica ampla da especificidade da ETR por RNA-seq e por MeDIP-seq. Esquerda: comparação dos níveis de expressão em célulasB2M tdTomato K-562 tratadas com a combinação tripla dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR e com um gRNA visando a ilha CpG do gene B2M. Os valores são expressos em log2 de leituras por quilobase por milhão (RPKM) de leituras mapeadas. Os pontos pretos representam genes expressos em níveis comparáveis em todas as condições; círculos amarelos representam genes diferencialmente regulados sob uma FDR <0,01; o círculo vermelho representa o transcrito B2M-IRES-tdTomato. Canto superior direito: gráfico circos mostrando perfis MeDIP-seq do genoma completo de célulasBdM tdTomato K-562 tratadas com simulação (azul) ou células tratadas com a combinação tripla dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR e com um gRNA direcionado à ilha CpG (CGI) do gene B2M (verde). No canto inferior direito: o estado de metilação do locusB2M tdTomato nas amostras indicadas é mostrado. Três réplicas são representadas em cada empilhamento; O empilhamento de leituras alinhadas foi suavizado usando uma janela gaussiana. Esse valor foi adaptado de Amabile et al.30. Abreviação: TSS = local de início da transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O silenciamento epigenético direcionado pode representar uma solução promissora para o tratamento de distúrbios que podem se beneficiar da inativação permanente de genes, incluindo doenças causadas por mutações de ganho de função1, doenças infecciosas2 e patologias nas quais o silenciamento de um gene pode compensar um defeito hereditário em outro3 ou liberar todo o potencial das terapias celulares adotivas4, 5º. Por atuar no nível da cromatina e ser autopropagado pela célula 7,30,32, o silenciamento epigenético pode evitar alterações tóxicas (por exemplo, rearranjos cromossômicos) da sequência de DNA do gene alvo e silenciamento parcial e transitório do alvo, que são limitações da ruptura gênica baseada em nuclease artificial8,34,35 e knockdown baseado em RNAi 33, respectivamente.

Um dos principais passos preliminares em qualquer protocolo de silenciamento epigenético é identificar a posição adequada no gene alvo para direcionar as ETRs que depositarão as marcas epigenéticas repressivas necessárias para desativar a atividade transcricional do alvo. Diferentes elementos regulatórios do sítio de início transcricional proximal e distal podem concorrer para dar suporte à saída transcricional de um determinado gene humano54. Além disso, diferentes locais-alvo por elemento regulatório específico podem agora ser identificados graças ao número crescente de tecnologias programáveis de ligação ao DNA6. Portanto, protocolos, como o descrito aqui em linhagens celulares modificadas, podem ser usados para nomear locais-alvo individuais e/ou regiões genômicas passíveis de silenciamento epigenético mediado por ETR, antes de embarcar em esforços pesados e demorados de avaliação dos melhores candidatos no cenário terapêutico final. Alguns aspectos críticos do protocolo são descritos a seguir.

Engenharia de uma linhagem celular repórter preditiva do alvo terapêutico final
Apesar da constante otimização dos protocolos de engenharia celular - necessários aqui para inserir o que codifica o repórter fluorescente no gene alvo e para entregar os ETRs - não se pode dar como certo que eles possam já estar disponíveis para a linhagem celular que mais se assemelha ao alvo terapêutico final. Nesse caso, diferentes estratégias de mitigação podem ser aplicadas: a) aproveitando kits de otimização fornecidos pelos fornecedores para otimizar internamente o protocolo de transfecção para a linhagem celular alvo; b) mudança para outras linhagens celulares que ainda expressam esse gene alvo, mas pertencentes a tecidos diferentes do alvo terapêutico final, para os quais os protocolos de engenharia foram extensivamente otimizados. Caso essas opções não estejam disponíveis, pode-se considerar a mudança para tipos celulares primários ou organoides que representam o alvo final. Como uma consideração geral para estudos pré-clínicos e aplicações terapêuticas do silenciamento epigenético baseado em ETR, cenários em que o gene alvo é essencial para o tipo de célula-alvo devem ser descartados. O silenciamento completo e a longo prazo de um gene essencial imposto pelas ETRs levará à contraseleção das células-alvo ao longo do tempo (e, potencialmente, toxicidade do tratamento). Tecnologias alternativas que fornecem revogação parcial de alvos, como o RNAi33, são preferidas nesses casos.

