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Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64470
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, 2College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences

Summary

A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.

Abstract

Os exsudatos radiculares são os principais meios de comunicação de informação e transferência de energia entre as raízes das plantas e o ambiente circundante. A alteração na secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo visa introduzir diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) na produção de metabólitos. Primeiro, mudas de alfafa são cultivadas sob estresse de DEHP em um experimento de cultivo hidropônico. Em segundo lugar, as plantas são transferidas para tubos de centrífuga contendo 50 mL de água ultrapura esterilizada por 6 h para coletar exsudatos radiculares. As soluções são então liofilizadas em um liofilizador a vácuo. As amostras congeladas são extraídas e derivatizadas com o reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, os extratos derivatizados são medidos usando um sistema de cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas por tempo de voo (GC-TOF-MS). Os dados de metabólitos adquiridos são então analisados com base em métodos de bioinformática. Metabólitos diferenciais e vias metabólicas significativamente alteradas devem ser profundamente explorados para revelar o impacto do DEHP na alfafa em vista dos exsudatos radiculares.

Introduction

O ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) é um composto químico sintético que é amplamente utilizado em vários plásticos e polímeros como plastificante para melhorar sua plasticidade e resistência. Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem sugerido que o DEHP é um disruptor endócrino e tem efeito adverso sobre os sistemas respiratório, nervoso e reprodutivo de humanos e outros animais 1,2,3. Considerando seu risco à saúde, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, a União Europeia e o Centro de Monitoramento Ambiental da China classificaram o DEHP na lista de poluentes prioritários. O solo tem sido considerado um importante sumidouro de DEHP no meio ambiente, devido à aplicação de cobertura morta plástica e fertilizantes orgânicos, irrigação com água residuária e aplicação de lodo4. Como esperado, o DEHP tem sido detectado de forma ubíqua em solos de terras agrícolas, cujo conteúdo chega a atingir até miligramas por quilograma de solo seco em algumas regiões da China 5,6. O DEHP pode entrar nas plantas principalmente pelas raízes e sofrer biomagnificação em diferentes níveis tróficos nos ecossistemas edáficos7. Portanto, uma preocupação significativa tem sido levantada sobre o estresse induzido pelo DEHP em plantas nas últimas décadas.

As plantas são geralmente vulneráveis à exposição ao DEHP. Observou-se que o estresse DEHP exerce um efeito adverso sobre a germinação e o metabolismo normal das sementes, inibindo o crescimento e desenvolvimento das plantas 8,9. Por exemplo, o DEHP pode induzir danos oxidativos às células do mesofilo, diminuir o conteúdo de clorofila e osmólitos e elevar a atividade enzimática antioxidante, resultando eventualmente em declínio na produtividade e qualidade de plantas comestíveis10,11. No entanto, a maioria dos estudos prévios sobre a resposta das plantas ao estresse por DEHP tem se concentrado no estresse oxidativo e nas características fisiológicas e bioquímicas. Os mecanismos correspondentes associados ao metabolismo vegetal são menos estudados. Exsudato radicular é um termo genérico que descreve compostos que as raízes das plantas secretam e liberam no ambiente. Eles têm sido considerados como o meio de interação entre as plantas e o solo rizosférico, desempenhando um papel importante no suporte ao crescimento e desenvolvimento das plantas12. Sabe-se que os exsudatos radiculares são responsáveis por aproximadamente 30%-40% de todo o carbonofotossintético13. Em ambientes poluídos, exsudatos radiculares estão envolvidos na melhoria da tolerância das plantas ao estresse de poluentes por meio de metabolismo ou exclusão externa14. Como consequência, uma compreensão profunda da resposta dos exsudatos radiculares das plantas ao estresse poluidor pode ajudar a revelar os mecanismos subjacentes associados à bioquímica celular e aos fenômenos biológicos15.

