Summary
पूरे कोक्लेया की छवि और डिजिटलीकरण के लिए एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप विकसित किया गया था।
Abstract
बहरापन सबसे आम संवेदी हानि है, जो विश्व स्वास्थ्य संगठन 1 के अनुसार दुनिया भर में लगभग 5% या 430 मिलियन लोगों को प्रभावित करताहै। एजिंग या प्रेस्बिकसोसिस सेंसरिन्यूरल श्रवण हानि का एक प्राथमिक कारण है और बालों की कोशिकाओं, सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स (एसजीएन), और स्ट्रिया संवहनी को नुकसान की विशेषता है। ये संरचनाएं कोक्लेया के भीतर रहती हैं, जिसमें द्रव में निलंबित और हड्डी से घिरे झिल्लीदार ऊतकों की एक जटिल, सर्पिल आकार की शारीरिक रचना होती है। ये गुण हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों की जांच और मात्रा निर्धारित करना तकनीकी रूप से मुश्किल बनाते हैं। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए, हमने एक लाइट-शीट माइक्रोस्कोप (टीएसएलआईएम) विकसित किया है जो आंतरिक कान में संरचना-कार्य संबंधों के अध्ययन की सुविधा के लिए पूरे कोक्लेया को छवि और डिजिटल कर सकता है। पूरे कोक्लेया के अच्छी तरह से संरेखित सीरियल अनुभागों के परिणामस्वरूप 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रात्मक विश्लेषण (यानी, लंबाई, चौड़ाई, सतह, मात्रा और संख्या) के लिए अलग-अलग संरचनाओं के त्रि-आयामी (3 डी) वॉल्यूम रेंडरिंग और विभाजन के लिए छवियों का ढेर होता है। कोचले को न्यूनतम प्रसंस्करण चरणों (निर्धारण, डिकैल्सीफिकेशन, निर्जलीकरण, धुंधलापन और ऑप्टिकल समाशोधन) की आवश्यकता होती है, जिनमें से सभी स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बाद में उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के साथ संगत होते हैं। चूंकि सभी ऊतक ढेर में मौजूद हैं, इसलिए प्रत्येक संरचना का मूल्यांकन व्यक्तिगत रूप से या अन्य संरचनाओं के सापेक्ष किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि इमेजिंग फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करती है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और लिगैंड बाइंडिंग का उपयोग विशिष्ट संरचनाओं और कोक्लेया के भीतर उनके 3 डी वॉल्यूम या वितरण की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। यहां हमने बालों की कोशिकाओं और सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स के नुकसान को मापने के लिए वृद्ध चूहों से कोचले की जांच करने के लिए टीएसएलआईएम का उपयोग किया। इसके अलावा, उन्नत विश्लेषण (जैसे, क्लस्टर विश्लेषण) का उपयोग इसके 3 डी वॉल्यूम के साथ रोसेंथल की नहर में सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स की स्थानीय कटौती की कल्पना करने के लिए किया गया था। ये दृष्टिकोण कोचले के भीतर और बीच संरचना-कार्य संबंधों को निर्धारित करने के लिए टीएसएलआईएम माइक्रोस्कोपी की क्षमता को प्रदर्शित करते हैं।
Introduction
कोक्लेया स्तनधारियों में सुनने के लिए परिधीय संवेदी अंग है। इसमें संवेदी और सहायक कोशिकाओं को दोहराने की एक जटिल सर्पिल शारीरिक रचना है जो ध्वनि कंपन का पता लगाने और सुनवाई की धारणा के लिए उन्हें मस्तिष्क में संचारित करने के लिए शारीरिक रूप से विशिष्ट हैं। मुख्य संवेदी तत्व आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाएं और उनके आंतरिक तंत्रिका फाइबर हैं जिनके कोशिका शरीर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि की रचना करते हैं, जो रोसेंथल की नहर के भीतर रहता है (चित्रा 1)। इन संवेदी और तंत्रिका संरचनाओं को टोनोटोपिक रूप से व्यवस्थित किया जाता है जैसे कि उच्च आवृत्ति ध्वनियों को कॉक्लियर बेस में ट्रांसड्यूस किया जाता है और कम आवृत्ति वाली ध्वनियों को कोक्लेया एपेक्स2 में ट्रांसड्यूस किया जाता है। सहायक बेसिलर झिल्ली की सर्पिल लंबाई के साथ इस संवेदी कोशिका वितरण के एक शारीरिक मानचित्र को साइटोकोक्लेओग्राम3 कहा जाता है और इसकी तुलना ऑडियोग्राम में दर्शाए गए आवृत्ति के कार्य के रूप में श्रवण हानि के साथ की जा सकती है।
