Summary
Her præsenterer vi en trin-for-trin protokol til udførelse af nærhedsmærkning (PL) eksperiment i agurk (Cucumis sativus L.) ved hjælp af AT4G18020 (APRR2)-AirID-protein som model. Metoden beskriver konstruktionen af en vektor, transformationen af en konstruktion gennem agroinfiltration, biotininfiltration, proteinekstraktion og oprensning af biotinmærkede proteiner gennem affinitetsoprensningsteknik.
Abstract
I pattedyrceller og planter har nærhedsmærkning (PL) tilgange ved hjælp af modificeret ascorbatperoxidase (APEX) eller Escherichia coli biotinligase BirA (kendt som BioID) vist sig vellykket til at identificere protein-proteininteraktioner (PPI'er). APEX, BioID og TurboID, en revideret version af BioID, har nogle begrænsninger ud over at være værdifulde teknologier. Den nyligt udviklede AirID, en ny version af BioID til nærhedsidentifikation i protein-protein-interaktioner, overvandt disse begrænsninger. Tidligere er AirID blevet brugt i dyremodeller, mens den aktuelle undersøgelse viser brugen af AirID i planter, og resultaterne bekræftede, at AirID klarer sig bedre i plantesystemer sammenlignet med andre PL-enzymer som BioID og TurboID til proteinmærkning, der er proksimal til målproteinerne. Her er en trin-for-trin protokol til identifikation af proteininteraktionspartnere ved hjælp af AT4G18020 (APRR2) protein som model. Metoderne beskriver konstruktionen af vektor, transformation af konstruktion gennem agroinfiltration, biotintransformation, ekstraktion af proteiner og berigelse af biotinmærkede proteiner gennem affinitetsrensningsteknik. Resultaterne konkluderer, at AirID er et nyt og ideelt enzym til analyse af PPI'er i planter. Metoden kan anvendes til at studere andre proteiner i planter.
Introduction
Forskellige cellulære proteiner arbejder under det biologiske reguleringssystem, og protein-proteininteraktioner (PPI'er) er en del af dette system og grundlaget for mange cellulære processer. Udover PPI'er fremmes funktionen af naturlige proteiner posttranslationelt via forskellige modifikationer såsom dannelse af kompleks, ubiquitination og phosphorylering. Derfor er det vigtigt at studere PPI'er for at forstå den mulige funktion af målproteiner. PPI'er er blevet udført ved hjælp af forskellige teknologier såsom massespektrometrianalyse efter immunudfældning (IP-MS-analyse)1, gær-to-hybridsystem (Y2H)2, også cellefrie baserede arrays3. Disse metoder udforskede forskellige vitale fund inden for forskning. Disse metoder har dog nogle ulemper; for eksempel er Y2H en tidskrævende, dyr strategi, der nødvendiggør opbygning af målartens Y2H-bibliotek.
Derudover bruger Y2H-teknikken gær, en heterolog encellet eukaryot organisme, som ikke nøjagtigt kunne afspejle den cellulære tilstand af højere eukaryote celler. IP-MS er uegnet til proteiner med høj hydrofobicitet og viser lav effektivitet til at fange svage PPI'er. Forskellige essentielle proteiner i planter, såsom nukleotidbindende domæne og leucinrige gentagne (NLR) proteiner og receptorlignende kinaser (RLK'er) udtrykkes på et lavt niveau og interagerer for det meste med andre proteiner forbigående; Derfor er brugen af disse metoder utilstrækkelig til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af disse proteiner3.