A tecnologia metabolômica fornece uma estratégia eficiente para medir um grande número de metabólitos de pequenas moléculas simultaneamente dentro das células 16,17, tecidos18 e até mesmo exsudatos de organismos 19, incluindo açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e lipídios. Em comparação com métodos de análise química tradicionais ou clássicos, a abordagem metabolômica aumenta consideravelmente o número de metabólitos que podem ser detectados20, o que pode ajudar a identificar metabólitos de uma maneira de maior rendimento e identificar as principais vias metabólicas. A metabolômica tem sido amplamente utilizada no campo de pesquisa da resposta biológica em ambientes de estresse, como metais pesados21, poluentes emergentes22 e nanopartículas19. A maioria desses estudos em plantas tem se concentrado nas alterações metabólicas nos tecidos interiores das plantas, enquanto poucos têm sido relatados sobre a resposta dos exsudatos radiculares ao estresse ambiental. Portanto, o objetivo deste estudo é apresentar diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do DEHP na produção de metabólitos. Os resultados fornecerão uma orientação metodológica para o estudo de acompanhamento da metabolômica vegetal pelo DEHP.

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Protocol

O objetivo deste protocolo é fornecer um pipeline geral, desde um experimento de cultura hidropônica até a análise metabolômica, quantificando o efeito do DEHP sobre exsudatos radiculares de alfafa.

1. Experimento de cultura hidropônica

OBS: Este protocolo apresenta um exemplo de experimento de cultivo hidropônico de alfafa para obtenção de mudas de alfafa (Medicago sativa) sob estresse de diferentes concentrações de DEHP. Foram instituídos três tratamentos: testemunha sem adição e solução nutritiva fortificada com 1 mg kg-1 e 10 mg kg-1 de di(DEHP. As concentrações de DEHP foram fixadas de acordo com o teor real de DEHP no solo23. Cada tratamento teve seis repetições.

  1. Esterilizar sementes de alfafa com hipoclorito de sódio a 0,1% por 10 min e álcool etílico a 75% por 30 min.
    1. Enxaguar as sementes esterilizadas várias vezes com água destilada e, em seguida, germinar em papel de filtro úmido em uma placa de Petri estéril a 30 °C no escuro.
  2. Transfira 20 sementes uniformes, germinadas e volumosas para um cesto de enxertia em um frasco de cultura preenchido com solução nutritiva, composto por (em μM): Ca(NO 3)2, 3.500; NH4H2PO4, 1.000; KNO3, 6.000; MgSO4, 2.000; Na2Fe-etilenodiaminotetracético ácido (EDTA), 75; H 3BO3, 46; MnSO4, 9,1; ZnSO4, 0,8; CuSO4, 0,3; e (NH4 )6Mo7O24, 0,02. Ajustar o pH da solução para 7,0 utilizando KOH 0,1 M. Renove todas as soluções semanalmente.
  3. Colocar todos os frascos de cultura em câmara de crescimento controlado com intensidade luminosa de 150-180 μmol m-2 s-1 com fotoperíodo de 16 h por dia, a 27 °C e 20 °C representando dia (16 h) e noite (8 h), respectivamente.
  4. Transferir 15 mudas uniformes de alfafa para um novo frasco de vidro para experimentos de cultivo sob estresse de 1 mg kg-1 e 10 mg kg-1 de DEHP após 2 semanas. Embrulhe os frascos de vidro com papel alumínio e parafilme para evitar fotólise e volatilização do DEHP. Para aplicar as mesmas condições, envolva também os frascos de controle com papel alumínio e parafilme. Suplemente a solução nutritiva diariamente para manter o nível líquido.
  5. Coloque e gire aleatoriamente os frascos a cada 2 dias para garantir condições consistentes de crescimento para as mudas de alfafa.
  6. Após 7 dias de cultivo, retirar as mudas de alfafa dos frascos e lavar com água ultrapura várias vezes, preparando-se para a coleta dos exsudatos radiculares.

