Summary
根の滲出液の分泌は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルでは、非標的メタボローム分析 を介して アルファルファに対する生体異物の影響を評価する方法について説明します。
Abstract
根の滲出液は、植物の根と周囲の環境との間の情報通信とエネルギー伝達の主要な媒体です。根の滲出液の分泌の変化は、通常、ストレス条件下での植物の外部解毒戦略です。このプロトコルは、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入して、フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)が代謝産物産生に与える影響を研究することを目的としています。まず、水耕栽培実験においてアルファルファ苗をDEHPストレス下で生育させる。次に、植物を50mLの滅菌超純水を含む遠沈管に6時間移し、根の滲出液を採取します。次いで、溶液を真空凍結乾燥機中で凍結乾燥する。凍結サンプルを抽出し、ビス(トリメチルシリル))トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬で誘導体化します。続いて、誘導体化された抽出物は、飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムを使用して測定されます。取得した代謝物データは、バイオインフォマティクス手法に基づいて分析されます。根の滲出液を考慮してアルファルファに対するDEHPの影響を明らかにするために、異なる代謝産物と有意に変化した代謝経路を深く調査する必要があります。.
Introduction
フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)(DEHP)は、可塑性と強度を向上させるための可塑剤としてさまざまなプラスチックやポリマーに広く使用されている合成化合物です。過去数年間で、DEHPが内分泌かく乱物質であり、人間や他の動物の呼吸器系、神経系、生殖器系に悪影響を与えることを示唆する研究が増えています1,2,3。その健康リスクを考慮して、米国環境保護庁、欧州連合、および中国環境モニタリングセンターはすべて、優先汚染物質のリストにDEHPを分類しています。土壌は、プラスチックマルチングと有機肥料の適用、廃水による灌漑、および汚泥農場の適用により、環境中のDEHPの重要なシンクと見なされてきました4。予想通り、DEHPは農地の土壌で遍在的に検出されており、その含有量は中国の一部の地域では乾燥土壌1キログラムあたり最大ミリグラムにまで達しています5,6。DEHPは主に根を介して植物に入り、土壌生態系のさまざまな栄養レベルで生物濃縮を受けることができます7。したがって、ここ数十年にわたって、植物におけるDEHP誘発ストレスについて重大な懸念が提起されてきました。
植物は通常、DEHP曝露に対して脆弱です。DEHPストレスは、種子の発芽と正常な代謝に悪影響を及ぼし、それによって植物の成長と発達を阻害することが観察されています8,9。例えば、DEHPは葉肉細胞に酸化的損傷を誘発し、クロロフィルおよび浸透圧の含有量を減少させ、抗酸化酵素活性を上昇させ、最終的には食用植物の収量および品質を低下させる可能性がある10,11。しかし、DEHPストレスに対する植物の応答に関する以前の研究のほとんどは、酸化ストレスと生理学的および生化学的特性に焦点を当ててきました。植物の代謝に関連する対応するメカニズムはあまり研究されていません。根の滲出液は、植物の根が分泌し、環境に放出する化合物を表す総称です。それらは植物と根圏土壌の間の相互作用媒体と考えられており、植物の成長と発達をサポートする上で重要な役割を果たしています12。根の滲出液がすべての光合成炭素13の約30%〜40%を占めることはよく知られています。汚染された環境では、根の滲出液は、代謝または外部排除を通じて汚染物質のストレスに対する植物の耐性を改善することに関与しています14。結果として、汚染ストレスに対する植物の根の滲出液の応答を深く理解することは、細胞の生化学および生物学的現象に関連する根本的なメカニズムを明らかにするのに役立つ可能性があります15。
メタボロミクス技術は、細胞16、17、組織18、さらには糖、有機酸、アミノ酸、脂質を含む生物19の滲出液内の多数の低分子代謝物を同時に測定するための効率的な戦略を提供します。従来または従来の化学分析法と比較して、メタボロミクスアプローチは検出可能な代謝物の数を大幅に増加させ20、これはより高いスループットの方法で代謝物を同定し、主要な代謝経路を特定するのに役立ちます。メタボロミクスは、重金属21、新興汚染物質22、ナノ粒子19などのストレス環境における生物学的応答の研究分野で広く使用されています。植物に関するこれらの研究のほとんどは、植物内部の代謝変化に焦点を当てていますが、環境ストレスに対する根の滲出液の反応について報告されたものはほとんどありません。したがって、この研究の目的は、アルファルファ根の滲出液を収集するための一般的なガイドラインを導入することです 代謝産物産生に対するDEHPの影響を研究します。この結果は、DEHPによる植物メタボロミクスの追跡調査のためのメソッドガイダンスを提供します。
