Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agarosevæskegeler dannet ved skjærbehandling under gelering for suspendert 3D-bioprinting

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/64458
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 2
1Department of Pharmacy, University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering, University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences, University of Manchester
* These authors contributed equally

Summary

Skjærbehandling under hydrogeldannelse resulterer i produksjon av mikrogelsuspensjoner som skjærer tynne, men raskt omstruktureres etter fjerning av skjærkrefter. Slike materialer har blitt brukt som en støttematrise for bioprinting komplekse, cellebelastede strukturer. Her beskrives metoder for fremstilling av støtteseng og kompatible bioblekk.

Abstract

Bruken av granulære matriser for å støtte deler under bioprintingsprosessen ble først rapportert av Bhattacharjee et al. i 2015, og siden da har flere tilnærminger blitt utviklet for fremstilling og bruk av støttende gelsenger i 3D-bioprinting. Dette papiret beskriver en prosess for å produsere mikrogelsuspensjoner ved bruk av agarose (kjent som flytende geler), hvor partikkeldannelse styres av påføring av skjær under gelering. Slik prosessering produserer nøye definerte mikrostrukturer, med påfølgende materialegenskaper som gir klare fordeler som innebygging av trykte medier, både kjemisk og mekanisk. Disse inkluderer å oppføre seg som viskoelastiske faste materialer ved null skjær, begrense langdistansediffusjon, og demonstrere den karakteristiske skjærtynnende oppførselen til flokkulerte systemer.

Ved fjerning av skjærspenning har væskegeler imidlertid kapasitet til raskt å gjenopprette sine elastiske egenskaper. Denne mangelen på hysterese er direkte knyttet til de definerte mikrostrukturene som tidligere ble hentydet til; På grunn av behandlingen letter reaktive, ikke-gelerte polymerkjeder ved partikkelgrensesnittet interpartikkelinteraksjoner - som ligner på en borrelåseffekt. Denne raske gjenopprettingen av elastiske egenskaper gjør det mulig å trykke høyoppløselige deler fra biomaterialer med lav viskositet, da rask reformering av støttesengen fanger bioblekket in situ og opprettholder formen. Videre er en fordel med agarosevæskegeler de asymmetriske gelerings- / smelteovergangene (geleringstemperatur på ~ 30 ° C og smeltetemperatur på ~ 90 ° C). Denne termiske hysteresen av agarose gjør det mulig å trykke og dyrke den bioprintede delen in situ uten at støttevæskegelen smelter. Denne protokollen viser hvordan man produserer agarosevæskegeler og demonstrerer deres bruk for å støtte produksjonen av en rekke komplekse hydrogeldeler innen suspended-layer additiv produksjon (SLAM).

Introduction

Hydrogeler er perfekte materialer å bruke som støtter for cellevekst1. Avhengig av materialet som brukes, gel de via milde mekanismer som ikke kompromitterer cellens levedyktighet 2,3. Det høye vanninnholdet (typisk >90%) betyr at næringsstoffer og oksygen lett kan diffundere inn i materialet og avfallsprodukter fra cellemetabolisme diffunderer ut4. Som sådan har celle levedyktighet vist seg å bli bevart i perioder over 1 år5, og det er nå eksempler på hydrogeler som brukes til å lagre eller "pause" celler for fremtidig terapeutisk bruk6. De har blitt mye brukt i vevsteknikk for produksjon av vevlignende strukturer, men deres bruk har en tendens til å være begrenset av vanskeligheten med å kontrollere både strukturen og sammensetningen av materialet. Historisk sett er hydrogelstyrken relativt lav (i forhold til mange harde vev), på grunn av det høye vanninnholdet og lave volumer okkupert av polymermatrisen som danner strukturen. Videre tilbyr mange veier til gelering (termisk, ionotrop, fibrillogenese) rimelig langsom kinetikk, noe som betyr at deres mekaniske egenskaper har en tendens til å utvikle seg jevnt med tiden. Med unntak av interpenetrerende nettverk, resulterer lav mekanisk stivhet og langsomme herdetider ofte i bioblekk som ikke klarer å stå fritt ved avsetning, og har en tendens til å "synke" og miste definisjonen når de først ekstruderes.

