Summary
Her presenterer vi en trinnvis protokoll for å utføre nærhetsmerking (PL) eksperiment i agurk (Cucumis sativus L.) ved bruk av AT4G18020 (APRR2)-AirID protein som modell. Metoden beskriver konstruksjonen av en vektor, transformasjonen av en konstruksjon gjennom agroinfiltrasjon, biotininfiltrasjon, proteinekstraksjon og rensing av biotinmerkede proteiner gjennom affinitetsrensingsteknikk.
Abstract
I pattedyrceller og planter har nærhetsmerking (PL) tilnærminger ved bruk av modifisert askorbatperoksidase (APEX) eller Escherichia coli biotinligase BirA (kjent som BioID) vist seg å lykkes med å identifisere protein-proteininteraksjoner (PPI). APEX, BioID og TurboID, en revidert versjon av BioID, har noen begrensninger i tillegg til å være verdifulle teknologier. Den nylig utviklede AirID, en ny versjon av BioID for nærhetsidentifikasjon i protein-protein-interaksjoner, overvant disse begrensningene. Tidligere har AirID blitt brukt i dyremodeller, mens den nåværende studien demonstrerer bruk av AirID i planter, og resultatene bekreftet at AirID presterer bedre i plantesystemer sammenlignet med andre PL-enzymer som BioID og TurboID for proteinmerking som er proksimale for målproteinene. Her er en trinnvis protokoll for å identifisere proteininteraksjonspartnere ved å bruke AT4G18020 (APRR2) protein som modell. Metodene beskriver konstruksjon av vektor, transformasjon av konstruksjon gjennom agroinfiltrering, biotintransformasjon, ekstraksjon av proteiner og anrikning av biotinmerkede proteiner gjennom affinitetsrensingsteknikk. Resultatene konkluderer med at AirID er et nytt og ideelt enzym for analyse av PPI i planter. Metoden kan brukes til å studere andre proteiner i planter.
Introduction
Ulike cellulære proteiner arbeider under det biologisk regulerende systemet, og protein-protein-interaksjoner (PPI) er en del av dette systemet og grunnlaget for mange cellulære prosesser. Foruten PPI fremmes funksjonen til naturlige proteiner posttranslasjonelt via forskjellige modifikasjoner som dannelse av kompleks, ubiquitinering og fosforylering. Derfor er studier av PPI viktig for å forstå den mulige funksjonen til målproteiner. PPI har blitt utført ved hjelp av ulike teknologier som massespektrometrianalyse etter immunutfelling (IP-MS-analyse)1, gjær-to-hybridsystem (Y2H)2, også cellefrie baserte matriser3. Disse metodene utforsket ulike vitale funn innen forskning. Imidlertid har disse metodene noen ulemper; for eksempel er Y2H en tidkrevende, kostbar strategi som nødvendiggjør å bygge målartens Y2H-bibliotek.
I tillegg bruker Y2H-teknikken gjær, en heterolog encellet eukaryot organisme, som ikke nøyaktig kunne reflektere den cellulære tilstanden til høyere eukaryote celler. IP-MS er uegnet for proteiner med høy hydrofobicitet og viser lav effektivitet ved fangst av svake PPI. Ulike essensielle proteiner i planter som nukleotidbindende domene og leucinrike repetisjonsholdige (NLR) proteiner og reseptorlignende kinaser (RLK) uttrykkes på lavt nivå og interagerer for det meste med andre proteiner forbigående; Derfor er bruk av disse metodene utilstrekkelig for å forstå mekanismene som ligger til grunn for reguleringen av disse proteinene3.