2. Coleta, extração e análise metabolômica de exsudatos radiculares

NOTA: Este protocolo é dividido em três partes: um experimento de coleta, um experimento de extração e análise metabolômica dos exsudatos radiculares. O objetivo do experimento de coleta é transferir os metabólitos secretados nas amostras vegetais para o sistema de solução para posterior extração.

  1. Experiência de coleta
    1. Transferir 10 mudas uniformes de alfafa para tubos de centrífuga preenchidos com 50 mL de água deionizada esterilizada. Submergir as raízes em água para coletar exsudatos radiculares por 6 h; Mantenha os tubos na vertical. Realizar pelo menos seis repetições para cada tratamento.
    2. Envolva os tubos da centrífuga com papel alumínio para proteger as raízes da luz.
    3. Remova as plantas e liofilize o líquido coletado para perfilagem de metabólitos.
  2. Experimento de extração
    1. Adicionar 1,8 ml de solução de extracção (metanol:H2O = 3:1, V/V) aos tubos e vórtice durante 30 s.
    2. Aplique ondas de ultrassom nos tubos por 10 min em banho de água gelada.
    3. Centrifugar as amostras a 4 °C e 11.000 × g durante 15 min.
    4. Transfira cuidadosamente 200 μL de sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Retirar 45 μL de sobrenadante de cada amostra e misturá-lo em amostras de controlo de qualidade (CQ) num volume final de 270 μL, que é utilizado para a calibração dos dados do metaboloma das amostras.
    5. Liofilizar os extratos em um concentrador a vácuo. Continuar a secagem com 5 μL do padrão interno (ribonucleol).
    6. Após evaporação num concentrador a vácuo, adicionar 30 μL de cloridrato de metoxiaminação (dissolvido em piridina a uma concentração de 20 mg mL-1) aos tubos e incubá-los a 80 °C durante 30 minutos. Em seguida, adicionar 40 μL do reagente bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (com 1% de trimetilclorossilano [TMC], V/V) às amostras e colocar os tubos a 70 °C por 1,5 h para derivatização.
    7. Arrefecer as amostras à temperatura ambiente e adicionar 5 μL de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) (em clorofórmio) às amostras de CQ.
  3. Análise metabolômica
    1. Injetar 1,0 μL dos extratos derivatizados em um sistema de cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas por tempo de voo (GC-TOF-MS) para análise de perfil metabolômico usando um modo splitless.
      1. Utilizar coluna capilar (30 m x 250 μm x 0,25 μm) para a separação dos exsudatos radiculares, tendo como gás carreador hélio a vazão de 1,0 mL min-1. Ajuste a temperatura de injeção para 280 °C e mantenha a temperatura da linha de transferência e a temperatura da fonte de íons em 280 °C e 250 °C, respectivamente.
      2. Para a separação, use o seguinte programa de forno: 1 min de aquecimento isotérmico a 50 °C, uma rampa de forno de 10 °C/min-1 a 310 °C e um aquecimento isotérmico final a 310 °C por 8 min.
      3. Execute o modo de colisão de elétrons com -70 eV de energia. Obtenha espectros de massa usando o modo de monitoramento de varredura completa com uma faixa de varredura de massa de 50-500 m/z a uma taxa de 12,5 espectros/s.
    2. Filtre picos individuais para remover ruídos. O valor do desvio é filtrado com base no intervalo interquartil.
    3. Preencha os valores faltantes com metade dos valores mínimos, padronize e normalize os dados.
    4. Importar os dados finais em formato .csv para um software de análise estatística para análise multivariada.
    5. Procure os metabólitos no banco de dados da Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (um recurso de banco de dados para entender funções de alto nível e utilidades do sistema biológico) e classifique os metabólitos em diferentes categorias, como carboidratos, ácidos, lipídios, álcoois e aminas. Use um software de análise estatística para construir um gráfico de pizza para indicar a porcentagem de cada categoria em todos os exsudatos de raiz.
    6. Aplicar projeções ortogonais supervisionadas à análise discriminada de estruturas latentes (OPLS-DA) para demonstrar as diferenças entre os grupos.
    7. Triagem alterou significativamente metabólitos como metabólitos diferenciais com base em uma variável de importância na projeção (VIP) > 1 e p < 0,05 (teste t de Student).
    8. Use os dados do metaboloma para construir mapas de calor com o software de análise estatística e use as mudanças de dobra sob diferentes tratamentos para construir histogramas.
    9. Procure os metabólitos diferenciais no banco de dados KEGG e Pubchem e compile as vias metabólicas contendo os metabólitos diferenciais. Executar análise de enriquecimento de caminho ou análise de topologia.