कोक्लेया की झिल्लीदार भूलभुलैया, जो घनी हड्डी से घिरा हुआ है, एक समय में एक से अधिक कॉक्लियर संरचना की जांच करना तकनीकी रूप से मुश्किल बनाता है। इसलिए, एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप विकसित करने का तर्क पूर्ण कोक्लेया के अच्छी तरह से संरेखित सीरियल वर्गों का उत्पादन करना है ताकि 3 डी पुनर्निर्माण में एक दूसरे के सापेक्ष सभी कॉक्लियर संरचनाओं की जांच की जा सके। Voie et al.4 और Voie and Spelman5 ने पहले प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप को डिजाइन किया, जिसे ऑर्थोगोनल प्लेन फ्लोरेसेंस ऑप्टिकल सेक्शनिंग (OPFOS) माइक्रोस्कोप कहा जाता है, जो पूरे कोक्लेया को ऑप्टिकल रूप से विभाजित करता है। हालांकि, इस माइक्रोस्कोप को व्यावसायिक रूप से कभी विकसित नहीं किया गया था; इसलिए, हमारा उद्देश्य एक प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का निर्माण करना था जिसे पतली शीट लेजर इमेजिंग माइक्रोस्कोप (टीएसएलआईएम) कहा जाता है; चित्र 2)। टीएसएलआईएम के लिए डिजाइन और निर्माण विवरण पहले प्रकाशित किए गएहैं। टीएसएलआईएम ने ओपीएफओएस पर कई सुधार किए, जिसमें छवि संग्रह के लिए कम रोशनी वाले डिजिटल कैमरा बनाम सीसीडी कैमरे का उपयोग करना, प्रकाश-शीट के माध्यम से नमूने के सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आंदोलन के लिए ऑप्टिकल रूप से एन्कोडेड माइक्रोपोजिशनर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट नमूना कक्ष का उपयोग करना और ऊतक के भीतर दाग वर्षा को रोकने के लिए समाशोधन समाधान के बजाय इथेनॉल में रोडामाइन धुंधला होना शामिल है। एसपीआईएम6 जैसे प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के वाणिज्यिक विकास ने जीवित, छोटे पारदर्शी नमूनों की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन पूरे कॉक्लियर इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त हैं क्योंकि उनके पास पर्याप्त कार्य दूरी की कमी है। अन्य प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के विकास की समीक्षा सैंटी7 द्वारा प्रकाशित की गई थी। कोक्लेया की जांच करने के लिए अन्य हिस्टोलॉजिकल विधियों पर टीएसएलआईएम का प्राथमिक लाभ नमूने की अखंडता को संरक्षित करते हुए 3 डी पुनर्निर्माण के लिए ऊतकों को ऑप्टिकल रूप से खंड करना है ताकि इसका उपयोग अन्य हिस्टोलॉजिकल तरीकों द्वारा किया जा सके। टीएसएलआईएम इमेजिंग का एक और लाभ यह है कि लेजर द्वारा उत्पादित केवल एक पतली प्रकाश-शीट ऊतक के संपर्क में आती है, जिसकी तुलना में पूरे ऊतक मोटाई लेजर के संपर्क में आती है जैसा कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में होता है। प्रकाश फैलाव को कम करने के लिए ऊतक समाशोधन और यह तथ्य कि ऊतक का केवल एक छोटा सा हिस्सा लेजर के संपर्क में आता है, प्रकाश-शीट लेजर इमेजिंग के साथ न्यूनतम फ्लोरोक्रोम लुप्त (फोटोब्लीचिंग) का परिणाम होता है। हालांकि, निर्धारण, निर्जलीकरण और समाशोधन की प्रक्रिया कॉक्लियर संरचनाओं की आकृति विज्ञान को बदल देती है और इसके परिणामस्वरूप जीवित ऊतक की तुलना में ऊतक संकोचन होता है। ऊतक संकोचन की वास्तविक मात्रा जो होती है वह निर्धारित नहीं की गई थी।
टीएसएलआईएम शेन जॉनसन और आठ जर्मन ऑप्टिकल इंजीनियरिंग छात्रों द्वारा विकसित किया गया था ( पावती देखें)। टीएसएलआईएम निर्माण विवरण सैंटी एट अल.8 द्वारा प्रदान किए गए थे और श्रोटर एट अल.9 द्वारा एक स्कैनिंग संस्करण (एसटीएसएलआईएम) प्रदान किया गया था। टीएसएलआईएम ऑप्टिकल रूप से खंड नमूनों के लिए एक गैर-विनाशकारी माइक्रोटोम के रूप में कार्य करता है और कोक्लेया की पूर्ण चौड़ाई और मोटाई के माध्यम से 2 डी सीरियल अनुभागों को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप के रूप में कार्य करता है। टीएसएलआईएम छोटे (मिमी) और बड़े (सेमी), मोटे नमूने दोनों की छवि बना सकता है। लेंस को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर 1x और 2x के संग्रह उद्देश्यों के साथ लंबी कामकाजी दूरी के लिए अनुमति देने के लिए एयर माउंट किया जाता है। विच्छेदन माइक्रोस्कोप में ज़ूम ऑप्टिक्स भी होते हैं जो टीएसएलआईएम को कोशिकाओं पर उपकोशिकीय और सिनैप्टिक संरचनाओं को हल करने की अनुमति देते हैं। टीएसएलआईएम रोशनी के लिए नीले (473 एनएम) और हरे (532 एनएम) लेजर दोनों से लैस है जो इमेजिंग के लिए विभिन्न फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करने की अनुमति देता है। टीएसएलआईएम का लक्ष्य कॉक्लियर ऊतकों के पूर्ण डिजिटल पुनर्निर्माण के लिए एक पूरे कोक्लेया के माध्यम से अच्छी तरह से संरेखित 2 डी ऑप्टिकल वर्गों का उत्पादन करना है। चूंकि यह एक फ्लोरोसेंट विधि है, लिगैंड और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग विशिष्ट कॉक्लियर संरचनाओं की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