En ny teknikk kalt nærhetsbiotinylering (PB) hjelper forskere med å identifisere PPI. PB er avhengig av PL-enzymer, som fester seg til proteinet av interesse (POI), og når partnerprotein kommer nær POI, fester PL en kjemisk biotin-tag til partnerproteinet. Videre kan det merkede proteinet identifiseres og kan raskt vite hvilket partnerprotein som festes til målproteinet5. Tidligere studier viste at BioID og TurboID er vellykkede verktøy for PPI, spesielt i anlegg, men de har visse begrensninger4. BioID trenger et høyt nivå av biotin for merking av partnerproteiner, noe som tar mer enn 16 timer. Sammenlignet med BioID er TurboID mer fordelaktig da den merker protein på 10 minutter og kan merke partnerproteinet ved romtemperatur (RT). Det er også giftig for celler under visse forhold og merker de proteinene som ikke viser interaksjon med proteinet av interesse.
For å overvinne disse problemene er AirID, utviklet av Kido et al., mer effektiv enn resten av merkeenzymene, selv om sekvenslikheten er 82% mellom BioID og AirID5. For å sjekke effektiviteten til AirID gjennomførte vi et eksperiment ved å bruke et interessepunkt med kjente medarbeidere. Dette eksperimentet bekreftet at AirID utvilsomt kunne merke assosierte proteiner i planteceller. AirID er et verdifullt enzym for analyse av PPI in vitro og i celler. Det skaper mindre toksisitet og er mindre feilaktig i tidsriktige prosesser enn TurboID for å merke ikke-partnere, noe som fører til å drepe cellen. Det demonstrerer at AirID er mer konkurransedyktig enn andre merkeenzymer for nærhetsbiotinylering. Det er mer nøyaktig, har mer potensial i tidtakende prosesser, og mindre giftig in vitro og i levende celler. Den nåværende protokollen beskriver identifisering av interagerende proteiner av APRR2 ved bruk av AirID som et PL-enzym; Videre kan metoden brukes på andre proteiner for å undersøke PPI i plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av plantemateriale
- Cucumis sativus (Agurk) brukes til eksperimentell analyse. Legg frøene i vann, rug ved 50 °C i 20 minutter, og legg deretter frøene på filterpapir på en petriskallerken i 12-16 timer.
- Etterpå overfører du frøene til potter som inneholder jord (kjøpes kommersielt) og vokser i et klimakammer ved 23 ° C temperatur og 16 t lys og 8 t mørk fotoperiode.
- Oppretthold plantene i klimakammeret i 3-4 uker til plantene når 3 eller 4 bladstadier for vellykket agroinfiltrering.
2. Få AirID til å konstruere
- Bruk APRR2 som et målprotein og konstruer APRR2-AirID under blomkålmosaikkviruset 35S-promotoren (p35S: APRR2-AirID). Introduser den i den Gateway-kompatible binære vektoren pEarleyGate1006 (levert av Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University), og syntetiser PL-enzymet direkte i henhold til sekvensen gitt i tilleggsfil 1.
3. Forberedelse av kompetente celler
- Fremstilling av DH5α kompetente celler
- Inokuler 2 ml LB (10 g / l trypton, 5 g / l gjærekstrakt og 10 g / l NaCl; pH = 7,0.) med E.Coli DH5a-celler (direkte fra den frosne massen uten tining) og vokse over natten (O / N) ved 37 ° C.
- Nyinokuler 0,1% -0,5% inokulum fra O / N-kulturen til 100 ml LB Medium og vokse cellene til OD600 når mellom 0,4-0,6, og inkuber deretter kulturen ved 4 ° C i 30 minutter.
- Ta kulturen inn i to 50 ml sentrifugerør og spinn ved 2500 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Kast supernatanten, resuspender cellene i 10 ml 0,1 M iskald CaCl2, og sett på is i 15 minutter. Pellet cellene med 2500 x g spinn i 5 minutter ved 4 °C.
- Resuspender cellene i 1 ml iskald 0,1 M CaCl2+ 20% glyserol, alikot 100 μL i hvert 1,5 ml rør, og oppbevar dem umiddelbart ved -80 °C.
- Fremstilling av GV3101 kompetente celler
- Inokuler 2 ml LB (inneholdende 50 μg/ml gentamycin og 25 μg/ml rifampicin) med en enkelt GV3101-koloni. Inkuber kulturen O/N ved 28 °C mens du rister ved 250 o / min.