I et forsøk på å overvinne dette nøkkelproblemet er det utviklet innebygde utskriftsteknikker som gir støtte under utskrift, mens de mekaniske egenskapene til konstruksjonen utvikler 7,8. Når mikrostrukturen til gelen er fullt utviklet og de mekaniske egenskapene når et optimalt, kan støttematrisen fjernes, vanligvis gjennom skånsom vask eller smelting av støttefasen. Innledende arbeid med denne tilnærmingen benyttet en viskøs pluronisk dispersjon der sekundærfasen ble fordelt9. Mer nylig brukte Bhattacharjee et al. geler i form av granulert karbopol for å demonstrere at cellepaneler kunne suspenderes i støttegelen10. Deretter rapporterte Hinton et al. om ekstrudering av gelbaserte materialer som inneholder celler i en støtteseng som besto av en mikrogelsuspensjon dannet av granulær gelatin11. Etter ekstrudering av den celleholdige hydrogelen og dens påfølgende herding, ble gelatinen fjernet ved forsiktig oppvarming av støttebadet, noe som muliggjorde smelting av gelatinen. Dessverre presenterer denne prosessen fortsatt flere begrensninger. For eksempel er den kjemiske strukturen av gelatin i forhold til kollagen (følgelig til at det er en hydrolysert form for kollagen) slik at mange kjemiske deler over ryggraden kan samhandle med biologiske enheter; Dermed kan en gjenværende støttematrise forstyrre nedstrøms biologiske prosesser. Videre utgjør animalske avledede produkter restriktiv bruk når man ser mot oversettbarheten av en teknologi. Dette skaper utfordringer hvis den produserte delen er ment å brukes klinisk, eller selv om den skal brukes til å svare på grunnleggende biologiske spørsmål, der denne overflateforurensningen kan forårsake et betydelig problem.

Vi har senere opprettet en raffinert prosess som muliggjør suspendert produksjon av hydrogeler, innenfor en støttende matrise, som ikke har noen kostnad under fysiologiske forhold og er dannet av ikke-animalske materialer. Selv om prosessen kan brukes med en rekke biopolymere støtter, gir agarose et materiale som er inert mot biologiske interaksjoner, da det er sukkerbasert og nøytralt ladet ved fysiologisk pH12,13. I stedet for å fragmentere en allerede eksisterende gel, dannes støttematerialet ved påføring av skjær under gelering14,15,16. Dette produserer en matrise av partikler som viser dendronlignende egenskaper på overflaten og dispergeres i en sekundær matrise av ungelled polymer17,18. Resultatet er et materiale med interessante materialegenskaper 19,20,21,22 som kan skjærtynne på samme måte som tidligere rapporterte granulære geler, men har en tendens til å gjenvinne viskositeten raskere når skjæret fjernes 23. Når det cellebærende materialet ekstrudert inn i støttematrisen er fullstendig modnet, kan støttematrisen fjernes gjennom forsiktig omrøring før den plasseres i kultur. Det har vist seg at det er mulig å bruke denne prosessen til å produsere materialer med komplekse strukturer og rekapitulere de biologiske strukturer av både hud og osteokondral regionen23,24,25. Dette metodepapiret beskriver i detalj hvordan man produserer støttematerialet og fremhever passende bioblekk som brukes i en rekke komplekse strukturer.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.