प्रारंभ में, एक बेलनाकार लेंस का उपयोग दो विरोधी गॉसियन प्रकाश चादरों का उत्पादन करने के लिए किया गया था, लेकिन इसने अवशोषण इमेजिंग कलाकृतियों का उत्पादन किया। केलर एट अल .10 के काम के कारण, निश्चित बेलनाकार लेंस को प्रकाश शीट9 का उत्पादन करने के लिए स्कैनिंग गैल्वेनोमीटर दर्पण द्वारा बदल दिया गया था। इसके अलावा, चूंकि प्रकाश शीट का केंद्र बीम कमर पर सबसे पतला होता है, इसलिए एसटीएसएलआईएम 2 डी छवियों को नमूने की चौड़ाई में डेटा के एक्स-अक्ष कॉलम के समग्र को एकत्र करके उत्पादित किया जाता है (चित्रा 3)। इस विधि को पहली बार Buytaert और Dircks11 द्वारा वर्णित किया गया था। उपकरण नियंत्रण के लिए ग्राफिकल प्रोग्राम का उपयोग करके छवियों को चलाने और एकत्र करने के लिए टीएसएलआईएम कस्टम सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था। प्रकाश शीट नमूने के माध्यम से यात्रा करती है और ऊतक के भीतर एक फ्लोरोसेंट विमान को रोशन करती है। इस फ्लोरोसेंट विमान को पारदर्शी नमूने के माध्यम से ऑर्थोगोनल रूप से प्रक्षेपित किया जाता है और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप द्वारा एकत्र किया जाता है। ऑप्टिकल रूप से एन्कोडेड माइक्रोपोजिशनर एक्स-अक्ष में बीम कमर के माध्यम से स्कैनिंग को एक समग्र 2 डी छवि एकत्र करने की अनुमति देते हैं और बाद में, जेड-अक्ष माइक्रोपोजिशनर नमूना को ऊतक के भीतर एक गहरे तल पर ले जाता है ताकि सीरियल, अनुभागित 2 डी छवियों का ढेर प्राप्त किया जा सके (वीडियो 1, चित्रा 4)। ट्रांसलेशनल छवियों का एक ढेर कोक्लेया की पूरी चौड़ाई, मोटाई और लंबाई के माध्यम से एकत्र किया जाता है, और छवियों की सिलाई की आवश्यकता नहीं होती है (वीडियो 2)। छवि स्टैक को दूसरे कंप्यूटर पर स्थानांतरित किया जाता है और 3 डी पुनर्निर्माण और परिमाणीकरण के लिए 3 डी रेंडरिंग प्रोग्राम में लोड किया जाता है। छवि स्टैक में माइक्रोस्कोप के संकल्प पर एक कोक्लेया की आकृति विज्ञान के बारे में सभी डिजिटल जानकारी होती है। हालांकि, अगर एक उच्च रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, तो बरकरार कोक्लेया को विनाशकारी हिस्टोलॉजिकल तरीकों जैसे माइक्रोटोम सेक्शनिंग, स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे संसाधित किया जा सकता है।
3 डी रेंडरिंग प्रोग्राम का उपयोग 3 डी रेंडरिंग और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विभिन्न कॉक्लियर संरचनाओं को विभाजित करने के लिए किया जाता है। विभाजन के लिए, स्टैक की प्रत्येक 2 डी छवि में प्रत्येक संरचना को ग्राफिक्स टैबलेट और पेन (चित्रा 5) द्वारा एक अलग रंग का उपयोग करके पता लगाया जाता है। आज तक, 20 विभिन्न कॉक्लियर संरचनाओं को विभाजित किया गया है (चित्रा 6)। विभाजन के बाद, विभिन्न प्रकार के 3 डी विश्लेषण किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर संरचना के केन्द्रक के साथ किसी भी विमान में कोक्लेया को वस्तुतः अलग कर सकता है। वीडियो 3 में कोर्टी के अंग को स्पर्शरेखा को विभाजित करते हुए दिखाया गया है, जो बेसिलर झिल्ली की लंबाई के साथ बालों की कोशिकाओं को प्रकट करता है। इस प्रक्रिया को पहले ब्याज की संरचना के मैनुअल विभाजन की आवश्यकता होती है। इसके बाद, संरचना के केन्द्रक की गणना संरचना के केंद्र के साथ उसके आधार से इसके शीर्ष तक रखे गए स्प्लिन बिंदुओं के कम से कम वर्गों के आधार पर की जाती है, इस प्रकार संरचना की लंबाई के सन्निकटन की अनुमति मिलती है (वीडियो 4)। कंकालीकरण नामक एक समान प्रक्रिया का उपयोग रंग मानचित्र (वीडियो 4) का उपयोग करके इसकी लंबाई के साथ संरचना की रेडियल चौड़ाई की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। विभाजन के बाद प्रत्येक संरचना की कुल मात्रा की गणना प्रोग्राम द्वारा की जाती है, लेकिन सापेक्ष दूरी को 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 7) में रंग मानचित्रों के साथ परिमाणित और कल्पना भी की जा सकती है। खंडित संरचनाओं को बढ़े हुए, ठोस-प्लास्टिक मॉडल रेंडरिंग (चित्रा 8) का उत्पादन करने के लिए भी निर्यात किया जा सकता है। इसके अलावा, अर्ध-स्वचालित सेल गिनती 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर (चित्रा 9) का उपयोग करके भी की जा सकती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और लिगैंड बाइंडिंग का उपयोग विशिष्ट कॉक्लियर संरचनाओं