- Inokuler 200 ml LB med 1 ml mettet kultur over natten. Rist kulturen ved 250 o / min mens du inkuberer den ved 28 ° C til OD600 er lik 0,5.
- Overfør kulturen til fire forkjølte sterile 50 ml sentrifugerør og sett på is i 30 minutter.
- Pellet cellene ved 2500 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og legg pelletsene på is.
- Resuspender cellene i 10 ml 0,1 M iskald CaCl2-løsning . Pool cellene sammen i en pre-kjølt 50 ml Oakridge tube.
- Pellet cellene ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 10 ml iskald CaCl2 oppløsning. Sett på is i 30 min.
- Pellet cellene ved 1000 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten og resuspender cellene i 2 ml 0,1 M iskald CaCl2 oppløsning.
- Dispenser cellene i en 50 μL alikot i forkjølte sterile polypropylenrør. Oppbevar cellene ved -80 °C.
4. Agroinfiltrasjon
- Først overfører du plasmidet til agrobacterium
- Overfør 2,5 μL av plasmidet generert fra trinn 2.1 til de kompetente cellene i agrobacterium tumefaciens GV3101-stammen og inkuber på is i 30 minutter.
- Overfør røret som inneholder plasmidet og de kompetente cellene til flytende nitrogen i 3 minutter.
- Varmesjokk ved 37 °C i 5 min i en kuvøse, og legg deretter røret på is i 2 min.
- Tilsett 1,000 μLof LB-medium (10 g / l trypton, 5 g / l gjærekstrakt og 10 g / l NaCl; pH = 7,0) til agrobakterien og inkuber ved 30 ° C og 118 rpm i 1 time.
- Sentrifuge ved 3000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Kast de øvre 800 mikrol av oppløsningen og bland den gjenværende oppløsningen. Deretter plater du det på LB (som nevnt i trinn 4.1.4 tilsatt agar og 50 μg/ml Kanamycin for plasmid og 50 μg/ml gentamycin og 25 μg/ml rifampicin for GV3010 kompetente celler). Inkuber platene ved 30 °C i 48 timer.
MERK: Det er bedre å plukke noen kolonier og utføre PCR for å bekrefte genet av interesse7.
- Plukk opp noen bakteriekolonier fra platene og legg dem i LB-medier pluss passende antibiotika (se trinn 4.1.6). Inkuber ved 30 °C og 218 o/min i 36–48 timer.
- Sentrifuger cellene ved 3000 x g i 2 minat 4 °C. Resuspender cellene til OD600 = 1,0 i Agroinfiltrasjonsbuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).
- Infiltrer inokulumet (generert fra trinn 4.3) i (abaxial) epidermis ved hjelp av en 1 ml nålefri sprøyte.
MERK: Det er bedre å infiltrere hele bladet og velge å replikere. For 4-5 planter, bruk en konstruksjon. For hvert blad er 1,5 ml resuspenderte agrobakterier tilstrekkelig. - Hold plantene i 36 timer i klimakammeret med 16 timers lys (ca. 75 μmol·m-2·s-1) og 8 timers mørk fotoperiode ved 23 °C.
- Etter 36 timer med konstruktiv infiltrasjon, infiltrer 1 ml 5 μM biotin (i 10 mM MgCl2-løsning ) i de allerede infiltrerte bladene i konstruksjonen.
- Vedlikehold de behandlede plantene i ytterligere 4-12 timer før høsting av bladvevet.
MERK: Ifølge den forrige studien topper målproteinet ved 36 timer, så velg 36 hpi biotininfiltrasjoner 4,6. Inkubasjonsvarigheten for biotin avhenger av målstudien, men ifølge det nåværende eksperimentet er en 8 timers inkubasjonsperiode mer egnet for merking av proteiner.
5. Innsamling av prøver
MERK: Alle materialer for prøveinnsamling skal være sterile for å unngå keratinforurensning, og alle protokolltrinnene skal utføres i et forurensningsfritt miljø.
- Klipp de infiltrerte bladene og overfør dem raskt til flytende nitrogen for å unngå proteinnedbrytning.