Avaliação da atividade de silenciamento no alvo das ETRs
ETRs baseados na combinação de domínios efetores KRAB, DNMT3A e DNMT3L provaram ser eficazes contra a grande maioria dos genes codificadores de proteínas, com uma ampla janela de direcionamento permissiva de cerca de 1 quilobase centrada no local de início da transcrição32. Para se ter uma noção de como é um experimento de silenciamento epigenético bem realizado, os detalhes técnicos e os resultados do silenciamento do gene B2M em células K-562 são fornecidos aqui. Isso pode ser considerado um controle positivo importante a ser incluído não apenas por pesquisadores que trabalham com células K-562, mas também por aqueles que se aproximam da tecnologia baseada em ETR pela primeira vez. Conforme declarado no protocolo, a ruptura gênica baseada em nuclease artificial (por exemplo, CRISPR/Cas9) é recomendada como um controle adicional da eficiência da entrega gênica no tipo celular de interesse e do fenótipo de células privadas do gene alvo. Após a triagem inicial de gRNAs a serem acoplados aos ETRs baseados em CRISPR/dCas9, se nenhum dos gRNAs testados for capaz de silenciar permanentemente o gene alvo, deve-se considerar, na seguinte ordem: 1) aumentar a quantidade de gRNAs e ETRs entregues; 2) testar pools dos principais gRNAs procurando efeitos sinérgicos entre eles. Se o silenciamento em longo prazo ainda não for alcançado, deve-se considerar: 3) testar gRNAs adicionais, que podem ter como alvo locais mais relevantes para instruir o silenciamento epigenético; 4) mudança para plataformas DBD baseadas em ZFP8 ou TALE9, que podem ter uma capacidade de ligação melhorada à cromatina alvo; 5) mudança de transitório para estável - por exemplo, integrando a expressão baseada em vetores virais dos ETRs (os construtos de fusão gRNA ou dCas9 ou ambos ao adotar a tecnologia CRISPR/dCas9). Uma vez que nosso grupo desenvolveu e tem experiência robusta com a co-entrega das três ETRs30 separadas, o protocolo e os resultados mostrados aqui são baseados nessa abordagem. No entanto, um fluxo de trabalho conceitual semelhante pode ser provavelmente aplicado para um sistema baseado em CRISPR tudo-em-um32.

Avaliação da atividade fora do alvo das ETRs
Vários estudos têm demonstrado indicações preliminares in vitro da especificidade de ETRs baseadas na combinação dos domínios efetores KRAB, DNMT3A e DNMT3L30,31,32. No entanto, se entre os gRNAs testados, nenhum deles mostrar um perfil de especificidade satisfatório em termos de regulação transcricional e/ou metilação de novo do DNA, pode-se buscar duas estratégias não mutuamente exclusivas: a) reduzir o tempo de residência dos ETRs dentro da célula (e, consequentemente, sua potencial atividade fora do alvo) diminuindo as doses de ETRs ou testando sistemas alternativos de liberação. Por exemplo, em comparação com os plasmídeos, espera-se que tanto o RNAm quanto a entrega de proteínas reduzam o tempo de exposição celular aos ETRs e, consequentemente, a probabilidade de atividade fora do alvo55; b) mudança para variantes Cas9 mais recentes, otimizadas para reduzir a ligação fora do alvo da plataforma56, ou para tecnologias alternativas de ligação de DNA baseadas em ZFP8 ou TALE9. É importante considerar que, em comparação com amostras tratadas simuladamente, a atividade no alvo e fora do alvo do silenciamento gênico é afetada não apenas pela ligação do DBD à sua sequência alvo, mas também pela capacidade potencial dos domínios efetores epigenéticos de serem recrutados para outros loci por seus cofatores endógenos naturais. Portanto, reduzir o tempo de residência dos ETRs na célula-alvo pode diminuir não apenas a probabilidade de ligação do DBD a locais fora do alvo, mas também a probabilidade de os ETRs interagirem com cofatores endógenos, com potenciais benefícios em termos de especificidade e desvantagens em termos de atividade no alvo. Finalmente, em comparação com amostras tratadas simuladamente, algumas das alterações transcricionais e menos prováveis de metilação de CpG medidas em células silenciadas podem ser simplesmente derivadas pela privação do gene alvo. Estes não são considerados off-targets da tecnologia de silenciamento. Para identificá-los, deve-se incluir também a ruptura gênica por nuclease artificial no painel experimental 8,9,10. Alterações biológicas decorrentes da perda funcional do gene alvo serão compartilhadas entre o silenciamento epigenético e esta tecnologia alternativa.

Disclosures

AL é cofundador, cotista e consultor da Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Os autores agradecem a Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica e Deborah Cipria pelo esforço colaborativo no desenvolvimento da tecnologia de silenciamento epigenético ao longo dos anos; Dejan Lazarevic e Francesca Giannese para revisão crítica das análises de RNA-seq e MeDIP-seq descritas no protocolo. Este trabalho foi apoiado por subvenções a A.L. da Fundação Telethon (bolsa TIGET n.º F1) e do Programa Horizonte 2020 da UE (UPGRADE). Ilustrações foram criadas com BioRender.com.

CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES
A.M, M.A.C., F.G. e A.C. contribuíram na elaboração do protocolo e redação do manuscrito; S.V., I.M. e D.C. desenharam as seções de bioinformática do protocolo e revisaram o manuscrito; A.M. e A.L. elaboraram o protocolo, conceberam e escreveram o manuscrito com a contribuição de todos os autores.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
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ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
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ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
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cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

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References

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Bioengenharia Edição 195 Silenciamento Epigenético Direcionado Inativação de Genes Interferência de RNA Nucleases Artificiais Quebra de Fita Dupla de DNA Edição Epigenética Domínio Programável de Ligação ao DNA Domínio KRAB DNMT3A DNMT3L Estados Epigenéticos Repressivos Hereditários Natureza Hit-and-run Desmetilação de DNA
<em>In vitro</em> Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado
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Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

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