को दागने के लिए किया जा सकता है और इन संरचनाओं को मोर्फोमेट्रिकल मूल्यांकन के लिए अन्य कॉक्लियर संरचनाओं से अलग किया जा सकता है जैसे कि साइटोकोक्लेओग्राम का उत्पादन (चित्रा 10)। लंबाई, चौड़ाई, सतह, मात्रा और सभी कॉक्लियर संरचनाओं की संख्या 3 डी मॉडल से निर्धारित की जा सकती है, जिससे यह दृष्टिकोण कार्यात्मक हानि के लिए कॉक्लियर क्षति के मानचित्रण के लिए आदर्श हो जाता है। विशेष रूप से, उम्र बढ़ने, शोर-प्रेरित आघात, या अन्य अपमान के कारण कॉक्लियर क्षति को 2 डी ऑप्टिकल वर्गों से 3 डी कॉक्लियर पुनर्निर्माण में दिखाया और परिमाणित किया जा सकता है। एक बार जब एक कोक्लेया को डिजिटाइज़ कर दिया जाता है तो कई इमेजिंग एल्गोरिदम होते हैं जिनका उपयोग अन्य कॉक्लियर ऊतकों के लिए शारीरिक रजिस्ट्री में कोक्लेया के भीतर किसी भी ऊतक के कॉक्लियर क्षति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
मिनेसोटा संस्थागत देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) विश्वविद्यालय द्वारा सभी प्रक्रियाओं और जीवित जानवरों के उपयोग की समीक्षा और अनुमोदन (प्रोटोकॉल आईडी # 2010-38573 ए) किया गया है और इन जानवरों का उपयोग करने वाले जांचकर्ताओं को पशु सुविधाओं तक पहुंचने से पहले अनुसंधान पशु संसाधन (आरएआर) पशु चिकित्सकों द्वारा अच्छी तरह से प्रशिक्षित और परीक्षण किया गया है। इस अध्ययन में नर और मादा दोनों चूहों का इस्तेमाल किया गया था।
1. इमेजिंग के लिए निर्धारण और ऊतक प्रसंस्करण के लिए कोचलेआ हटाने
- सीओ2 इनहेलेशन का उपयोग करके एक माउस को इच्छामृत्यु करें। कैंची से माउस को काट दें और खोपड़ी को विकृत करने के लिए मस्तिष्क के माध्यम से पृष्ठीय-उदर चीरा लगाएं। मस्तिष्क को हटा दें, खोपड़ी के बेसो-वेंट्रल भाग में गोल बुल्ला की पहचान करें, रोंगेर के साथ बुल्ला खोलें, और कोक्लेया की कल्पना करें और हटा दें।
- निर्धारण: इस प्रक्रिया को एक फ्यूम हुड के तहत करें और 5x आवर्धन पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। दस्ताने और सुरक्षात्मक कपड़े पहनें। अंडाकार खिड़की को पंचर करें और एक तेज पिक के साथ स्टेप्स को हटा दें। झिल्ली को पंचर करने के लिए गोल खिड़की में एक पिक डालें।
- खुली हुई गोल खिड़की को 2 एमएल फॉर्मेलिन से भरे 1 एमएल सिरिंज से जुड़े इन्फ्यूजन सेट के कट टिप के साथ कवर करें। धीरे-धीरे 2 मिनट की अवधि में कोक्लेया के पेरिलिम्फेटिक रिक्त स्थान के माध्यम से फॉर्मलिन डालें, यह देखते हुए कि फॉर्मलिन खुली अंडाकार खिड़की के माध्यम से कोक्लेया से बाहर निकल रहा है। कोक्लेया से अतिरिक्त ऊतक को ट्रिम करें और 10% फॉर्मेलिन युक्त बोतल में डुबोएं, और रात भर घूमने वाले पर रखें।
- डिकैल्सीफिकेशन: पीबीएस 3x में कोक्लेया को 5 मिनट के लिए धोएं और 4 दिनों के लिए रोटेशन के साथ डिसोडियम एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 10% समाधान वाली बोतल में डुबोएं, प्रतिदिन घोल बदलें।
- निर्जलीकरण: पीबीएस 3 एक्स के साथ कोक्लेया को भरें और परिवर्तनों के बीच 15 मिनट के लिए डुबोएं। इथेनॉल 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100% की आरोही सांद्रता के साथ कोक्लेया को निर्जलित करें; प्रत्येक एकाग्रता में 30 मिनट के लिए।
नोट: निर्जलीकरण से पहले सभी ईडीटीए को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि ईडीटीए इथेनॉल में अवक्षेपित होता है। इसके अलावा, कोक्ले को रात भर में 70% से अधिक इथेनॉल की किसी भी एकाग्रता में छोड़ा जा सकता है। - धुंधलापन: रोटेशन के साथ रात भर रोडामाइन बी आइसोथियोसाइनेट (100% इथेनॉल में 5 μg / mL) के घोल में विसर्जन करके पूरे कोक्ले को दाग दें। 100% इथेनॉल के दो परिवर्तनों के साथ कोक्लेया से अतिरिक्त डाई को हटा दें, प्रत्येक परिवर्तन 5 मिनट।
- क्लियरिंग: दाग वाले कोक्लेया को स्पाल्टेहोल्ज़12 समाधान (5: 3 मिथाइल सैलिसिलेट: बेंजाइल बेंजोएट) के दो परिवर्तनों में स्थानांतरित करें, प्रत्येक परिवर्तन को 30 मिनट और रोटेशन के साथ समाशोधन समाधान में रात भर छोड़ दें। कोचले को अनिश्चित काल के लिए स्पाल्टेहोल्ज़ समाधान में छोड़ा जा सकता है।
2. कोक्ले की इमेजिंग
- कोक्ले को अंडाकार और गोल खिड़की झिल्ली के अंत में एक नमूना रॉड से संलग्न करें ताकि समाशोधन समाधान कोक्लेया के भीतर रहे और बुलबुले न बनें (चित्रा 2)। इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोक्लेया के भीतर बुलबुले न बनें क्योंकि उन्हें हटाना मुश्किल है और यदि ऊतक में छोड़ दिया जाता है, तो वे इमेजिंग कलाकृतियों का कारण बनेंगे।