En ny teknik kaldet nærhedsbiotinylering (PB) hjælper forskere med at identificere PPI'er. PB afhænger af PL-enzymer, som binder sig til det interessante protein (POI), og når partnerprotein kommer i nærheden af POI, fastgør PL et kemisk biotinmærke til partnerproteinet. Desuden kan det mærkede protein identificeres og kan hurtigt vide, hvilket partnerprotein der binder sig til målproteinet5. Tidligere undersøgelser viste, at BioID og TurboID er vellykkede værktøjer til PPI'er, især i planter, men de har visse begrænsninger4. BioID har brug for et højt niveau af biotin til mærkning af partnerproteiner, hvilket tager mere end 16 timer. Sammenlignet med BioID er TurboID mere fordelagtigt, da det mærker protein på 10 minutter og kan mærke partnerproteinet ved stuetemperatur (RT). Det er også giftigt for celler under visse forhold og mærker de proteiner, der ikke viser interaktion med proteinet af interesse.
For at overvinde disse problemer er AirID, udviklet af Kido et al., Mere effektiv end resten af mærkningsenzymerne, selvom sekvensligheden er 82% mellem BioID og AirID5. For at kontrollere effektiviteten af AirID udførte vi et eksperiment ved hjælp af et IP-objekt med kendte medarbejdere. Dette eksperiment bekræftede, at AirID utvivlsomt kunne mærke associerede proteiner i planteceller. AirID er et værdifuldt enzym til analyse af PPI'er in vitro og i celler. Det skaber mindre toksicitet og er mindre fejlagtigt i tidskrævende processer end TurboID at mærke ikke-partnere, hvilket fører til at dræbe cellen. Det viser, at AirID er mere konkurrencedygtig end andre mærkningsenzymer til nærhedsbiotinylering. Det er mere præcist, har mere potentiale i tidskrævende processer og mindre giftigt in vitro og i levende celler. Den nuværende protokol beskriver identifikationen af interagerende proteiner af APRR2 ved hjælp af AirID som et PL-enzym; Desuden kan metoden anvendes på andre proteiner til at undersøge PPI i plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af plantemateriale
- Cucumis sativus (agurk) anvendes til eksperimentel analyse. Kom frøene i vand, inkuber ved 50 °C i 20 min, og læg derefter frøene på filtrerpapir på en petriplade i 12-16 timer.
- Derefter overføres frøene til potter, der indeholder jord (købt kommercielt) og vokser i et klimakammer ved 23 ° C temperatur og 16 timers lys og 8 timers mørk fotoperiode.
- Vedligehold planterne i klimakammeret i 3-4 uger, indtil planterne når 3 eller 4 bladstadier for vellykket agroinfiltration.
2. Gør AirID-konstruktion
- Brug APRR2 som målprotein og konstruer APRR2-AirID under blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren (p35S: APRR2-AirID). Indfør det i den Gateway-kompatible binære vektor pEarleyGate1006 (leveret af Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University), og syntetiser PL-enzymet direkte i henhold til sekvensen i supplerende fil 1.
3. Forberedelse af kompetente celler
- Fremstilling af DH5a-kompetente celler
- De 2 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l gærekstrakt og 10 g/l NaCl; pH = 7,0.) podes med E.Coli DH5α-celler (direkte fra den frosne bestand uden optøning) og vokser natten over (O/N) ved 37 °C.
- Frisk podes 0,1% -0,5% podning fra O / N-kulturen til 100 ml LB Medium og dyrk cellerne, indtil OD600 når mellem 0,4-0,6, og inkuber derefter kulturen ved 4 ° C i 30 minutter.
- Kulturen hældes i to 50 ml centrifugeglas og centrifugeres ved 2500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, cellerne resuspenderes i 10 ml 0,1 M iskold CaCl2, og lægges på is i 15 minutter. Pillecellerne roteres med 2500 x g centrifugering i 5 minutter ved 4 °C.
- Cellerne resuspenderes i 1 ml iskold 0,1 MCaCl2 + 20% glycerol, alikvote 100 μL i hvert 1,5 ml glas, og de opbevares straks ved -80 °C.
- Fremstilling af GV3101 kompetente celler
- Pod 2 ml LB (indeholdende 50 μg/ml gentamycin og 25 μg/ml rifampicin) med en enkelt GV3101-koloni. Kulturen O/N inkuberes ved 28 °C under omrystning ved 250 omdr./min.