1. Fremstilling av væskegelsuspensjonssengen

  1. Tilbered 1000 ml dispergert agarose (0,5 % w/v) ved å tilsette 5 g agarosepulver til 1000 ml ultrarent vann (type 1, >18 mΩ·cm-1) i en 2000 ml glassflaske.
  2. Tilsett en 70 mm magnetisk omrørestang til den vandige blandingen og fest flaskekorken ved først å stramme helt og deretter løsne med en kvart omdreining.
  3. Løs opp og steriliser blandingen ved å plassere glassflasken i kurven på autoklaven, lukke lokket og kjøre en syklus i 15 minutter ved 121 °C og 1 bar.
    MERK: Denne protokollen brukes alltid til autoklaverløsninger i ytterligere trinn.
  4. Fjern flasken fra autoklaven når autoklaven er avkjølt til 80 °C, og legg den på en magnetomrører (uoppvarmet), med omrøringen satt til 800 o / min.
    FORSIKTIG: Flasken og væsken forblir varme.
  5. Avkjøl solen under omgivelsesforhold, mens du opprettholder konstant omrøring, til temperaturen er lavere enn T-gelen (geleringspunktet), 32 °C.
  6. Ta flasken ut av omrøreren og oppbevar den ved 4 °C.
    MERK: Væskegelen kan lagres til det trengs.

2. Fremstilling av bioblekk

  1. Forbered et gellanbasert bioblekk ved hjelp av en 1% (w / w) sol med lav acyl gellangummi i ultrarent vann (Type 1, >18 mΩ · cm-1).
    1. Vei ut 0,5 g gellanpulver i en veiebåt.
    2. Tilsett 49,5 g ultrarent vann i en 100 ml glassflaske, sammen med en magnetisk omrører.
    3. Brett veiebåten som inneholder gellankraft i to og tilsett pulveret sakte i vannet, mens du rører hele tiden.
    4. Løs opp og steriliser solen ved hjelp av en autoklav og la den avkjøles til 20 °C.
    5. Oppbevar bioblekket ved 4 °C inntil videre bruk.
  2. Forbered et pektin-kollagenblandet bioblekk i ultrarent vann (Type 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Forbered lager 5% (w / v) lavmetoksypektinløsninger ved å veie ut 2,5 g pektinpulver i en veiebåt.
    2. Tilsett 50 ml ultrarent vann i en 100 ml glassflaske, sammen med en magnetisk omrører.
    3. Brett veiebåten som inneholder pektinkraft i to og tilsett pulveret sakte i vannet, mens du rører hele tiden.
    4. Autoklav den vandige blandingen og avkjøl til 20 °C.
    5. Forbered 1: 1 og 2: 1 pektin-kollagenblandinger ved enten å tilsette 3 ml pektinoppløsning til 3 ml kollagenoppløsning eller ved å tilsette 4 ml pektinoppløsning til henholdsvis 2 ml kollagenoppløsning. Bland blandingene forsiktig med en pipette, ved å trekke ut og dispensere blandingen 10x.
      MERK: Denne prosedyren utføres best ved å bruke kalde materialer på is for å forhindre for tidlig gelering av kollagenet. Forkjøling av pektin og kollagen kan oppnås ved lagring ved 4 °C før blanding.
    6. Oppbevares ved 4 °C inntil videre bruk.
  3. Forbered et alginat-kollagenblandet bioblekk i ultrarent vann (Type 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Vei ut 2 g alginatpulver i en veiebåt.
    2. Tilsett 50 ml ultrarent vann i en 100 ml glassflaske, sammen med en magnetisk omrører.
    3. Brett veiebåten som inneholder alginatkraft i to og tilsett pulveret sakte i vannet, mens du rører hele tiden.
    4. Varm opp dispersjonen til 60 °C, under konstant omrøring, til alginatet er fullstendig oppløst (klar, lett brun væske), og avkjøl deretter til 20 °C.
    5. Fortynn alginatoppløsningen med cellekulturmedium som Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) ved å tilsette 25 ml alginatoppløsning til 25 ml DMEM.
    6. Forbered alginat-kollagenblandinger (1:1) ved å tilsette 3 ml alginat/DMEM-oppløsning til 3 ml kollagenoppløsning. Bland blandingene forsiktig med en pipette ved å trekke ut og dispensere blandingen 10x og oppbevare ved 4 °C.
      MERK: Denne prosedyren utføres best ved å bruke kalde materialer på is for å forhindre for tidlig gelering av kollagenet. Forkjøling av pektin og kollagen kan oppnås ved lagring ved 4 °C før blanding.