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Representative Results

Neste experimento, exsudatos radiculares de alfafa foram coletados, extraídos e analisados de acordo com os métodos acima (Figura 1). Três grupos de tratamento foram montados: controle, baixa concentração de DEHP (1 mg L−1) e alta concentração de DEHP (10 mg L−1).

Um total de 778 picos foi detectado no cromatógrafo do controle, dos quais 314 metabólitos puderam ser identificados de acordo com os espectros de massa. Como mostrado na Figura 2, esses metabólitos puderam ser classificados em seis tipos com base na abundância relativa: carboidratos (28,6%), ácidos (15,58%), lipídios (13,87%), álcoois (3,91%), aminas (0,92%) e outros (37,12%). Metabólitos que representaram menos de 0,5% foram agrupados como outras substâncias (Figura 2A). Os ácidos foram subdivididos em ácidos graxos (56,09%), aminoácidos (26,62%), ácidos orgânicos (13,95%) e fenólicos (3,34%) (Figura 2B). Além disso, algumas substâncias comuns nos exsudatos radiculares da maioria das plantas também podem ser detectadas em exsudatos radiculares de alfafa, incluindo pirimidinas, hidroxipiridinas, flavonoides, fenóis, cetonas, pirimidinas, flavonoides e diterpenos.

Um mapa de calor foi construído para visualizar a variação dos metabólitos diferenciais entre os diferentes tratamentos com DEHP, com base no escore VIP (Figura 3). Em comparação com o controle, a exposição ao DEHP alterou significativamente o conteúdo de 50 metabólitos em exsudatos radiculares de alfafa, incluindo principalmente alguns carboidratos e ácidos orgânicos de baixo peso molecular. Cinco tipos de carboidratos (lyxose, digitoxose, erythrose, trehalose, e frutose 2, 6-bihosphate) foram upregulated na presença de DEHP, e dois deles (lyxose e digitoxose) foram significativamente aumentados com o aumento da concentração de DEHP. Além disso, cinco metabólitos foram regulados negativamente na presença de DEHP, incluindo monossacarídeos como D-talose e glicose, dissacarídeos como maltose, celobiose e trealose, e álcoois de açúcar como D-arabitol. O teor de carboidratos tem sido considerado um indicador do estado fisiológico das plantas24. Portanto, a diminuição dos níveis de monossacarídeos e dissacarídeos indicou estresse fisiológico causado pelo estresse DEHP. Comparado aos carboidratos, o DEHP exerceu maior efeito sobre o metabolismo ácido em plântulas de alfafa. Sob exposição ao DEHP, o conteúdo de 11 metabólitos ácidos aumentou significativamente, incluindo principalmente ácido 2-amino-2-norbornanocarboxílico, ácido 5-hidroxiindol-2-carboxílico, 3-hidroxi-L-prolina, ácido pelargônico e ácido palmítico. Ao mesmo tempo, o DEHP também inibiu o metabolismo de alguns flavonoides em mudas de alfafa, incluindo 4', 5-diirróxi-7-metoxiisoflavona e neohesperidina.

As vias metabólicas influenciadas pelo DEHP estão descritas na Figura 4. O DEHP inibiu significativamente o metabolismo de carboidratos, como alguns monossacarídeos e dissacarídeos, que são produtos da fotossíntese. Portanto, o DEHP pode suprimir a fotossíntese da alfafa até certo ponto. Além disso, o DEHP pode promover o metabolismo de ácidos graxos, que são úteis para as plantas resistirem ao estresse do DEHP. As principais vias metabólicas influenciadas pelo DEHP foram o metabolismo de carboidratos e o metabolismo de ácidos graxos, enquanto o metabolismo de aminoácidos, o metabolismo lipídico e o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) foram afetados em muito menor grau.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma de análise metabolômica não direcionada para exsudatos radiculares de alfafa. BSTFA representa o reagente bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) (com 1% de trimetilclorossilano [TMC], V/V). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Classificação dos metabolitos . (A) Classificação dos metabólitos conhecidos e (B) ácidos. A percentagem de cada tipo de material é dividida pela soma da área do pico de cada categoria pela soma da área do pico de todas as substâncias do controlo. Outras substâncias foram as de <0,5%. Outros ácidos foram aqueles em <0,5%. Esse valor foi modificado de Wang et al.25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Mapa de calor da análise de agrupamento hierárquico para exsudatos radiculares (VIP > 1, p < 0,05) de plântulas de alfafa com diferentes tratamentos com DEHP. O vermelho e o verde representam alta e baixa abundância, respectivamente. ACK representa o controle; 1+DA representa o tratamento com 1 mg L−1 DEHP; 10+DA representa o tratamento com 10 mg L−1 DEHP. Esse valor foi modificado de Wang et al.25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Relações entre o distúrbio das vias metabólicas e as alterações nos desfechos biológicos (1 mg L−1 DEHP, 10 mg L−1 DEHP). As vias metabólicas foram estabelecidas com base no banco de dados da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG). Os metabólitos em texto verde foram os metabólitos detectados no presente trabalho. Os sinais "caixas vermelhas" e "caixas azuis" entre parênteses indicam que os metabólitos aumentaram (p < 0,05) ou diminuíram (p < 0,05) as contribuições para os desfechos biológicos, respectivamente. A figura foi tornada legível separando os metabólitos aproximadamente em metabolismo de carboidratos, ácidos graxos e proteínas, como mostrado pelas caixas retangulares verde, vermelha e preta, respectivamente. ACK representa o controle; 1+DA representa o tratamento com 1 mg L−1 DEHP; 10+DA representa o tratamento com 10 mg L−1 DEHP. Esse valor foi modificado de Wang et al.25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo fornece orientação geral sobre como coletar e medir os exsudatos radiculares da alfafa sob estresse DEHP, bem como analisar os dados do metaboloma. É preciso prestar muita atenção a algumas etapas críticas desse protocolo. Em experimentos de cultivo hidropônico, plântulas de alfafa foram cultivadas hidroponicamente em frascos de vidro preenchidos com soluções nutritivas com diferentes concentrações de DEHP. Os frascos de vidro devem ser protegidos da luz, cobrindo-os com papel alumínio durante todo o período de cultivo, a fim de evitar fotólise de DEHP e garantir a uniformidade das concentrações de DEHP em todas as soluções de cultura25,26. As concentrações de DEHP foram fixadas em 1 mg L-1 e 10 mg L-1, de acordo com as concentrações usualmente encontradas em solos contaminados com DEHP27,28. Durante a coleta dos exsudatos radiculares, os tubos da centrífuga ainda precisam ser envolvidos com papel alumínio para proteger as raízes da luz. Aqui, o horário de coleta estava previsto para ser de 6 h. Se o tempo de coleta for muito curto, a concentração de alguns exsudatos radiculares de baixa abundância pode ser muito baixa para ser detectada, de modo que a composição dos exsudatos radiculares pode não refletir a resposta real das plântulas de alfafa sob estresse de DEHP. Se o tempo de coleta for muito longo, os exsudatos radiculares coletados podem ser degradados até certo ponto por micróbios nos sistemas de cultura. Nesse caso, alguns metabólitos microbianos também podem ser detectados, alterando a composição dos exsudatos radiculares29. Além disso, pelo menos seis repetições devem ser realizadas para cada tratamento, a fim de garantir uma análise precisa dos dados do metaboloma.

Apenas alguns tipos de exsudatos radiculares, como aminoácidos, ácidos graxos, compostos fenólicos e outros ácidos orgânicos, podem ser determinados usando métodos analíticos direcionados convencionais (isto é, busca de compostos conhecidos)30,31,32, usando métodos analíticos padrão, como espectrofotometria, cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), cromatografia iônica (CI), cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas em tandem (GC-MS/MS) ou cromatografia líquida combinada com espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Com o desenvolvimento de técnicas de análise instrumental, a análise metabolômica não direcionada surgiu baseada em GC-TOF-MS, cromatografia líquida-espectrometria de massas de alta resolução (LC-HR-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN)33. Em comparação com outros métodos analíticos convencionais de exsudatos radiculares, a análise metabolômica não direcionada expande consideravelmente o número de exsudatos radiculares detectados, o que facilita a compreensão profunda das respostas metabólicas das plantas ao estresse ambiental.

A técnica do presente estudo apresenta algumas limitações, principalmente na análise quantitativa de metabólitos. A análise metabolômica não direcionada demonstra apenas as relações quantitativas relativas entre diferentes metabólitos, em vez de concentrações precisas. Isso é desfavorável para investigações sobre os comportamentos ambientais ou efeitos ecológicos dos exsudatos radiculares34. Para o meio de crescimento de mudas de alfafa, experimentos de cultivo hidropônico foram realizados no presente estudo, os quais têm como vantagens o fácil controle e a fácil operação. No entanto, o ambiente de crescimento hidropônico artificial é diferente do ambiente real do solo, levando a uma possível subestimação das taxas de exsudação bruta devido à recaptação de metabólitos pelas raízes35. Comparada à cultura hidropônica, a arenicultura é um método relativamente mais convincente, pois está mais próxima do ambiente real do solo, facilitando a coleta de exsudatos radiculares em um ambienterealista36. Portanto, estão em andamento trabalhos para estabelecer um método de cultivo de areia ou mesmo cultivo real do solo para tornar os resultados experimentais mais convincentes, o que nos ajudará a realizar pesquisas mais aprofundadas, mostrando melhores resultados de significado prático para explicar a resposta à toxicidade.

Com base na análise metabólica não direcionada, podemos não apenas explorar a resposta metabólica das plantas ao estresse ambiental37, mas também determinar metabólitos diferenciais e investigar o importante papel dos metabólitos diferenciais no comportamento ambiental dos contaminantes38. Estudos prévios mostraram que o nível de ácido pelargônico pode ser usado como um indicador de danos à membrana radicular quando as plantas estão sob estresse39. Ácidos graxos insaturados (ácido palmítico) também foram encontrados para aumentar a fluidez da membrana40, o que pode proteger as membranas da raiz de alfafa de danos DEHP. Alguns flavonoides inibidos pelo DEHP podem participar da interação entre leguminosas e microrganismos. Além disso, as interações entre plantas e a comunidade biológica da rizosfera podem ser decifradas mais profundamente com análises metabólicas não direcionadas, especialmente sob o estresse de contaminantes41. Mais tipos de exsudatos radiculares serão identificados42 com o desenvolvimento de instrumentos analíticos para análise metabólica não direcionada, o que é útil para a construção da impressão digital metabolômica de exsudatos radiculares de plantas43.

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Disclosures

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relações pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41877139), os Grandes Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41991335), o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFD0800204), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (No. BK20161616), o Plano "135" e o Programa de Fronteiras da Academia Chinesa de Ciências (ISSASIP1615).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Ciências Ambientais Edição 196
Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos
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Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. … More

Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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