- गीले कोक्लेया को सूखे नमूना रॉड से जोड़ने के लिए यूवी सक्रिय गोंद का उपयोग करें (चित्रा 2)। अंडाकार और गोल खिड़की के सिरों पर कोक्लेया संलग्न करें। यूवी प्रकाश के साथ कोक्लेया के चारों ओर घूमकर 10 सेकंड के लिए यूवी गोंद का इलाज करें।
नोट: नमूना रॉड के लिए कोक्लेया के ढीले लगाव के परिणामस्वरूप इमेजिंग दोष होंगे। यह रॉड विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल के लिए निर्मित है (विवरण के लिए सैंटी एट अल .8 देखें) और हमारे प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप के लिए विशिष्ट है। - इमेजिंग के लिए स्पाल्टेहोल्ज़ समाधान से भरे इमेजिंग कक्ष में कोक्लेया को निलंबित करें। नमूना कक्ष एक ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट क्वार्ट्ज फ्लोरोमीटर सेल है (वीडियो 1)।
- नमूना रॉड को एक घूर्णन धारक से संलग्न करें जो एक्सजेड अनुवाद चरण से भी जुड़ा हुआ है। अधिकांश ढेर एक्सजेड विमानों में नमूना का अनुवाद करके प्राप्त किए जाते हैं, लेकिन घूर्णी ढेर भी प्राप्त किए जा सकते हैं।
- टीएसएलआईएम ऑप्टिकल सेक्शनिंग: फ्लोरोक्रोम धुंधला होने के प्रकार के आधार पर उत्तेजना के लिए नीले या हरे रंग के लेजर का उपयोग करें। ध्यान केंद्रित करने और आवर्धन को निर्धारित करने के लिए ऊतक के बीच में प्रकाश शीट रखें जिसका उपयोग कोक्लेया की पूरी चौड़ाई को रोशन करने के लिए किया जाएगा। फिर, पूरे कोक्लेया में 2 डी छवियों का ढेर बनाने के लिए एक्स-अक्ष (छवि की सिलाई) और जेड-चरणों में नमूने के पार प्रकाश-शीट के माध्यम से नमूना को स्थानांतरित करने के लिए एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए प्रोग्राम का उपयोग करें।
- पहली छवि के लिए, प्रकाश-शीट की बीम कमर को नमूने के किनारे पर तैनात किया जाता है और प्रोग्राम डेटा के कॉलम एकत्र करने वाले नमूने की पूरी चौड़ाई को स्कैन करता है (छवि सिलाई देखें; सैंटी एट अल.8) जो नमूने की चौड़ाई में अधिकतम रिज़ॉल्यूशन की एक समग्र 2 डी छवि का उत्पादन करने के लिए कॉन्फोकल पैरामीटर (चित्रा 3) की चौड़ाई है। कार्यक्रम प्रत्येक जेड-चरण के लिए छवि सिलाई को स्वचालित करता है जब तक कि नमूना पूरी तरह से चित्रित न हो जाए।
- छवि प्रसंस्करण: छवि स्टैक को किसी अन्य कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और इसे 3 डी पुनर्निर्माण और परिमाणीकरण के लिए 3 डी रेंडरिंग प्रोग्राम में लोड करें।
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Representative Results
चूंकि इस विशेष अंक का विषय कोचलेया में उम्र बढ़ने के प्रभावों की इमेजिंग कर रहा है, इसलिए एक युवा (3 महीने का, एचएस 2479, सीबीए स्ट्रेन माउस) और वृद्ध (23 महीने का, एचएस 2521, सी 57 स्ट्रेन माउस) कोक्ले को उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि टीएसएलआईएम विभिन्न प्रकार के नमूनों की इमेजिंग करने में सक्षम है, जिसमें मनुष्यों, स्तनधारियों, अन्य कृंतकों और मछली के साथ-साथ मस्तिष्क जैसे अन्य अंगों से कोक्ले शामिल हैं।
जॉनसन एट अल 13 ने टीएसएलआईएम का उपयोग करके युवा (3 सप्ताह के) सीबीए चूहों में एसजीएन पर एक लेख प्रकाशित किया। सभी एसजीएन को पांच चूहों में गिना गया था और 2.0 मिमी की औसत रोसेंथल की लंबाई के साथ 8,408-8,912 एसजीएन की सीमा थी। वर्तमान अध्ययन में, हमने 3 महीने के सीबीए माउस में एसजीएन की गणना की जिसमें 2.0 मिमी की रोसेंथल की नहर की लंबाई में 7,913 एसजीएन थे। 23 महीने पुराने C57BL6 माउस में 6,521 SGN था, जिसकी लंबाई 2.11 मिमी थी। एक वॉल्यूम रेंडरिंग दोनों कोक्ले में सभी एसजीएन दिखाता है, लेकिन पुराने माउस में एसजीएन हानि का खुलासा नहीं किया गया था। हालांकि, एसजीएन सेल की गिनती रोसेन्थल की नहर की दूरी के एक कार्य के रूप में की जाती है, जिसे एक रैखिक भूखंड में दर्शाया गया है, पुराने जानवर की तुलना में कोक्लेया के मध्य और एपिकल सिरों में छोटे जानवर में अधिक एसजीएन दिखाया गया है (चित्रा 11)। एसजीएन के इस स्पष्ट नुकसान को 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर में क्लस्टर विश्लेषण का उपयोग करके आगे देखा गया था। यहां, एसजीएन घनत्व अंतर को एक रंग पैमाने पर चित्रित किया गया था जहां उच्च घनत्व वाले क्लस्टर पीले होते हैं, और नीला कम घनत्व वाले क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 12)। यद्यपि खो गई विशिष्ट कोशिकाओं की पहचान करना संभव नहीं है, क्लस्टर विश्लेषण स्पष्ट रूप से रोसेंथल की नहर की लंबाई के साथ कम सेल घनत्व के क्षेत्रों की कल्पना करता है (चित्रा 12)।