3. Reologisk karakterisering av bioblekk

  1. Slå på reometeret, sett inn 40 mm takkede geometrier, og la stå i 30 minutter.
  2. Null gaphøyden på reometeret ved hjelp av høydefunksjonen med null gap.
  3. Legg til ~ 2 ml prøve på bunnplaten og senk toppgeometrien for å skape en gaphøyde på 1 mm.
  4. Trim prøven ved å fjerne overflødig materiale som er utvist fra mellom platene. For å gjøre dette, bruk en flat, ikke-slipende kant for å trekke overflødig væske bort fra gapet og suge opp med silkepapir.
    MERK: Trinn 3.2-3.4 gjentas for å endre prøven før hvert av følgende trinn.
  5. Foreta viskosiprofiler for å bestemme injiserbarheten av bioblekket.
    1. Velg viskomitesttest fra brukeralternativene .
    2. Legg inn parametrene for en skjærhastighetskontrollert rampetest: 0,1 til 500 s-1, med en rampetid på 1 min.
    3. Gjenta viskosirampetesten på nye prøver under stresskontroll, ved å bruke øvre og nedre spenninger bestemt fra skjærhastighetskontrollert rampetest i trinn 3.5.2.
  6. Utfør små deformasjonstester for å bestemme geleringsegenskapene til bioblekket.
    1. Velg oscillerende testing fra brukeralternativene .
    2. Skriv inn parametere i en enkelt frekvenstest under konstant belastning: frekvens 1 Hz, belastning 0,5% over 1 time, mens blekket gelerer.
  7. Foreta in situ amplitude- og frekvensmålinger på gelerte prøver.
    1. Velg oscillatorisk test fra brukeralternativene .
    2. Velg amplitudesveip og skriv inn parametrene for en amplitude-feietest som er belastningskontrollert: 0,01 til 500 %, ved en konstant 1 Hz-frekvens .
    3. Last inn en ny prøve, og velg oscillatorisk test fra brukeralternativene . Velg deretter frekvens-, test- og inngangsfrekvensparametere mellom 0,01 og 10 Hz og en belastning som er innenfor det lineære viskoelastiske området (LVR) av spektrene bestemt fra amplitudesveipdataene oppnådd i trinn 3.7.2 (vanligvis en verdi mellom 50% og 80% av LVR).

4. Design og utskrift av 3D-strukturer ved hjelp av en 3D-bioprinter

  1. Start CAD-programvare for å starte genereringen av en CAD-modell .
    1. Velg Verktøy | Materialer i CAD-programvaren for å definere utskriftsparametrene for det valgte bioblekket.
    2. Inngangsutskriftsparametere som er relevante for skriveren som brukes; For 3D-oppdagelsen skriver du for eksempel inn den estimerte filamentdiameteren (~200–500 μm for de fleste bioblekk) i tykkelsesfanen for å bestemme Z-tykkelsen for hvert lag.
      MERK: Delaminering av den endelige konstruksjonen indikerer et behov for å øke tykkelsesverdien, mens tap av oppløsning fremhever behovet for å redusere tykkelsen.
    3. Design ønsket struktur lag for lag ved hjelp av lagfanene i programvaren. Grupper lagene ved hjelp av kategorien Gruppe, og tilordne hvert lag til et nivå på Z-planet ved hjelp av kategorien Nivå .
      1. For eksempel, for å generere en gitterstruktur (ved hjelp av et alginat-kollagenblandet bioblekk fremstilt i trinn 2.3), lag ett lag med filamentene langs x-aksen og et andre lag med filamentene langs y-aksen. Tilordne begge til et separat nivå.
    4. Under kategorien Gruppe bestemmer du byggehøyden ved å velge antall gjentatte enheter i strukturen.
    5. Klikk genereringsverktøyet for å opprette en G-kode for utformingen og vise en 3D-gjengivelse av strukturen.
  2. Lukk BioCAD og start HMI-programvaren (Human Machine Interface ) for å starte utskriftsprosessen.
    1. Monter skrivehodet i henhold til produsentens instruksjoner. Monter mikroventilen på skrivehodet og skru inn den valgte ekstruderingsdysen.
    2. Klikk på funksjonen for måling av nålelengde for å kalibrere skrivehodet.
    3. Last et kulturfartøy (f.eks. en 6-brønns plate) på trykkplattformen.
    4. Aliquot bioblekket inn i utskriftspatronen og skru inn i skrivehodet over mikroventilen.
    5. Koble det monterte skrivehodet til det pneumatiske trykksystemet og velg skrivehode på HMI for å koble til.
    6. Klikk på kontrolltrykket for å tillate innstilling av ekstruderingstrykket.
    7. Når et passende trykk er valgt (~30-120 kPa avhengig av ønsket oppløsning), åpner du G-koden som ble generert tidligere og klikker på Kjør for å starte utskriftsprosessen.