- Utfør forhåndspåvisning av protein gjennom immunoblotanalyser6; Dette anbefales sterkt før Co-immunoprecipitation (Co-IP).
6. Total proteinekstraksjon fra blad
- Grind bladene med en pestle og mørtel, tilsett raskt 2 ml 1x PBS-BSA PH 7,4 og slip sakte.
- Ta et 15 ml konisk rør, plasser et raskt filtreringsmaterialefilter på toppen av det koniske røret, overfør prøveblandingen til røret gjennom hurtigfiltreringsmaterialfilteret og hold det på is.
- Overfør prøvene til et 2 ml rør og tilsett 1% proteininhibitorcocktail.
- Bland innholdet ved å vri oppover og nedover 7-8 ganger og sentrifugere ved 1000 x g i 2 min ved 4 °C.
- Overfør det øvre løsningsmidlet i prøvene til nye 2 ml rør, tilsett 10% β-D-maltoside (β-D.M), og legg på is i 5 minutter. Sentrifuge ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
7. Balanserer avsaltingskolonnen
- Sentrifuger søylen ved 1000 x g i 1 min ved 4 °C.
MERK: Merk den ene siden av søylen og sørg for at den markerte siden vender utover under alle sentrifugeringsprosesser. - Fjern topp- og bunndekselet på søylen og sentrifugen ved 1000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Kast væskeoppløsningen fra oppsamlingsrøret i kolonnen og tilsett 5 ml 1x PBS-buffer for vask.
- Sentrifuger kolonnen ved 1000 x g i 2 minutter ved 4 °C.
- Gjenta trinn 7.3 og 7.4 minst fem ganger.
8. Vasking av magnetiske perler
- Ta et 1,5 ml rør og tilsett 50 μL streptavidin-C1-konjugerte magnetiske perler.
- Tilsett 1 ml 1x PBS-BSA for vask, bland godt og sett på magnetstativet i 3 minutter. Kast supernatanten.
- Gjenta trinn 8.2 minst tre ganger.
- Etter hver vask, plasser røret på magnetstativet for å adsorbere perlene mot den ene siden av røret for å fjerne vaskebufferen.
9. Anrikning av biotinylerte proteiner
- Tilsett 2 ml av prøvene i kolonnen og sentrifuge ved 1000 x g i 8 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 1 ml av det avsaltede proteinekstraktet til 50 μL streptapavidin-C1-konjugerte magnetiske perler for å balansere dem.
- Plasser røret på rotatoren med normal hastighet slik at løsningen blandes grundig og inkuberes ved romtemperatur (RT) i 30 minutter.
- Plasser perlene på magnetstativet i 3 minutter ved RT, eller til de samles på den ene siden av røret, for forsiktig å fjerne supernatanten.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer I (2% SDS i vann), roter ved RT i 2 min på en rotator og gjenta trinn 9.4.
- Plasser røret på rotatoren ved RT i 2 minutter etter tilsetning av 1 ml vaskebuffer II (50 mM HEPES: pH = 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoksykolsyre [w / v] og 1% Triton X-100). Gjenta trinn 9.4.
- Tilsett 1 ml vaskebuffer III (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoksykolsyre [w/v], 1% NP40 [v/v]), og roter med en shaker i 2 minutter ved RT. Gjenta deretter trinn 9.4.
- For å fjerne vaskemiddelet, tilsett 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) og gjenta trinn 9,4. Gjenta dette trinnet en gang til.
- Vask kulene seks ganger i 2 minutter hver i 1 ml 50 mM ammoniumbikarbonatbuffer ved RT og gjenta trinn 9.4.