चित्रा 1: एक कोक्लेया का प्रत्यक्ष वॉल्यूम रेंडरिंग। माउस कोक्लेया के आयतन प्रतिपादन से प्राप्त एक समग्र आकृति जिसमें अंडाकार (ओ) और गोल (आर) खिड़कियां, बाल कोशिकाओं के साथ कोर्टी का अंग (नीली रेखा, ओसी) और रोसेंथल की नहर दिखाई देती है जिसे खंडित किया गया है और मात्रा प्रदान की गई है जिसमें सर्पिल गैंग्लियन न्यूरॉन्स (एसजीएन) होते हैं। बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 2: नमूना धारक। कोक्लेया के भीतर समाशोधन समाधान रखते हुए यूवी-सक्रिय गोंद का उपयोग करके कोक्लेया (तीर) को नमूना रॉड (तीर) से जोड़ने के लिए एक कस्टम नमूना धारक का एक लकड़ी का प्रोटोटाइप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: लाइट शीट क्रॉस-सेक्शन। एक्स-अक्ष स्कैन की गई प्रकाश शीट के माध्यम से एक क्रॉस-सेक्शन जो प्रकाश शीट और कॉन्फोकल पैरामीटर (सीपी) के बीच में बीम कमर को दर्शाता है, जो एक ऐसा क्षेत्र है जहां बीम मोटाई अपेक्षाकृत स्थिर है। ऊपरी ठोस प्रतिपादन स्कैनिंग के बिना बीम की चौड़ाई दिखाता है और निचला ठोस प्रतिपादन स्कैन किए गए बीम की चौड़ाई को दर्शाता है जो कोक्लेया की पूरी चौड़ाई में पतला रहता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: माउस कोक्लेया के माध्यम से एक मध्य-मोडियोलर 2 डी क्रॉस-सेक्शन। चार कॉक्लियर टर्न विभाजित हैं। रोसेंथल की नहर के बेसल मोड़ को गोलाकार आकार के सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स युक्त देखा जा सकता है। बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5: कोक्लेया के दो क्रॉस सेक्शन। बाईं ओर एक 2 डी क्रॉस-सेक्शन है और दाईं ओर कई संरचनाओं के साथ एक ही खंड है जिसे विभिन्न रंगीन अनुरेखण का उपयोग करके खंडित किया गया है। बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्र 6: कॉक्लियर संरचनाएं खंडित हैं। (A) यह आंकड़ा आसपास के ओटिक कैप्सूल के साथ एक खंडित कोक्ले को दर्शाता है। (B-K) ये कई अलग-अलग कॉक्लियर संरचनाओं को दिखाते हैं जिन्हें खंडित किया गया है और अधिकांश संरचनाओं के लिए केन्द्रक (सफेद रेखा) निर्धारित किए जाते हैं। कॉक्लियर संरचनाओं को उनकी पहचान के लिए विभिन्न रंगों के साथ विभाजित किया गया है: (ए) हड्डी (सफेद), (बी) फ़िरोज़ा (सर्पिल लिगामेंट), (सी) मैरून (स्ट्रिया संवहनी), (डी) पीला (बेसिलर झिल्ली), (ई) लाल (कोर्टी का अंग), (एफ) पीला-हरा (रोसेंथल की नहर), (जी) नीला (स्काला टाइम्पानी), सोना (स्टेप्स फुटप्लेट), (एच) सफेद (स्काला मीडिया), हरा (डक्टस रियूनींस), (आई) लाल (आई) लाल बैंगनी (गोल खिड़की झिल्ली), सोना (कॉक्लियर एक्वाडक्ट), (जे) हरा (टेक्टोरियल झिल्ली), (के) बैंगनी (सर्पिल लिम्बस)। बार = 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 7: दो अलग-अलग कोक्ले में एक ही कॉक्लियर संरचना की तुलना। 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर में प्रोक्रस्टस विधि का उपयोग करते हुए, दो अलग-अलग चूहों से स्काला मीडिया की तुलना की गई है। बायां पैनल दो संरचनाओं के कम से कम वर्ग फिट की फिटिंग दिखाता है और दायां पैनल एक रंग मानचित्र का उपयोग करके उनके मात्रात्मक अंतर दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 8: कोक्लेया का ठोस 3 डी प्लास्टिक मॉडल। बाएं पैनल में बेसिलर झिल्ली, कोर्टी के अंग और हेलिकोट्रेमा खंडित के साथ एक माउस कोक्लेया का स्काला टाइम्पानी दिखाया गया है। दायां पैनल बाईं ओर संरचनाओं का एक ठोस प्लास्टिक मॉडल दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 9: सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन गिनती। माउस कोक्लेया के स्काला मीडिया के क्रॉस-सेक्शन पर 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम द्वारा एसजीएन की पहचान और चिह्नित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 10: बाहरी बाल कोशिकाओं का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग। एंटी-प्रेस्टिन एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी जो माउस कोक्लेया के पेरी लिम्फैटिक स्काला के माध्यम से संक्रमित थे, ने उन सभी बाहरी बाल कोशिकाओं को लेबल किया है जिन्हें 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वॉल्यूम प्रदान किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 11: रोसेंथल की नहर की लंबाई के साथ एसजीएन का घनत्व। एसजीएन का सबसे बड़ा नुकसान 23 महीने पुराने माउस में रोसेंथल की नहर के मध्य और एपिकल सिरों में प्रतीत होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 12: एसजीएन सेल घनत्व का क्लस्टर विश्लेषण। बाएं पैनल 3 महीने के, सामान्य श्रवण माउस में एसजीएन का क्लस्टर विश्लेषण दिखाता है। एक रंग मानचित्र से पता चलता है कि किसी दिए गए आकार के क्लस्टर के भीतर कोशिकाओं का सबसे बड़ा घनत्व मध्य रोसेंथल की नहर में है, जहां माउस सुनवाई सीमा सबसे कम है। दाहिना पैनल रोसेन्थल की नहर के बीच में एसजीएन के सबसे बड़े नुकसान के साथ रोसेन्थल की नहर में एसजीएन के नुकसान को दर्शाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 1: कोक्लेया का एक्स-एक्सिस स्कैनिंग वीडियो। प्रकाश शीट के माध्यम से नमूना की एक्स-अक्ष स्कैनिंग एक ग्लास कक्ष के भीतर निहित समाशोधन समाधान में नमूना रॉड द्वारा निलंबित कोक्लेया दिखाती है। प्रकाश शीट द्वारा रोशनी के कारण कोक्लेया का एक ऑर्थोगोनल 2 डी फ्लोरोसेंट क्रॉस-सेक्शन दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 2: कोक्लेया के सीरियल वर्गों का ढेर। 2 डी क्रॉस सेक्शन का एक छोटा ढेर एक्स-अक्ष स्कैनिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है और कोक्लेया के माध्यम से 10 μm Z-steps प्राप्त किया जाता है। पूरे स्टैक में क्षैतिज रेखाओं की उपस्थिति पर ध्यान दें, जो प्रकाश शीट का उत्पादन करने के लिए एक बेलनाकार लेंस के उपयोग के कारण अवशोषण कलाकृतियां हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 3: एक अलग विमान में एक कोक्लेया का शोधन। 3 डी रेंडरिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में लोड किया गया एक ढेर और कोर्टी के अंग के लिए स्पर्शरेखीय विमान में वर्चुअल रिसेक्शनिंग जो बेसिलर झिल्ली की लंबाई के साथ बाल कोशिकाओं को दर्शाता है। इस वीडियो को8 से संशोधित किया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 4: स्काला मीडिया का कंकालीकरण। बायां पैनल माउस कोक्लेया के स्काला मीडिया के भीतर केन्द्रक की गणना दिखाता है। दायां पैनल अपनी लंबाई के साथ स्काला मीडिया के रेडियल आयामों का एक रंग मानचित्र दिखाता है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कॉक्लियर संरचनाओं की परीक्षा के लिए लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑप्टिकल सेक्शनिंग अन्य पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल विधियों की तरह यांत्रिक रूप से विनाशकारी नहीं है, और यह एक दूसरे के सापेक्ष कॉक्लियर संरचनाओं का एक पूर्ण डिजिटल दृश्य प्रदान करता है। कोर्टी14 के अंग की सतह की तैयारी जैसे पिछले तरीकों ने बेसिलर झिल्ली की लंबाई के साथ बालों की कोशिका के झड़ने का एक नक्शा प्रदान किया, लेकिन एसजीएन हानि का आकलन नहीं किया जा सका क्योंकि ऊतक को कोर्टी के अंग को प्रकट करने के लिए विच्छेदित किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कोक्लेया के मध्य-मोडोइलर माइक्रोटोम खंड रोसेंथल की नहर की लंबाई में एसजीएन की स्थिति का केवल एक बहुत छोटा सा नमूना प्रदान करते हैं। टीएसएलआईएम के साथ, सभी कॉक्लियर संरचनाओं को उपकरण (यानी, उपकोशिकीय) के संकल्प के स्तर पर डिजिटाइज़ किया जाता है। कोक्लेया के पूर्ण छवि ढेर कई कॉक्लियर संरचनाओं के परिमाणीकरण और विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देते हैं, जो यहां दिखाए गए हैं, जिन्हें पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तरीकों से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, क्लस्टरिंग एल्गोरिदम का उपयोग करते हुए, वर्तमान जांच ने रोसेंथल की नहर के भीतर एसजीएन सेल घनत्व को देखने और मात्रा निर्धारित करने और उम्र बढ़ने के कारण सेल हानि को चिह्नित करने का एक पूरी तरह से नया तरीका दिखाया (चित्रा 12)।
टीएसएलआईएम एक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप का एक प्रारंभिक8 विकास है जो वीओई और सहयोगियों 4,5 के काम से प्रेरित था। टीएसएलआईएम के निर्माण के लिए विनिर्देशों को सैंटी एट अल.8 द्वारा पेपर में शामिल किया गया था। वास्तव में, ब्राउन एट अल .15 ने कहा कि उन्होंने टीएसएलआईएम के डिजाइन के आधार पर कोक्लेया की इमेजिंग के लिए एक समान प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का निर्माण किया। जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है और सैंटी द्वारा समीक्षा कीगई है, अन्य प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप (जैसे, एसपीआईएम) के विकास को लाइव सेल विकास की जांच करने के लिए निर्देशित किया गया था और नमूना कक्ष के भीतर उच्च एनए उद्देश्यों के विसर्जन द्वारा बेहतर रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया गया था, जिसके लिए छोटी कामकाजी दूरी की आवश्यकता थी और पूरे कोचले की इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त है। प्रकाश शीट माइक्रोस्कोप का व्यावसायिक विकास जारी है, और इस प्रकार की इमेजिंग रासायनिक समाशोधन विधियों द्वारा पारदर्शी बनाए गए ऊतकों और जानवरों के अच्छी तरह से संरेखित, सीरियल वर्गों को तैयार करने के लिए बेहद उपयोगी है।
किसी भी प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोप अनुप्रयोग के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रकाश फैलाव और अवशोषण को रोकने के लिए नमूना को पारदर्शी बनाया जाए। पारदर्शिता के लिए कोक्लेया से कैल्शियम को हटाने की प्रक्रिया में डिकैल्सीफिकेशन पहला कदम है। यदि ईडीटीए को निर्जलीकरण से पहले ऊतक से पूरी तरह से धोया नहीं जाता है, तो यह ऊतक के भीतर अवक्षेपित होगा और अच्छी इमेजिंग संभव नहीं होगी। स्पैलेटोल्ज़ क्लियरिंग समाधान की घुसपैठ के लिए इथेनॉल द्वारा निर्जलीकरण आवश्यक है। यदि कोई नमूना भारी रंजित है, तो वर्णक का विरंजन नमूना को अधिक पारदर्शी बनाने में मदद कर सकता है। कई अन्य रसायन और विधियां हैं जिनका उपयोग एक नमूना पारदर्शी बनाने के लिए किया जा सकता है और उपयोगकर्ता यह निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों की कोशिश कर सकते हैं कि कौन सी विधि उनके नमूने के लिए सबसे उपयुक्त है। यद्यपि लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी ऊतक की 2 डी छवियों का उत्पादन करती है, इसका रिज़ॉल्यूशन उतना महान नहीं है जितना ऊतक के पतले यांत्रिक वर्गों (विशेष रूप से प्लास्टिक अनुभागों) और ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी से प्राप्त किया जा सकता है। इसका प्राथमिक लाभ संरचनाओं के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए ऊतक के अच्छी तरह से संरेखित, सीरियल वर्गों का उत्पादन करना है।
दो चूहों कोक्ले जिन्हें हम उम्र बढ़ने के कारण एसजीएन हानि के उदाहरण के रूप में दिखाते हैं, उम्र बढ़ने के कारण न्यूरॉन्स के नुकसान को प्रकट करते हैं। एक अप्रत्याशित खोज बेसल हानि के बजाय कोक्लेया के मध्य और एपिकल सिरों में एसजीएन का नुकसान था जो आधार में बाल कोशिकाओं के नुकसान के अनुरूप होगा। हालांकि, हमने इन कोक्ले में बालों की कोशिका के नुकसान का आकलन नहीं किया और दो नमूने एसजीएन पर उम्र बढ़ने के प्रभावों की जांच के बजाय केवल उदाहरण हैं। व्हाइट एट अल .16 के एक पेपर में, उन्होंने 18 महीने के सी 57 चूहों में एसजीएन हानि का वर्णन किया, लेकिन रोसेंथल की नहर की लंबाई के साथ नुकसान के वितरण को निर्धारित नहीं किया। ग्रियर्सन एट अल.17 के एक अन्य पेपर में, 24-28 महीने के चूहों का उपयोग करते हुए उन्होंने ओएचसी के बड़े पैमाने पर अध: पतन का वर्णन किया, विशेष रूप से कोक्लेया के एपिकल आधे हिस्से में, जहां ओएचसी का एक महत्वपूर्ण नुकसान भी था। दरअसल, भविष्य में नए डेटा को निकालने और उम्र बढ़ने और अन्य अपमानों के कारण कोक्लेया के भीतर पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं की बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए कई संभावनाएं हैं। इसके अलावा, कॉक्लियर इमेज स्टैक कई अन्य जांचकर्ताओं को प्रदान किए गए हैं और यह देखना दिलचस्प होगा कि ये जांचकर्ता अपने शोध प्रश्नों का उत्तर देने के लिए डेटा का खनन कैसे करते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के बधिरता और अन्य संचार विकारों पर राष्ट्रीय संस्थान, केलॉग फाउंडेशन और ब्रिजेट स्परल और जॉन मैककॉर्मिक से निजी दान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है। टीएसएलआईएम को मैथियास हिलेनब्रांड, केर्स्टिन जॉन, मीके लॉइन, मिशेल लेहर, टोबियास श्रोएटर, पीटर शैच, ओलिवर डैनबर्ग और जूलियन वुस्टर की उत्कृष्ट सहायता से विकसित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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