5. Forberedelse av hudanaloger

  1. Dyrkning av humane dermale fibroblaster (HDF) og fettavledede stamceller (ADSC) i DMEM supplert med føtalt bovint serum (FBS) (10 %), HEPES-buffer (2,5 %) og penicillin/streptomycin (1 %) i T75-kolber til 90 % sammenløp er nådd. Dyrkning av humane epidermale keratinocytter (HEK) i keratinocyttvekstmedier (KGM) inntil 70%-80% konfluens er nådd. Hold alle celler under forhold på 37 ° C, 5% CO2 og 95% luft i en inkubator under kultur.
  2. For fremstilling av HDF og ADSC for dermal og adipose bioinks, vask cellene ved forsiktig å pipetere 3 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i kolber, vipp kolben for å virvle PBS over cellene, og aspirer, pass på at du ikke forstyrrer de vedlagte cellene.
    1. For å løfte cellene, pipett 3 ml 1x celledissosiasjonsenzym inn i kolben for å dekke cellene og plasser kolben i en inkubator i 3 minutter, og bank kolben fast mot håndflaten for å løsne cellene. Nøytraliser virkningen av enzymet ved å bruke 6 ml fullstendig DMEM.
      MERK: Inkuber i ytterligere 2 minutter hvis cellene forblir festet etter tapping.
    2. For fremstilling av dermale og fettbioblekk, pipetter cellesuspensjonene i separate 15 ml rør og ta 10 μL fra hver for celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger de resterende cellesuspensjonene ved 300 × g i 5 minutter for å pelletere cellene.
    3. Aspirer supernatanten, pass på at pelleten ikke forstyrres, tilsett egnet polymeroppløsning (tilberedt i trinn 2.2) og bland med forsiktig stimulering ved å pipettere med følgende tettheter:
      1. For fettlaget, pipette 5 × 105 ADSCs mL-1 per 1:1 kollagen til pektinblanding.
      2. For papillærlaget, pipette 3 × 106 HDFs ml-1 per 2:1 kollagen til pektinblanding.
      3. For det retikulære laget, pipette 1,5 × 106 HDFs ml-1 per 2:1 kollagen til pektinblanding.
  3. For å skrive ut, legg hvert bioblekk i en separat kassett og skriv ut konstruksjonen i støttevæskegelen i en petriskål i glass i henhold til instruksjonene i avsnitt 4.
    1. Når utskriften er fullført, injiser 2 ml 200 mM CaCl2∙2H2Orundt konstruksjonen og 3 ml adipogene medier (komplett DMEM supplert med 500 μM isobutyl-metylxanthin [IBMX], 50 μM indometacin og 1 μM deksametason) i væskegelen ved hjelp av en sprøyte og nål. Plasser i en inkubator over natten.
    2. Neste dag, fjern konstruksjonen fra støttebadet ved hjelp av en slikkepott, vask forsiktig i PBS og kultur i 14 dager i adipogen medium i en 6-brønnsplate.
    3. Etter 14 dager, fjern nok medium til å skape et luft-væskegrensesnitt på overflaten av konstruksjonen og frø 2 × 106 keratinocytter på toppen av konstruksjonen for å lage et epidermalt lag.
    4. Kultur videre i 1 uke før analyse.