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Protocol
このプロトコルの目的は、水耕栽培実験からメタボローム分析までの一般的なパイプラインを提供し、アルファルファの根の滲出液に対するDEHPの効果を定量化することです。
1. 水耕栽培実験
注:このプロトコルは、さまざまな濃度のDEHPのストレス下でアルファルファ(メディカゴサティバ)の苗を得るために設計されたアルファルファ水耕栽培実験の例を示しています。3つの処理が設定されました:無添加のコントロール、および1 mg kg-1および10 mg kg-1のdi(DEHP)をスパイクした栄養溶液。DEHPの濃度は、土壌23中のDEHPの実際の含有量に従って設定されました。各処理には6回の反復がありました。
- アルファルファの種子を0.1%次亜塩素酸ナトリウムで10分間、75%エチルアルコールで30分間殺菌します。
- 滅菌した種子を蒸留水で数回すすぎ、暗所で30°Cの滅菌ペトリ皿で湿ったろ紙で発芽させます。
- 20個の均一で発芽した大きなふっくらとした種子を、(μM単位):Ca(NO 3)2、3,500で構成される栄養溶液で満たされた培養ボトルの生着バスケットに移します。NH4H2PO4, 1,000;KNO3, 6,000;MgSO4, 2,000;Na2Fe-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、75;H3 BO3, 46;MnSO4, 9.1;ZnSO4, 0.8;CuSO4, 0.3;(NH4 )6Mo7O24, 0.02.0.1 M KOHを使用して溶液のpHを7.0に調整します。すべてのソリューションを毎週更新します。
- すべての培養ボトルを、光強度150-180 μmol m-2 s-1、日周期16時間、日周期16時間、それぞれ昼(16時間)と夜(8時間)を表す27°Cと20°Cの制御された成長チャンバーに入れます。
- 15本の均一なアルファルファ苗を新しいガラス瓶に移し、2週間後に1 mg kg-1および10 mg kg-1 DEHPストレス下で培養実験を行います。ガラス瓶をアルミホイルとパラフィルムで包み、DEHPの光分解と揮発を防ぎます。同じ条件を適用するには、コントロールボトルもアルミホイルとパラフィルムで包みます。液体レベルを維持するために、毎日栄養溶液を補給します。
- アルファルファの苗の一貫した成長条件を確保するために、2日ごとにボトルをランダムに配置して回転させます。
- 7日間の栽培後、アルファルファの苗をボトルから取り出し、超純水で数回洗浄して、根の滲出液の収集を準備します。
2. 根滲出液の採取・抽出・メタボローム解析
注:このプロトコルは、収集実験、抽出実験、および根の滲出液のメタボローム分析の3つの部分に分かれています。収集実験の目的は、植物サンプルに分泌された代謝物を溶液系に移し、その後の抽出を行うことです。
- 収集実験
- 10本の均一なアルファルファ苗を50 mLの滅菌脱イオン水で満たされた遠心管に移します。根を水に浸して、根の滲出液を6時間収集します。チューブを直立させてください。処理ごとに少なくとも6回の反復を実行します。
- 根を光から保護するために、遠心管をアルミホイルで包みます。
- 植物を取り除き、代謝物プロファイリングのために集めた液体を凍結乾燥します。
- 抽出実験
- 1.8 mLの抽出溶液(メタノール:H2O = 3:1、V / V)をチューブとボルテックスに30秒間加えます。
- 氷水浴中で10分間チューブに超音波を当てる。
- サンプルを4°C、11,000 × g で15分間遠心分離します。
- 200 μLの上清を1.5 mLの微量遠心チューブに慎重に移します。各サンプルから45 μLの上清を採取し、最終容量270 μLの品質管理(QC)サンプルに混合し、サンプルのメタボロームデータのキャリブレーションに使用します。
- 抽出物を真空濃縮器で凍結乾燥します。5 μLの内部標準物質(リボヌクレオール)で乾燥を続けます。
- 真空濃縮器で蒸発させた後、メトキシアミノ化塩酸塩30 μL(ピリジンに20 mg mL-1の濃度で溶解)をチューブに加え、チューブを80°Cで30分間インキュベートします。次に、40 μLのビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬(1%トリメチルクロロシラン[TMC]、V/V)をサンプルに加え、チューブを70°Cで1.5時間置いて誘導体化します。
- サンプルを室温まで冷却し、5 μLの脂肪酸メチルエステル(FAME)(クロロホルム中)をQCサンプルに加えます。
- メタボローム解析
- 1.0 μLの誘導体化抽出物を飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムに注入し、スプリットレスモードを使用したメタボロームプロファイリング分析を行います。
- 根の滲出液の分離にはキャピラリーカラム(30 m x 250 μm x 0.25 μm)を使用し、ヘリウムをキャリアガスとして流速1.0 mL min-1で使用します。注入温度を280°Cに設定し、トランスファーライン温度とイオン源温度をそれぞれ280°Cと250°Cに維持します。
- 分離には、次のオーブンプログラムを使用します:50°Cで1分間の等温加熱、310°Cへの10°C/min-1オーブン ランプ、および310°Cで8分間の最終等温加熱。
- -70 eVのエネルギーで電子衝突モードを実行します。12.5スペクトル/秒の速度で50〜500 m/zのマススキャン範囲のフルスキャンモニタリングモードを使用してマススペクトルを取得します。
- 個々のピークをフィルタリングしてノイズを除去します。偏差値は、四分位範囲に基づいてフィルタリングされます。
- 欠損値を最小値の半分で埋め、データを標準化して正規化します。
- 最終データを.csv形式で統計解析ソフトウェアにインポートして、多変量解析を行います。
- 京都遺伝子ゲノム大百科事典(KEGG)データベース(生体システムの高度な機能と有用性を理解するためのデータベースリソース)で代謝物を調べ、代謝物を炭水化物、酸、脂質、アルコール、アミンなどのさまざまなカテゴリに分類します。統計分析ソフトウェアを使用して円グラフを作成し、すべての根の滲出液における各カテゴリの割合を示します。
- 潜在構造判別分析(OPLS-DA)に教師あり直交射影を適用して、グループ間の違いを示します。
- スクリーニングは、予測における可変重要度(VIP)>1および p < 0.05(スチューデント のt 検定)に基づいて、代謝物を分化代謝物として有意に変化させました。
- メタボロームデータを使用して統計解析ソフトウェアでヒートマップを構築し、さまざまな処理の下でのフォールド変化を使用してヒストグラムを作成します。
- KEGGデータベースとPubchemで代謝差を調べ、代謝差を含む代謝経路をまとめます。パスウェイ エンリッチメント解析またはトポロジー解析を実行します。
- 1.0 μLの誘導体化抽出物を飛行時間型質量分析計(GC-TOF-MS)と組み合わせたガスクロマトグラフシステムに注入し、スプリットレスモードを使用したメタボロームプロファイリング分析を行います。
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Representative Results
この実験では、アルファルファの根の滲出液を上記の方法に従って収集、抽出、および分析しました(図1)。対照、低濃度のDEHP(1 mg L−1)、および高濃度のDEHP(10 mg L−1)の3つの治療群が設定されました。
コントロールのクロマトグラフで合計778のピークが検出され、そのうち314の代謝産物がマススペクトルに従って識別できました。 図2に示すように、これらの代謝産物は、相対的な存在量に基づいて、炭水化物(28.6%)、酸(15.58%)、脂質(13.87%)、アルコール(3.91%)、アミン(0.92%)、その他(37.12%)の6種類に分類できます。0.5%未満の代謝産物は、他の物質としてグループ化されました(図2A)。酸はさらに脂肪酸(56.09%)、アミノ酸(26.62%)、有機酸(13.95%)、およびフェノール酸(3.34%)に細分されました(図2B)。さらに、ほとんどの植物の根の滲出液に含まれるいくつかの一般的な物質は、ピリミジン、ヒドロキシピリジン、フラボノイド、フェノール、ケトン、ピリミジン、フラボノイド、ジテルペンなど、アルファルファの根の滲出液からも検出できます。