- Tilsett 50 μL av proteinekstraktet som inneholder 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 % (w/v) sukrose (Suc), 2 % (w/v) litiumlaurylsulfat og 1,5 % (w/v) dithiothreitol til kulene, varmesjokk i inkubatoren ved 100 °C i 5 minutter og følg trinn 9.4. Oppbevar supernatanten ved -80 °C for LC-MS/MS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ifølge tidligere forskning er agurkgenet APRR2 kandidatgenet som styrer hvit umoden fruktfarge8. Her ble det utviklet en protokoll ved hjelp av AirID som et nærhetsmerkingsenzym for å finne det samvirkende partnerproteinet til APRR2 i agurk. Konstruksjonen ble overført til agurkbladene, og etter 36 timer etter infiltrasjon ble biotin overført. Etter 48 timer ble prøvene tatt for western blot-analyse for å bekrefte den vellykkede transformasjonen. Proteinene ble ekstrahert som nevnt ovenfor i protokollen for western blot. De representative dataene i figur 1 indikerte proteinuttrykk og biotinylering i de infiltrerte agurkbladene, som var de forventede funnene basert på den nylig modifiserte teknikken. Resultatene viste et høyere ekspresjonsnivå av merkede proteiner og ekstra bånd sammenlignet med kontrollen. Dette bekrefter at AirID vellykket merket målproteinene til genet av interesse (GOI). Videre ble resultatene også bekreftet ved bruk av anti-flagg og anti-musantistoffer, som vellykket viste målbåndet med anti-flaggantistoff (figur 2). Etter bekreftelse gjennom western blot-analyse utførte vi videre Co-IP ved hjelp av protokollen nevnt ovenfor, og de infiltrerende bladenes biotinylerte proteiner ble vellykket anriket for massespektrometrianalyse, som vist i figur 3. Etter anrikning av biotinylerte proteiner med streptavidin C1-konjugerte magnetiske perler ble det observert multiple proteiner av ulik størrelse, og western blot-analyse viste utsmurte bånd (figur 3).
Figur 1: Western blot-analyse av proteiner etter transformasjon til blader for å bekrefte funksjonen til AirID ved bruk av streptavidin-HRP. Figuren bekrefter at biotinylerte proteiner har fire uavhengige replikater for de konstruerte transformerte prøvene. Villtypeblader ble brukt som kontroll. For hver replikasjon ble 10 μL av prøvene lastet for western blot-analyse. Streptavidin-HRP (1:6000 fortynning) ble brukt til å analysere biotinylerte proteiner i forskjellige prøver. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Western blot-analyse av proteiner etter transformasjon til blader for å oppdage Taq-sekvensen. 3x-Flag-tagsekvensen ble smeltet sammen med genet av interesse for å bekrefte den vellykkede transformasjonen. Taq-sekvensen ble identifisert gjennom western blot-analyse i alle de transformerte prøvene. Villtype agurkbladprøver ble brukt som kontroll. Totalt 10 μL av prøvene ble lastet for western blot-analyse, og resultatene ble bekreftet ved bruk av anti-flag som et første antistoff ved fortynning på 1:3000 og anti-mouse som et andre antistoff ved fortynning 1:10000. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Immunoblotanalyse av proteinekstrakter. Etter koimmunutfelling (Co-IP) ble det utført Western blot-analyse av biotinylerte proteiner i de agroinfiltrerte bladene av Cucumis sativus (Agurk) med streptapavidin-HRP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nåværende eksperimentet ble AirID brukt til nærhetsmerking, som Kido et al. utviklet gjennom en algoritme for forfedres enzymrekonstruksjon ved hjelp av et stort genomdatasett og fem konvensjonelle BirA-enzymer5. Tilfeldige mutasjoner ble brukt i tradisjonell evolusjonær proteinteknikk for å øke aktiviteten 9,10 da tilfeldige mutasjoner ikke kan produsere dynamiske sekvensendringer. Sammenlignet med andre PL-enzymer har AirID flere fordeler. Tidligere var denne PL-metoden bare anvendelig for dyresystemer. I denne studien ble det brukt til å undersøke protein-protein-interaksjoner i planter. Protokollen skisserer hvordan man setter opp AirID-basert PL i planter trinn for trinn, inkludert å forberede bladprøver, fjerne fri biotin, kvantifisere ekstraherte proteiner og berike biotinylerte proteiner.