6. Fremstilling av carotisarteriemodellen

  1. Legg i bioblekkløsningen for gellangummi (som klargjort i trinn 2.1) i en skriverkassett.
  2. Skriv ut carotisarteriemodellen i en petriskål som inneholder støttematerialet til flytende gel i henhold til utskriftsinstruksjonene i avsnitt 4.
  3. Når utskriften er fullført, injiser 2 ml 200 mM CaCl 2∙2H2 O rundt konstruksjonen vedhjelp av en sprøyte og nål.
  4. Etter minst 3 timer, fjern konstruksjonen fra støttebadet med en slikkepott og vask forsiktig i PBS.

Representative Results

Alginat og type I kollagenbioblekk
Utskriftsoppløsning (registrert som funksjon av filamentdiameter) ble observert å være direkte justerbar via endringer i ekstruderingstrykk (figur 1A-C). Ekstruderingstrykk og utskriftsoppløsning var direkte relatert til de minste filamentdiametrene som ble generert ved utskrift ved et ekstruderingstrykk på 30 kPa. Interessant, ved et ekstruderingstrykk på 30 kPa, kunne filamenter som matchet den indre diameteren av ekstruderingsdysen genereres (gjennomsnittlig filamentdiameter: 323 μm ± 50 μm; dysediameter: 300 μm), noe som tyder på at en "maksimal oppløsning" kunne oppnås. Videre kan utskriftsparametrene for denne oppløsningen med hell brukes til generering av et alginat / kollagen vaskulært rør som kan ekstraheres og perfuseres (figur 1D).

Figure 1
Figur 1: Generering av utskrifter med høy oppløsning ved hjelp av SLAM. Skreddersy utskriftsoppløsning av alginat-/kollagengitter som funksjon av filamentdiameter via ekstrudering ved (A) 30 kPa, (B) 60 kPa og (C) 120 kPa. (D) Generering av et alginat / kollagen vaskulært rør. Skalastenger = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Forkortelse: SLAM = suspended-layer additiv produksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Hudanaloger
SLAM ble også brukt til å lage en hudlignende struktur (figur 2A) ved hjelp av et bioblekk dannet av en blanding av kollagen I og pektin. For å oppnå en gradient av mekaniske egenskaper som ligner de som finnes i huden, ble forskjellige proporsjoner av pektin og kollagen brukt i dermal (5% w / w pektin blandet ved 2: 1 med en 5 mg ∙ ml - 1 kollagenbestand) og hypodermal (5% w / w pektin blandet ved 1: 1 med en 5 mg ∙ ml - 1 kollagen lager) lag. Den resulterende strukturen (figur 2Bi-Bii) var godt integrert etter nedsenking i DMEM, uten tegn til delaminering. Det var viktig at det var et høyt nivå av celle levedyktighet gjennom hele strukturen (figur 2Biii) etter en periode på 14 dager med kultur. Interessant, i løpet av kulturperioden stivnet materialene24, noe som indikerer en ombygging av materialet.

Figure 2
Figur 2: Produksjon av en hudlignende struktur. (A) Et skjema som viser hvordan SLAM-prosessen ble brukt til å produsere en lagdelt struktur innebygd med humane dermale fibroblaster. Suspenderingssengen her ble produsert av partikler dannet av agarose, mens hypodermale og dermale lag ble dannet av varierende proporsjoner pektin og kollagen I. (B) Den lagdelte strukturen var ment å representere den trelags strukturen i huden (i). Med suksess i å replikere denne strukturen (ii), ble høye nivåer av celle levedyktighet notert gjennom prøvene, som vist ved kalcein-AM-farging (iii). Skala bar = 5 mm (Bii). Forkortelse: SLAM = suspended-layer additiv produksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Arteria carotis
For å flytte grensene for metoden ble det produsert et utvalg av mer komplekse trykk. I et slikt eksempel ble en bifurcated carotisarterie trykt ved hjelp av 1% gellanbioblekk (figur 3A), som deretter ble tverrbundet ved ekstrudering av 200 mM CaCl2 i væskegelsengen (figur 3B) og ganske enkelt løftet fra støtten etter gelering (figur 3C). Til tross for at forløperutskriftsløsninger hadde lav viskositet, lyktes støttesengen med å muliggjøre produksjon av den komplekse geometrien. Arterien beholdt sin struktur under avsetning, tverrbinding og ekstraksjon (figur 3), uten behov for å endre utskriftskoder for å innlemme ekstra stillas.