VIPスコアに基づいて、異なるDEHP治療間の異なる代謝物の変動を視覚化するために、ヒートマップをプロットしました(図3)。対照と比較して、DEHPへの曝露は、主にいくつかの炭水化物および低分子量有機酸を含むアルファルファ根滲出液中の50の代謝産物の含有量を有意に変化させた。5種類の炭水化物(リキソース、ジギトキソース、エリトロース、トレハロース、フルクトース2,6-ビホスフェート)はDEHP存在下でアップレギュレーションされ、そのうちの2種類(リキソースとジギトキソース)はDEHP濃度が増加するにつれて有意に増加しました。さらに、D-タロースやグルコースなどの単糖類、マルトース、セロビオース、トレハロースなどの二糖類、D-アラビトールなどの糖アルコールを含む5つの代謝産物がDEHPの存在下でダウンレギュレーションされました。炭水化物含量は、植物の生理状態の指標と考えられてきた24。したがって、本明細書における単糖および二糖レベルの低下は、DEHPストレスによって引き起こされる生理学的ストレスを示した。炭水化物と比較して、DEHPはアルファルファ苗の酸代謝に大きな影響を及ぼしました。DEHPへの曝露下で、主に2-アミノ-2-ノルボルナンカルボン酸、5-ヒドロキシインドール-2-カルボン酸、3-ヒドロキシ-L-プロリン、ペラルゴン酸、およびパルミチン酸を含む11の酸代謝産物の含有量が有意に増加した。同時に、DEHPはまた、4'、5-ジヒロキシ-7-メトキシイソフラボンおよびネオヘスペリジンを含むアルファルファ苗中のいくつかのフラボノイドの代謝を阻害した。
DEHPの影響を受ける代謝経路を 図4に示します。DEHPは、光合成の産物であるいくつかの単糖類および二糖類などの炭水化物の代謝を有意に阻害した。したがって、DEHPはアルファルファの光合成をある程度抑制することができます。さらに、DEHPは脂肪酸の代謝を促進することができ、植物がDEHPからのストレスに抵抗するのに役立ちます。DEHPの影響を受ける主な代謝経路は炭水化物代謝と脂肪酸代謝でしたが、アミノ酸代謝、脂質代謝、およびトリカルボン酸(TCA)サイクルへの影響ははるかに少なかった。
図1:アルファルファ根滲出液のノンターゲットメタボローム解析のフローチャート。 BSTFAは、ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)試薬(1%トリメチルクロロシラン[TMC]、V / V)を含む)を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:代謝産物の分類 。 (A)既知の代謝産物と(B)酸の分類。各種類の物質の割合は、各カテゴリのピーク面積の合計を、対照内のすべての物質のピーク面積の合計で除算します。その他の物質は<0.5%の物質であった。その他の酸は<0.5%のものであった。この図はWangら25から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:異なるDEHP処理を施したアルファルファ苗の根の滲出液(VIP > 1、 p < 0.05)の階層的クラスタリング分析のヒートマップ。 赤と緑はそれぞれ存在量が多いことと少ないことを表しています。ACK はコントロールを表します。1 + ADは、1 mg L−1 DEHPによる治療を表します。10+ADは10 mg L−1 DEHPによる治療を表します。この図はWangら25から修正されたものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代謝経路の乱れと生物学的エンドポイント(1 mg L-1 DEHP、10 mg L-1 DEHP)の変化との関係。代謝経路は、京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)のデータベースに基づいて確立されました。緑色のテキストの代謝物は、本研究で検出された代謝物でした。括弧内の「赤いボックス」と「青いボックス」の記号は、代謝産物が生物学的エンドポイントへの寄与をそれぞれ増加(p < 0.05)または減少(p < 0.05)したことを示しています。.この図は、代謝物を糖質、脂肪酸、タンパク質代謝に大別することで、それぞれ緑、赤、黒の長方形のボックスで示されるように読みやすくなっています。ACK はコントロールを表します。1 + ADは、1 mg L−1 DEHPによる治療を表します。10+ADは10 mg L−1 DEHPによる治療を表します。この図はWangら25から修正されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、DEHPストレス下でアルファルファの根の滲出液を収集および測定する方法、およびメタボロームデータを分析する方法に関する一般的なガイダンスを提供します。このプロトコルのいくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。水耕栽培実験では、アルファルファの苗木を、異なる濃度のDEHPを含む栄養溶液で満たされたガラス瓶で水耕栽培しました。ガラス瓶は、DEHPの光分解を防ぎ、すべての培養液中のDEHP濃度の均一性を保証するために、培養期間を通じてアルミホイルで覆うことによって光から保護する必要があります25,26。