- Pod 200 ml LB med 1 ml mættet kultur natten over. Kulturen rystes ved 250 o/min, mens den inkuberes ved 28 °C, indtil OD600 er lig med 0,5.
- Kulturen overføres til fire forkølede sterile 50 ml centrifugeglas og lægges på is i 30 minutter.
- Ppellets cellerne ved 2500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og pellets lægges på is.
- Resuspender cellerne i 10 ml 0,1 M iskoldCaCl2-opløsning . Saml cellerne sammen i et forkølet 50 ml Oakridge-rør.
- Ppellets cellerne ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 10 ml iskold CaCl2-opløsning. Sæt på is i 30 min.
- Ppellets cellerne ved 1.000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes i 2 ml 0,1 M iskoldCaCl2-opløsning .
- Cellerne hældes i en 50 μL delprøve i forkølede sterile polypropylenrør. Opbevar cellerne ved -80 °C.
4. Agroinfiltration
- Overfør først plasmidet til agrobakterien
- 2,5 μL plasmidet genereret fra trin 2.1 overføres til de kompetente celler i agrobacterium tumefaciens GV3101-stammen og inkuberes på is i 30 minutter.
- Røret indeholdende plasmidet og de kompetente celler overføres til flydende nitrogen i 3 min.
- Varmechok ved 37 °C i 5 minutter i en inkubator, og sæt derefter røret på is i 2 min.
- Der tilsættes 1 000 μL LB-substrat (10 g/l trypton, 5 g/l gærekstrakt og 10 g/l NaCl; pH = 7,0) til agrobakterien og inkuberes ved 30 °C og 118 o/min i 1 time.
- Der centrifugeres ved 3.000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- De øverste 800 μL af opløsningen kasseres, og den resterende opløsning blandes. Derefter plades det på LB (som nævnt i trin 4.1.4 tilsat agar og 50 μg/ml Kanamycin for plasmid og 50 μg/ml gentamycin og 25 μg/ml rifampicin for GV3010 kompetente celler). Pladerne inkuberes ved 30 °C i 48 timer.
BEMÆRK: Det er bedre at vælge nogle kolonier og udføre PCR for at bekræfte genet af interesse7.
- Nogle bakteriekolonier tages op fra pladerne og lægges i LB-medier plus passende antibiotika (se trin 4.1.6). Der inkuberes ved 30 °C og 218 o/min i 36-48 timer.
- Cellerne centrifugeres ved 3.000 x g i 2 minat 4 °C. Resuspender cellerne til OD600 = 1,0 i Agroinfiltration buffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).
- Infiltrer podematerialet (genereret fra trin 4.3) i den (abaxiale) epidermis ved hjælp af en 1 ml kanyleløs sprøjte.
BEMÆRK: Det er bedre at infiltrere hele bladet og vælge at replikere. For 4-5 planter skal du bruge en konstruktion. For hvert blad er 1,5 ml resuspenderede agrobakterier tilstrækkelige. - Planterne vedligeholdes i 36 timer i klimakammeret med en 16 timers lys (ca. 75 μmol·m-2·s-1) og 8 timers mørk fotoperiode ved 23 °C.
- Efter 36 timers konstruktionsinfiltration infiltreres 1 ml 5 μM Biotin (i 10 mMMgCl2-opløsning ) i de allerede infiltrerede blade af konstruktionen.
- Vedligehold de behandlede planter i yderligere 4-12 timer, før du høster bladvævet.
BEMÆRK: Ifølge den tidligere undersøgelse topper målproteinet ved 36 timer, så vælg 36 hpi biotininfiltrationer 4,6. Inkubationsvarigheden for biotin afhænger af målundersøgelsen, men ifølge det nuværende forsøg er en 8 timers inkubationsperiode mere egnet til mærkning af proteiner.
5. Indsamling af prøver
BEMÆRK: Alle materialer til prøveopsamling skal være sterile for at undgå keratinkontaminering, og alle protokoltrin skal udføres i et kontamineringsfrit miljø.
- Skær de infiltrerede blade og overfør dem hurtigt til flydende nitrogen for at undgå proteinnedbrydning.
- Der udføres præpåvisning af protein gennem immunoblotanalyser6; dette anbefales stærkt før Co-immunudfældning (Co-IP).
6. Samlet proteinekstraktion fra blade
- Slib bladene ved hjælp af en stød og mørtel, tilsæt hurtigt 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 og slib langsomt.
- Tag et 15 ml konisk rør, placer et hurtigt filtreringsmaterialefilter oven på det koniske rør, overfør prøveblandingen til røret gennem hurtigfiltreringsmaterialefilteret, og hold det på is.
- Overfør prøverne til et 2 ml rør og tilsæt 1% proteininhibitorcocktail.
- Bland indholdet ved at dreje opad og nedad 7-8 gange og centrifuger ved 1.000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Overfør det øvre opløsningsmiddel i prøverne til nye 2 ml rør, tilsæt 10% β-D-maltosid (β-D.M), og læg det på is i 5 minutter. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
7. Afsaltningskolonnen afbalanceres
- Centrifuger kolonnen ved 1.000 x g i 1 min ved 4 °C.
BEMÆRK: Marker den ene side af søjlen, og sørg for, at den markerede side vender udad under alle centrifugeringsprocesser. - Fjern søjlens top- og bunddæksel, og centrifuger ved 1.000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Kassér væskeopløsningen fra kolonnens opsamlingsrør, og tilsæt 5 ml 1x PBS-buffer til vask.
- Kolonnen centrifugeres ved 1.000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Gentag trin 7.3 og 7.4 mindst fem gange.
8. Vask af magnetiske perler
- Tag et 1,5 ml rør og tilsæt 50 μL streptavidin-C1-konjugerede magnetiske perler.
- Tilsæt 1 ml 1x PBS-BSA til vask, bland grundigt og læg det på magnetstativet i 3 min. Supernatanten kasseres.
- Gentag trin 8.2 mindst tre gange.
- Efter hver vask placeres røret på magnetstativet for at adsorbere perlerne mod den ene side af røret for at fjerne vaskebufferen.
9. Berigelse af biotinylerede proteiner
- Der tilsættes 2 ml af prøverne til kolonnen og centrifugeres ved 1 000 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Tilsæt 1 ml af det afsaltede proteinekstrakt til 50 μL streptavidin-C1-konjugerede magnetiske perler for at afbalancere dem.
- Anbring røret på rotatoren ved normal hastighed, så opløsningen blandes grundigt og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter.
- Placer perlerne på magnetstativet i 3 minutter ved RT, eller indtil de samles på den ene side af røret, for forsigtigt at fjerne supernatanten.
- Tilsæt 1 ml vaskebuffer I (2% SDS i vand), drej ved RT i 2 minutter på en rotator og gentag trin 9.4.
- Anbring røret på rotatoren ved RT i 2 minutter efter tilsætning af 1 ml vaskebuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholsyre [w/v] og 1% Triton X-100). Gentag trin 9.4.
- Der tilsættes 1 ml vaskebuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1 % deoxycholsyre [w/v], 1 % NP40 [v/v]), og drej med en ryster i 2 minutter ved RT. Gentag derefter trin 9.4.
- For at fjerne vaskemidlet tilsættes 1,7 ml 50 ml Tris-HCl (pH = 7,5) og trin 9.4. Gentag dette trin endnu en gang.
- Perlerne vaskes seks gange i 2 minutter hver i 1 ml 50 mM ammoniumbicarbonatbuffer ved RT og gentag trin 9.4.
- Tilsæt 50 μL proteinekstrakt indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (w/v) saccharose (Suc), 2% (w/v) lithiumlaurylsulfat og 1,5% (w/v) dithiothreitol til perlerne, varmechok i inkubatoren ved 100 °C i 5 minutter og følg trin 9.4. Supernatanten opbevares ved -80 °C til LC-MS/MS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge tidligere forskning er agurkgenet APRR2 kandidatgenet, der styrer hvid umoden frugtfarve8. Her blev der udviklet en protokol ved hjælp af AirID som et nærhedsmærkningsenzym for at finde det interagerende partnerprotein APRR2 i agurk. Konstruktionen blev overført til agurkbladene, og efter 36 timer efter infiltration blev biotin overført. Efter 48 timer blev prøverne taget til western blot-analyse for at bekræfte den vellykkede transformation. Proteinerne blev ekstraheret som nævnt ovenfor i protokollen for western blot. De repræsentative data i figur 1 indikerede proteinekspression og biotinylering i de infiltrerede agurkblade, hvilket var de forventede fund baseret på den nyligt modificerede teknik. Resultaterne viste et højere ekspressionsniveau af mærkede proteiner og ekstra bånd sammenlignet med kontrollen. Dette bekræfter, at AirID med succes mærkede målproteinerne i genet af interesse (GOI). Endvidere blev resultaterne også bekræftet ved anvendelse af anti-flag og anti-mus antistoffer, som med succes viste målbåndet med anti-flag antistof (figur 2). Efter bekræftelse gennem western blot-analyse udførte vi yderligere Co-IP ved hjælp af ovennævnte protokol, og de infiltrerende blades biotinylerede proteiner blev med succes beriget til massespektrometrianalyse, som vist i figur 3. Efter berigelse af biotinylerede proteiner med streptavidin C1 konjugerede magnetiske perler blev der observeret flere proteiner af forskellig størrelse, og western blot-analyse afslørede udtværede bånd (figur 3).
Figur 1: Western blot-analyse af proteiner efter transformation til blade for at bekræfte funktionen af AirID ved hjælp af streptavidin-HRP. Figuren bekræfter, at biotinylerede proteiner har fire uafhængige replikater til de konstruerede transformerede prøver. Wild-type blade blev brugt som kontrol. For hver replikat blev 10 μL af prøverne indlæst til western blot-analyse. Streptavidin-HRP (1:6000 fortynding) blev anvendt til at analysere biotinylerede proteiner i forskellige prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Western blot-analyse af proteiner efter transformation til blade for at detektere Taq-sekvensen. 3x-Flag-tagsekvensen blev smeltet sammen med genet af interesse for at bekræfte den vellykkede transformation. Taq-sekvensen blev identificeret gennem western blot-analyse i alle de transformerede prøver. Wild-type agurkbladprøver blev anvendt som kontrol. I alt 10 μL af prøverne blev indlæst til western blot-analyse, og resultaterne blev bekræftet ved hjælp af anti-flag som et første antistof ved fortynding på 1:3000 og anti-mus som et andet antistof ved fortynding 1:10000. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunoblot-analyse af proteinekstrakter. Efter Co-immunudfældning (Co-IP) blev Western blot-analyse af biotinylerede proteiner i de agroinfiltrerede blade af Cucumis sativus (agurk) med streptavidin-HRP udført. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende dossier 1. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det aktuelle eksperiment blev AirID brugt til nærhedsmærkning, som Kido et al. udviklede gennem en algoritme for forfædres enzymrekonstruktion ved hjælp af et stort genomdatasæt og fem konventionelle BirA-enzymer5. Tilfældige mutationer blev brugt i traditionel evolutionær proteinteknik til at øge aktiviteten 9,10, da tilfældige mutationer ikke kan producere dynamiske sekvensændringer. Sammenlignet med andre PL-enzymer har AirID flere fordele. Tidligere var denne PL-metode kun anvendelig på dyresystemer. I denne undersøgelse blev det brugt til at undersøge protein-proteininteraktioner i planter. Protokollen skitserer, hvordan man opsætter den AirID-baserede PL i planter trin for trin, herunder forberedelse af bladprøver, fjernelse af frit biotin, kvantificering af ekstraherede proteiner og berigelse af biotinylerede proteiner.
Ved hjælp af det veletablerede Agrobacterium-medierede forbigående udtryk i agurken bruges denne tilgang til at finde PPI'er af målproteinet af interesse for agurk. Den forbigående ekspression kan resultere i overekspression af fusionsproteinerne. AirID-fusionen skal også testes for at sikre, at den ikke forstyrrer funktionen af det relevante målprotein, hvilket er en anden afgørende overvejelse. Mens PL giver flere fordele i forhold til standard IP-MS-teknikker til påvisning af forbigående eller svage PPI'er, har det dog også nogle begrænsninger. Først og fremmest indebærer opdagelsen af et kandidatinteraktionsprotein ikke automatisk en direkte eller indirekte interaktion med agnproteinet, men afspejler i stedet nærhed til agnproteinet9. PPI'er kan yderligere verificeres in vivo ved hjælp af uafhængige assays (f.eks. co-immunudfældning, bimolekylær fluorescenskomplementation (BiFC) eller in vitro GST-pull down-assay, som kan udføres for at verificere PPI'er yderligere.
Undersøgelsen viste, at den proksimale biotinyleringsaktivitet af AirID var signifikant lavere end TurboID. In vitro og i celler havde TurboID den højeste proksimale biotinyleringsaktivitet. Dette enzym kan anvendes inden for 10 minutter til biotinylat 9,11. I celler behandlet for en langvarig inkubation på over 6 timer og højere biotinkoncentrationer førte den højeste TurboID-aktivitet imidlertid til ekstra biotinylering på uventede proteiner, såsom tubulin og GFP (såsom 50 mM biotin). I modsætning til at blive brugt som et proksimalt biotinyleringsenzym til PPI'er, blev TurboID først rapporteret som et biotin-mærkningsenzym 4,6,5,7. Hvis TurboID skulle evaluere PPI'er, ville det fungere bedst under begrænsende forhold, såsom tidsvarigheden er kort, ca. 1 time i celler. AirID, biotinylering af tubulin og GFP blev ikke fundet under de samme betingelser som dem, der blev observeret for TurboID-biotinylering. AirID-fusionsproteiner viste sig at være i stand til biotinylering af hver velkendt interaktor i begge transienter, som demonstreret ved streptavidin-pull down-analysen og LC-MS / MS-analysen5. Ved lave ATP-koncentrationer (1 mM) var dannelsen af biotinoyl-5-AMP stærkere for AirID end for TurboID. Det favoriserer lavere koncentrationer af biotin (med 5 mM biotin eller uden biotintilskud) end TurboID, som foretrækker højere koncentrationer. Derudover afslørede en undersøgelse af biotinyleringssteder ved hjælp af LC-MS / MS, at AirID-biotinylering forekom uden nogen unik sekvenspræference på en nærliggende Lys-rest, hvilket indikerer, at biotinyleringsprocessen ikke var præference5. Selvom sekvensligheden mellem BioID og AirID er 82%, viste AirID høj biotinyleringsaktivitet mod interagerende proteiner. Kido et al., 2020 fandt ud af, at AirID kan analysere protein-proteininteraktioner in vitro og i celler. Deres resultater tyder på, at biotinylering afhængig af AirID kan være nyttig til PPI-analyse af kemiske forbindelser. Identifikationen af in vivo-partnere af målproteiner er afgørende for forståelsen af biologiske funktioner12,13, og det har afsløret nye PPI'er, så in vivo-nærhedsbiotinylering ved hjælp af BioID er blevet brugt i adskillige undersøgelser. Selv når biotin blev suppleret, resulterede stabil ekspression af AirID ikke i cellevæksthæmning, hvilket indikerer, at ekspressionen af AirID-fusionsproteiner ville være meget lavt toksisk5. AirID forventes at forbedre PPI-afhængig biotinyleringsnøjagtighed i kombination; sammenfattende konkluderes det, at AirID er ideel til PPI-analyse i planter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærede ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 32000197 til X.H.), det særlige økonomiske tilskud fra China Postdoctoral Science Foundation (bevilling nr. 2019T120467 til X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