Figure 3
Figur 3: Fabrikasjonsprosess av arteria gellan carotis ved bruk av SLAM . (A) Ekstrudering av gellan i væskegelsengen under utskrift, (B) fullført carotisarterietrykk i væskegelen under kryssbinding, og (C) endelig carotisarteriemodell etter uthenting fra væskegelstøtte. Skalastenger = 10 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Vurdering av valg av materialer som brukes til støttesengen
Under utviklingsstadiet var det forskjellige egenskaper som kreves av støttesengen. Disse egenskapene inkluderte: i) opprettholde tilstrekkelig struktur for å suspendere det ekstruderte materialet; ii) skjærtynningskapasitet slik at skrivehodet kan bevege seg fritt gjennom støttematerialet; iii) rask restrukturering (selvhelbredende egenskaper), som danner støtte rundt det deponerte bioblekket; iv) termisk stabil ved både romtemperatur og fysiologiske temperaturer; v) nøytralt (dvs. uladet) materiale som er relativt bioinert, over en rekke pH og elektrolytter (ioniske arter og konsentrasjoner), som forhindrer interaksjoner med celler og ladede bioblekk; vi) ikke-giftig; og, vii) fortrinnsvis fra en ikke-animalsk kilde.

Selv om det er mange biopolymermaterialer som opprettholder flere av disse iboende egenskapene, med kapasitet til å utføre suspendert 3D-additiv produksjon uten å overholde alle disse egenskapene 11,26,27, var intensjonen her å produsere en støtteseng som ville overvinne visse praktiske problemer knyttet til andre støttematerialer. På grunn av de kjemiske egenskapene til agarose, og spesielt når de formuleres som en partikkelformig væskegel, kan alle disse egenskapene oppnås. Dette muliggjorde en støtteseng som kunne brukes over et bredt utvalg av bioblekk23,24,25,28. Faktisk ga materialets bioinerte natur potensialet til å opprettholde den trykte strukturen in situ gjennom hele kulturen, slik at tilstrekkelige tidsskalaer for mange forskjellige bioblekk kunne utvikles fullt ut, uten endringer i biologien. Videre tillot den partikkelformede, tynnende naturen enkel fjerning fra den endelige trykte konstruksjonen, mens den giftfrie, ikke-animalske opprinnelsen tillater potensialet for rask oversettelse mot klinikken, overvinne barrierer knyttet til etiske og regulatoriske krav.

Hensyn i valg av materialer til bioblekkene
I bioprinting med direkte ekstrudering avsettes bioblekk på en 2D-printseng. Det er fordelaktig at monomer bioblekkløsninger har skjærtynnende oppførsel; For å produsere hi-fi-konstruksjoner med fysiologisk relevante dimensjoner må de imidlertid ha lav tiksotropi og gjenopprette til tilstrekkelig høye viskositeter slik at de danner faste filamenter ved avsetning 29,30,31. Med økt viskositet er trykket som kreves for ekstrudering mye høyere, noe som ofte påvirker den innkapslede cellens levedyktighetnegativt 31,32. Suspensjonsbioprinting fjerner denne begrensningen, da det ekstruderte materialet støttes av opphengsbadet gjennom tverrbinding. Denne utviklingen øker enormt utvalget av bioblekkformuleringer som kan brukes. For eksempel har nyere arbeid vist bruken av kollagenløsninger med lav konsentrasjon som skrives ut i svært komplekse geometrier analoge med hjertets indre struktur33,34,35. I applikasjonene nevnt i denne metoden tillot innebygd utskrift at biomaterialblekk ble valgt for å best replikere det fysiologiske miljøet de var ment for, i stedet for deres evne til å bli skrevet ut.