DEHP濃度は、DEHP27,28で汚染された土壌に通常見られる濃度に従って、1 mg L-1および10 mg L-1に設定されました。根の滲出液の収集中、根を光から保護するために、遠心管をアルミホイルで包む必要があります。ここで、採取時間は6時間とした。収集時間が短すぎると、一部の低存在量の根の滲出液の濃度が低すぎて検出できない可能性があるため、根の滲出液の組成は、DEHPストレス下でのアルファルファ苗の実際の反応を反映していない可能性があります。採取時間が長すぎると、採取した根の滲出液が培養系の微生物によってある程度分解される可能性があります。この場合、いくつかの微生物代謝産物も検出され、根の滲出液の組成が変化する可能性があります29。さらに、正確なメタボロームデータ分析を確実にするために、各治療に対して少なくとも6回の反復を実行する必要があります。
分光光度法、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、イオンクロマトグラフィー(IC)、ガスクロマトグラフィー-タンデム質量分析(GC-MS/MS)、または液体クロマトグラフィーの組み合わせなどの標準的な分析方法を使用して、従来の標的分析法(すなわち、既知の化合物の検索)を使用して測定できるのは、アミノ酸、脂肪酸、フェノール化合物、およびその他の有機酸などの特定の種類の根の滲出液のみです30,31,32タンデム質量分析(LC-MS/MS)を使用します。機器分析技術の発展に伴い、GC-TOF-MS、液体クロマトグラフィー-高分解能質量分析(LC-HR-MS)、および核磁気共鳴(NMR)に基づくノンターゲットメタボローム分析が登場しました33。ノンターゲットメタボローム解析は、根滲出液の他の従来の分析方法と比較して、検出される根滲出液の数を大幅に拡大し、環境ストレスに対する植物の代謝応答を深く理解することを容易にします。
現在の研究の手法には、特に代謝物の定量分析において、いくつかの制限があります。ノンターゲットメタボローム分析は、正確な濃度ではなく、異なる代謝物間の相対的な定量的関係を示すだけです。これは、根の滲出液の環境行動や生態学的影響の調査には不利です34。アルファルファ苗の成長培地については、現在の研究では水耕栽培実験が行われ、制御が容易で操作が容易なという利点があります。しかし、人工水耕栽培環境は実際の土壌環境とは異なり、根による代謝産物の再取り込みによる総滲出率の過小評価につながる可能性があります35。水耕栽培と比較して、砂の培養は、実際の土壌環境に近いため、比較的説得力のある方法であり、現実的な環境での根の滲出液の収集を容易にします36。したがって、実験結果をより説得力のあるものにするために、砂培養または実際の土壌培養の方法を確立するための作業が進行中であり、毒性応答を説明するための実用的な重要性のより良い結果を示す、より詳細な研究を行うのに役立ちます。
ノンターゲット代謝分析に基づいて、環境ストレス37に対する植物の代謝応答を探索するだけでなく、異なる代謝物を決定し、汚染物質の環境挙動における異なる代謝産物の重要な役割をさらに調査することができます38。以前の研究では、植物がストレスを受けているときにペラルゴン酸レベルが根膜損傷の指標として使用できることが示されています39。不飽和脂肪酸(パルミチン酸)も膜の流動性を高めることがわかり40、アルファルファの根の膜をDEHPの損傷から保護する可能性があります。DEHPによって阻害されるいくつかのフラボノイドは、マメ科植物と微生物の間の相互作用に関与することができる。さらに、植物と根圏生物群集との間の相互作用は、特に汚染物質のストレス下で、非標的代謝分析によってより深く解読される可能性がある41。植物の根滲出液のメタボロームフィンガープリントを構築するのに役立つ、非標的代謝分析のための分析機器の開発により、より多くの種類の根滲出液が特定されます43。
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Disclosures
著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる可能性のある競合する金銭的利益や個人的な関係は知られていないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(41877139)、中国国家自然科学財団の主要プロジェクト(41991335)、中国国家重点研究開発プログラム(2016YFD0800204)、江蘇省自然科学基金会(No. BK20161616)、「135」計画、および中国科学院のフロンティアプログラム(ISSASIP1615)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
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