Ved å bruke det veletablerte Agrobacterium-medierte forbigående uttrykket i agurk, brukes denne tilnærmingen til å finne PPI av målproteinet av interesse for agurk. Det forbigående uttrykket kan føre til overekspresjon av fusjonsproteinene. AirID-fusjonen må også testes for å sikre at den ikke forstyrrer funksjonen til målproteinet av interesse, noe som er et annet avgjørende hensyn. Imidlertid, mens PL gir flere fordeler i forhold til standard IP-MS-teknikker for å oppdage forbigående eller svake PPI, har den også noen begrensninger. Først og fremst innebærer det å oppdage et kandidatinteraksjonsprotein ikke automatisk en direkte eller indirekte interaksjon med agnproteinet, men reflekterer i stedet nær nærhet til agnproteinet9. PPI kan verifiseres ytterligere in vivo ved hjelp av uavhengige analyser (f.eks. koimmunoprecipitasjon, bimolekylær fluorescenskomplementering (BiFC), eller in vitro GST-pulldown-analyse, som kan utføres for å verifisere PPI ytterligere.
Studien fant at den proksimale biotinyleringsaktiviteten til AirID var signifikant lavere enn for TurboID. In vitro og i celler hadde TurboID den høyeste proksimale biotinyleringsaktiviteten. Dette enzymet kan benyttes innen 10 minutter for å biotylere 9,11. I celler behandlet for en langvarig inkubasjon på over 6 timer og høyere biotinkonsentrasjoner, førte imidlertid høyeste TurboID-aktivitet til ekstra biotinylering på uventede proteiner, som tubulin og GFP (som 50 mM biotin). I motsetning til å bli brukt som et proksimalt biotinyleringsenzym for PPI, ble TurboID først rapportert som et biotinmerkingsenzym 4,6,5,7. Hvis TurboID skulle evaluere PPI, ville den fungere best under begrensende forhold, for eksempel at varigheten er kort, omtrent 1 time i celler. AirID, biotinylering av tubulin og GFP ble ikke funnet under de samme betingelsene som de som ble observert for TurboID-biotinylering. AirID-fusjonsproteiner ble funnet å være i stand til biotinylering av hver velkjente interaktor i begge transienter, som demonstrert ved streptavidin-pull down-analysen og LC-MS/MS-analysen5. I lave ATP-konsentrasjoner (1 mM) var dannelsen av biotinoyl-5-AMP sterkere for AirID enn for TurboID. Det favoriserer lavere konsentrasjoner av biotin (med 5 mM biotin eller uten biotintilskudd) enn TurboID, som foretrekker høyere konsentrasjoner. I tillegg viste en undersøkelse av biotinyleringssteder ved bruk av LC-MS/MS at AirID-biotinylering forekom uten noen unik sekvenspreferanse på en nærliggende Lys-rest, noe som indikerer at biotinyleringsprosessen ikke var preferentia5. Selv om sekvenslikheten mellom BioID og AirID er 82%, viste AirID høy biotinyleringsaktivitet mot interagerende proteiner. Kido et al., 2020 fant at AirID kan analysere protein-protein-interaksjoner in vitro og i celler. Deres funn tyder på at biotinylering avhengig av AirID kan være nyttig for PPI-analyse av kjemiske forbindelser. Identifiseringen av in vivo-partnere av målproteiner er avgjørende for å forstå biologiske funksjoner12,13, og det har avslørt nye PPI, så in vivo nærhet biotinylering ved bruk av BioID har blitt brukt i mange studier. Selv når biotin ble tilsatt, resulterte ikke stabilt uttrykk for AirID i hemming av cellevekst, noe som indikerer at ekspresjonen av AirID-fusjonsproteiner ville være svært lavt toksisk5. AirID forventes å forbedre PPI-avhengig biotinyleringsnøyaktighet i kombinasjon; oppsummert konkluderes det med at AirID er ideell for PPI-analyse i anlegg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppga ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant nr. 32000197 til X.H.), Special Financial Grant fra China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2019T120467 til X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