Begrensninger i strukturstørrelse
Gjennom biofabrikasjonslitteraturen har det blitt demonstrert at forskjellige typer bioprintere, drevet av alternative skrivehodeteknologier, kan innlemmes i innebygde produksjonsteknikker. Teknologien som demonstreres her er ikke annerledes, med eksempler som inkluderer en pneumatisk mikroekstruderingsbasert bioprinter (INKREDIBLE), som demonstrert av Senior et al., og ekstruderingsbaserte bioprintere med kontrollerbare mikroventiler (3D Discovery)23. Selv om dette gjør teknologien tilgjengelig for en rekke brukere som kanskje allerede eier en bioprinter, er begrensninger på den oppnåelige størrelsen på strukturen til syvende og sist avhengig av de aktuelle bioprinterspesifikasjonene. I utgangspunktet er hovedbegrensningen på generering av store strukturer definert av størrelsen på utskriftssengen, grensene for X-, Y- og Z-baner, og også størrelsen på fartøyet der støttevæskegelen er inneholdt.

Begrensninger i oppløsning
Ved fremstilling av intrikate strukturer i mikrometerstørrelse er den resulterende oppløsningen svært avhengig av skriverens presisjon (kontroll over trinnstørrelse, ekstruderingsgrad), den indre diameteren på utskriftsdysen og en rekke justerbare programvareparametere, inkludert utskriftshastighet, utskriftstrykk og strømningshastighet36. I tillegg synes kontroll over dråpestørrelsen å være avgjørende for å lette genereringen av høyoppløselige strukturer, med de beste resultatene observert i ekstruderingsskrivere med en kontrollerbar mikroventil. Til slutt, når alle parametere er optimalisert, kan utskriftsoppløsninger oppnås for å matche, eller til og med være mindre enn, den indre diameteren av ekstruderingsdyser, med det avsatte filamentet i størrelsesordenmikrometerskalaen 37. Dette er imidlertid avhengig av optimalisering av alle utskriftsparametrene som tidligere er nevnt, og oppløsningen kan begrenses betydelig av utskriftsmekanismen og presisjonen. Pneumatisk ekstrudering ser for eksempel ikke ut til å tillate samme utskriftsoppløsning som ekstrudering med en kontrollerbar mikroklaff. Det er derfor en potensiell kostnadsimplikasjon for å oppnå maksimal utskriftsoppløsning, da slike systemer medfører en betydelig økt kostnad for brukeren.

Fremtidsutsikter og potensial
For øyeblikket er det stor interesse rundt bruken av suspenderte produksjonsprosesser for å tillate produksjon av komplekse myke strukturer som inneholder innebygde celler, og det vil utvilsomt være betydelige fremskritt i de kommende årene. Kontinuerlig fremgang i å forbedre utskriftsoppløsningen er gitt, selv om det gjenstår å se hvor nødvendig dette vil være, gitt at flertallet av biologiske systemer er i stand til å omorganisere seg på molekylært nivå. Mens fokuset av interesse i media er rundt bruken av 3D-printede vev for direkte å erstatte menneskelig vev etter skade eller sykdom, er eventuelle robuste medisinske prosedyrer aktivert av disse prosessene noen år unna38,39. Det er mer sannsynlig at virkningen av disse komplekse kultursystemene vil være i screening av legemidler eller til og med brukt som verktøy for å forbedre vår forståelse av biologiske prosesser38. Spesielt kan utviklingsbiologi ha stor nytte her, hvor presis kontroll over den spesielle avsetningen av molekyler vil tillate forskere å utforske rollen som multifaktorielle systemer på vevsutviklingsprosesser.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.

Acknowledgments

Forfatterne takker EPSRC (EP/L016346/1), MRC og Doctoral Training Alliance Biosciences for Health for finansiering og støtte til dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060 (2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , Springer. Berlin. 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).

Tags

Bioteknologi utgave 195
Agarosevæskegeler dannet ved skjærbehandling under gelering for suspendert 3D-bioprinting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Senior, J. J., Moakes, R. J. A.,… More

Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter