Summary
न्यूरोहूमीएक्स समीपस्थ और प्रतिनिधि सह-संस्कृति स्थितियों के तहत बैक्टीरिया, उपकला और न्यूरोनल कोशिकाओं की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उन्नत आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल है। यह मॉडल आंत माइक्रोबायोम और तंत्रिका तंत्र के बीच संचार को अंतर्निहित आणविक तंत्र को उजागर करने की अनुमति देता है।
Abstract
मानव शरीर कम से कम उतनी ही माइक्रोबियल कोशिकाओं द्वारा उपनिवेशित होता है क्योंकि यह मानव कोशिकाओं से बना होता है, और इनमें से अधिकांश सूक्ष्मजीव आंत में स्थित होते हैं। हालांकि आंत माइक्रोबायोम और मेजबान के बीच परस्पर क्रिया का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, आंत माइक्रोबायोम आंत्र तंत्रिका तंत्र के साथ कैसे बातचीत करता है, यह काफी हद तक अज्ञात है। आज तक, आंत माइक्रोबायोम-तंत्रिका तंत्र इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक शारीरिक रूप से प्रतिनिधि इन विट्रो मॉडल मौजूद नहीं है।
इस अंतर को भरने के लिए, हमने डिवाइस में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंटरिक न्यूरॉन्स को पेश करके मानव-माइक्रोबियल क्रॉसटॉक (HuMiX) आंत-ऑन-चिप मॉडल विकसित किया। परिणामी मॉडल, 'न्यूरोहूमिक्स', अर्ध-पारगम्य झिल्ली द्वारा अलग किए गए माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में बैक्टीरिया, उपकला और न्यूरोनल कोशिकाओं की सह-संस्कृति की अनुमति देता है। विभिन्न सेल प्रकारों के पृथक्करण के बावजूद, कोशिकाएं घुलनशील कारकों के माध्यम से एक दूसरे के साथ संवाद कर सकती हैं, साथ ही साथ प्रत्येक सेल प्रकार का अलग से अध्ययन करने का अवसर प्रदान करती हैं। यह सेटअप पहली अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति देता है कि आंत माइक्रोबायोम एंटरिक न्यूरोनल कोशिकाओं को कैसे प्रभावित करता है। यह मानव आंत माइक्रोबायोम-तंत्रिका तंत्र अक्ष का अध्ययन और समझने में एक महत्वपूर्ण पहला कदम है।
Introduction
मानव आंत माइक्रोबायोम मानव स्वास्थ्य और बीमारी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पिछले डेढ़ दशक में इसका बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और स्वास्थ्य और बीमारी को संशोधित करने में इसकी संभावित भूमिकाअब स्थापित हो गई है। एक असंतुलित माइक्रोबियल समुदाय (डिस्बिओसिस) के लिए अग्रणी माइक्रोबायोम में व्यवधान को कई पुरानी विकारों, जैसे मोटापा, सूजन आंत्र रोग, और कोलोरेक्टल कैंसर, या यहां तक कि पार्किंसंस रोग 2,3 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के रोगजनन में शामिल माना गया है।
यद्यपि मानव आंत माइक्रोबायोम न्यूरोलॉजिकल स्थितियों से जुड़ा हुआ है, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि आंत माइक्रोबायोम आंत्र तंत्रिका तंत्र के साथ कैसे संवाद करता है और प्रभावित करता है। चूंकि मानव आंत्र तंत्रिका तंत्र तत्काल अध्ययन के लिए आसानी से सुलभ नहीं है,इसलिए अब तक प्रयोगों में पशु मॉडल का उपयोग किया गया है। हालांकि, पशु मॉडल और मनुष्यों5 के बीच स्पष्ट अंतर को देखते हुए, मानव आंत की नकल करने वाले इन विट्रो मॉडल का विकास तत्काल रुचि का है। इस संदर्भ में, मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) के बढ़ते और आगे बढ़ने वाले क्षेत्र ने हमें प्रतिनिधि एंटरिक न्यूरॉन्स (ईएनएस) 6 प्राप्त करने की अनुमति दी है। आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएन इन विट्रो कल्चर मॉडल में एंटरिक तंत्रिका तंत्र के अध्ययन की अनुमति देते हैं, जैसे कि सेल कल्चर इंसर्ट, ऑर्गेनोइड्स, या ऑर्गन-ऑन-ए-चिप 7,8।
मानव-माइक्रोबियल क्रॉसटॉक (HuMiX) मॉडल एक आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल है जो मानव आंत9 की नकल करता है। प्रारंभिक HuMiX मॉडल (इसके बाद प्रारंभिक उपकरण के रूप में संदर्भित) ने उपकला कोशिकाओं (Caco-2) और जीवाणु कोशिकाओं10,11 को समायोजित किया। हालांकि, आंत माइक्रोबायोम-तंत्रिका तंत्र लिंक का अध्ययन करने के लिए, आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएन6 को सिस्टम में भी पेश किया गया है (चित्रा 1)। न्यूरोनल, उपकला और जीवाणु कोशिकाओं की समीपस्थ सह-संस्कृति व्यक्तिगत रूप से विभिन्न सेल प्रकारों के विश्लेषण और मानव आंत की नकल करने वाले वातावरण में विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति देती है।
हाल के वर्षों में, ऑर्गन-ऑन-ए-चिप (जैसे, आंत-ऑन-ए-चिप) मॉडल का उपयोग करके अधिक शारीरिक रूप से प्रतिनिधि तरीकों से अंगों का अध्ययन करने के लिए मॉडल के विकास में प्रगति हुई है। ये मॉडल निरंतर पोषक तत्वों की आपूर्ति और अपशिष्ट हटाने के कारण मानव आंत के वातावरण के अधिक प्रतिनिधि हैं, साथ ही साथ वास्तविक समय की निगरानी, उदाहरण के लिए, ऑक्सीजन का स्तर या बाधा अखंडता 8,12। ये मॉडल विशेष रूप से मेजबान कोशिकाओं पर आंत बैक्टीरिया के प्रभावों के अध्ययन की अनुमति देते हैं। हालांकि, आंत माइक्रोबायोम और तंत्रिका तंत्र के बीच अंतर्संबंधों का अध्ययन करने के लिए अंगों-ऑन-ए-चिप का उपयोग करने में सक्षम होने के लिए, न्यूरोनल कोशिकाओं को ऐसी प्रणालियों में एकीकृत करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, HuMiX को और विकसित करने और न्यूरोHuMiX प्रणाली (इसके बाद डिवाइस के रूप में संदर्भित) की स्थापना का उद्देश्य एक आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल विकसित करना था, जिसमें आंत उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया के साथ समीपस्थ सह-संस्कृति में एंटरिक न्यूरोनल कोशिकाएं शामिल हैं।
Protocol
1. सेल संस्कृति और सॉर्टिंग
- प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंटरिक न्यूरॉन्स
नोट: रन शुरू होने से 6 सप्ताह पहले आईपीएससी को कल्चर करें। ईएन के लिए विभेदन प्रोटोकॉल को फतही एट अल.6 से अनुकूलित किया गया है।- आईपीएससी कल्चर माध्यम के 2 एमएल / वेल में मैट्रिक्स जेल-लेपित 6-वेल प्लेट पर आईपीएससी को 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक करें।
- 80% -90% कंफ्लुएंसी पर, कोशिकाओं को पारित करें, एक ही माध्यम का उपयोग करके मैट्रिक्स जेल-लेपित प्लेट में बीज डालें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 90% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) पर इनक्यूबेट करें।
- आईपीएससी व्युत्पत्ति के लिए, पिघलने के बाद दो मार्गों के बाद, 80% -90% प्रवाह पर, कोशिकाओं को 100,000 कोशिकाओं / कुएं के घनत्व पर मैट्रिक्स जेल-लेपित 6-वेल प्लेट में बीज दें। उपरोक्त वर्णित मीडिया + रॉक अवरोधक वाई -27632 (1: 2,000) में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- तालिका 1 के अनुसार, 24 घंटे के बाद, सतह पर तैरनेवाला माध्यम को दिन 0 माध्यम से प्रतिस्थापित करें। व्युत्पत्ति प्रक्रिया के लिए सेल सॉर्टिंग के दौरान नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने वाले एक नियंत्रण को अच्छी तरह से शामिल करें। पूरे व्युत्पत्ति अवधि के लिए दिन 0 मीडिया संरचना में नियंत्रण अच्छी तरह से रखें। तालिका 1 के अनुसार, दिन 2 से 10 तक हर दूसरे दिन माध्यम बदलें।
- 11 वें दिन, सीडी 49 डी-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें, जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल के निम्नलिखित चरणों में किया जाएगा।
- सीडी 49 डी-पॉजिटिव कोशिकाओं के साथ-साथ नियंत्रण के आधार पर क्रमबद्ध की जाने वाली कोशिकाओं को पूल करें। 300 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल गोली को 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) + 1 x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 1% पी / एस में पुन: निलंबित करें।
- प्रत्येक सेल लॉट (पूल और नियंत्रण) को दो में विभाजित करें: एक अंश को एंटी-ह्यूमन सीडी 49 डी एंटीबॉडी के साथ दाग दें, और दूसरे अंश को आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ।
- मुख्य सेल आबादी को गेट करें और फिर एकल कोशिकाओं को गेट करें, जिसके आधार पर उनकी सतह पर सीडी 49 डी पेश करने वाली कोशिकाओं का चयन किया जाएगा। भेदभाव के अगले चरण के लिए इन कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
नोट: आमतौर पर, 30% -40% क्रमबद्ध कोशिकाएं सीडी 49 डी-पॉजिटिव होती हैं।
- स्फेरॉइड गठन की अनुमति देने के लिए 4 दिनों के लिए एन 2 बी 27 मीडिया (तालिका 2 देखें) + एफजीएफ 2 + सीएचआईआर में अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट के एक 6-वेल प्लेट में दो से चार मिलियन क्रमबद्ध कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
- 15 वें दिन, पॉली एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन/फाइब्रोनेक्टिन (पी/एल/एफ)-लेपित 6-वेल प्लेट पर जीडीएनएफ और एस्कॉर्बिक एसिड (एए) के साथ एन2बी27 मीडिया के 2 एमएल/वेल में स्फेरॉइड को फिर से लगाएं। हर 2-3 दिनों में माध्यम बदलें।
नोट: कोटिंग अनुपात: पॉली एल-ऑर्निथिन, 15 μg / लैमिनिन, 2 μg / फाइब्रोनेक्टिन, 1x PBS में 2 μg / mL। - 3 सप्ताह के बाद, डिवाइस में टीकाकरण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करें।
- Caco-2
नोट: एक रन से कम से कम 1 सप्ताह पहले काको -2 कोशिकाओं को पिघलाएं।- आरपीएमआई 1640 ग्लूटामाइन पूरक + एचईपीईएस + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में 1 ×10 6 कैको -2 कोशिकाओं के साथ एक टी 75 फ्लास्क बीज; 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 90% आरएच पर इनक्यूबेट।
नोट: इन प्रयोगों के लिए, आदर्श रूप से पिघलने के बाद अपने पहले या दूसरे मार्ग पर काको -2 का उपयोग करें।
- आरपीएमआई 1640 ग्लूटामाइन पूरक + एचईपीईएस + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में 1 ×10 6 कैको -2 कोशिकाओं के साथ एक टी 75 फ्लास्क बीज; 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 90% आरएच पर इनक्यूबेट।
2. HuMiX रन तैयारी
- पॉली कार्बोनेट ढक्कन तैयारी और कोटिंग
- प्रारंभिक डिवाइस उपकरण चक्र का उपयोग करके चार स्क्रू के साथ पॉली कार्बोनेट (पीसी) ढक्कन (चित्रा 2) की एक जोड़ी आटोक्लेव (विवरण के लिए तालिका 3 देखें)।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, नीचे पीसी ढक्कन के प्रत्येक कोने में चार स्क्रू डालें ( चित्रा 3 देखें) और दो-चरणीय कोटिंग प्रक्रिया के लिए बाँझ वर्ग पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- पहले दिन, पीसी ढक्कन के बीच में पीबीएस (1x) में 1.5% पॉली एल-ऑर्निथिन के 2 एमएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 90% आरएच पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- अगले दिन, समाधान को हटा दें और न्यूरोनल सेल कक्ष की सतह को कवर करने के लिए पीबीएस (1x) में 0.2% लैमिनिन और 0.2% फाइब्रोनेक्टिन युक्त समाधान के साथ इसे प्रतिस्थापित करें। ढक्कन को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 90% आरएच पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, पीसी ढक्कन पर कोटिंग समाधान रखें और पेट्री डिश को सीलिंग फिल्म के साथ बंद कर दें। उपयोग तक भंडारण के लिए उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- उपयोग करने से पहले, कोटिंग समाधान को हटा दें, और 30 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में हवा में सुखाएं जब तक कि कोटिंग पूरी तरह से सूख न जाए।
- गैसकेट की तैयारी और कोटिंग
नोट: यह खंड वर्णन करता है कि सिलिकॉन गैसकेट में अर्धपारगम्य झिल्ली चिपकाकर गैसकेट कैसे तैयार करें। प्रारंभिक ऑटोक्लेविंग चरण के बाद, गैस्केट्स को कोलेजन या म्यूसिन के साथ लेपित किया जाता है ताकि आंतों के उपकला कोशिकाओं या बैक्टीरिया के आसंजन की अनुमति मिल सके। म्यूसिन-लेपित झिल्ली मानव आंत में मौजूद बलगम बाधा की नकल करती है।- कोलेजन गैसकेट में 1 μm छिद्र आकार पॉली कार्बोनेट झिल्ली और नीचे और शीर्ष सैंडविच गैसकेट के बीच 50 एनएम छिद्र आकार पॉली कार्बोनेट झिल्ली संलग्न करें। प्रारंभिक उपकरण उपकरण चक्र का उपयोग करके संलग्न झिल्ली के साथ गैसकेट को आटोक्लेव करें ( तालिका 3 देखें)।
- झिल्ली को कोट करने के लिए, प्रत्येक गैसकेट को एक बाँझ चौकोर डिश में रखें।
नोट: कोटिंग एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ स्थितियों में की जाती है।- कोलेजन गैसकेट के लिए, झिल्ली में 3 एमएल कोलेजन (50 μg / mL) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
नोट: झिल्ली को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए कोलेजन जोड़ते समय पिपेट टिप के साथ झिल्ली को छूने के लिए सावधान रहें। - म्यूसिन कोटिंग के लिए, सैंडविच गैसकेट को पेट्री डिश में ऊपर की ओर ऊपर की ओर रखें ताकि झिल्ली के शीर्ष पक्ष को 3 एमएल म्यूसिन (0.025 मिलीग्राम / एमएल) के साथ कोट किया जा सके। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गैसकेट को इनक्यूबेट करें।
- कोलेजन गैसकेट के लिए, झिल्ली में 3 एमएल कोलेजन (50 μg / mL) जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन समय के बाद, कोलेजन और म्यूसिन समाधानों को उनके संबंधित गैसकेट्स से अलग करें और 30 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में झिल्ली को हवा से सुखाएं। व्यंजन बंद करें, प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म के साथ सील करें, और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर गैसकेट स्टोर करें।
- ट्यूबिंग असेंबली
नोट: यह खंड वर्णन करता है कि डिवाइस के छिड़काव के लिए ट्यूबिंग को कैसे इकट्ठा करें। असेंबली से पहले, सभी टुकड़ों को आटोक्लेव करें और / या उन लोगों को खरीदें जो बाँझ पैकेज में व्यक्तिगत रूप से पैक किए जाते हैं। सभी घटकों को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखें।- प्रत्येक डिवाइस के लिए तीन ट्यूब लाइनों का उपयोग करें और प्रत्येक ट्यूब लाइन के लिए, पंप ट्यूबिंग लाइन का एक टुकड़ा, लंबी मार्प्रीन टयूबिंग के दो टुकड़े (20 सेमी), छोटे मार्प्रीन टयूबिंग के दो टुकड़े (8 सेमी), बहिर्वाह बोतल के लिए एक 40 मिमी सुई, 250 एमएल इनफ्लो बोतलों के लिए एक 120 मिमी सुई या छोटी प्रवाह बोतलों के लिए 80 मिमी सुई, तीन पुरुष के साथ-साथ सात महिला लुएर टू बार्ब कनेक्टर, तीन लुएर एडाप्टर और दो तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व।
- ऊपर सूचीबद्ध आटोक्लेव और निष्फल घटकों का उपयोग करके बाएं से दाएं ट्यूबिंग लाइनों को इकट्ठा करें (चित्रा 4)।
नोट: प्रत्येक कनेक्शन चरण के बीच 70% इथेनॉल के साथ प्रत्येक घटक स्प्रे करें।
- मीडिया की तैयारी
नोट: यह खंड वर्णन करता है कि डिवाइस में विभिन्न सेल प्रकारों के लिए माध्यम कैसे तैयार किया जाए, साथ ही साथ माध्यम को बाँझ तरीके से सीरम बोतलों में कैसे स्थानांतरित किया जाए।- 10% 0.22 μm फ़िल्टर्ड, गर्मी-निष्क्रिय FBS के साथ पूरक RPMI 1640। GdNF और AA के साथ N2B27 मीडिया को ताजा पूरक करें।
- बाँझ परिस्थितियों में माध्यम को सीरम बोतलों में स्थानांतरित करें। आरपीएमआई 1640 मीडिया के 200 एमएल को 250 एमएल की बोतलों में और 30 एमएल एन 2 बी 27 मीडिया को 50 एमएल बोतलों में स्थानांतरित करें।
- बाद के चरण में जीवाणु माध्यम (आरपीएमआई 1640 + 10% एफबीएस + 5% डी मैन, रोगोसा, और शाप्रे कल्चर माध्यम [एमआरएस]) तैयार करें, क्योंकि यह केवल प्रयोग के अंतिम 24 घंटे के दौरान आवश्यक है।
- बोतलों को सेप्टम, एल्यूमीनियम क्रिम्प और आटोक्लेव के साथ बंद करें।
- मीडिया को स्थानांतरित करने के लिए, एक उपयुक्त डेकैपर (व्यास = 20 मिमी) का उपयोग करके एल्यूमीनियम क्रिम्प को हटा दें। सेप्टम को भी हटा दें। बोतल को छूने के बिना तैयार माध्यम को सीरम बोतलों में सावधानी पूर्वक डालें।
- स्टरलाइज़ करने के लिए, पोर्टेबल बनसेन बर्नर का उपयोग करके बोतल के उद्घाटन को लौएं। 70% इथेनॉल के साथ सेप्टम को स्प्रे करके, इसे बोतल में जोड़कर और सील क्रिम्पर का उपयोग करके एल्यूमीनियम क्रिम्प के साथ बंद करके बोतलों को सील करें।
- इनक्यूबेटर में बंद बोतलों को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें, 24 घंटे के लिए 5% सीओ2 माध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए, साथ ही यह सुनिश्चित करने के लिए कि डिवाइस के लिए मीडिया बोतलों का उपयोग करने से पहले संदूषण के कोई संकेत दिखाई नहीं दे रहे हैं।
3. HuMiX प्रारंभ
- न्यूरोहूमीएक्स असेंबली।
नोट: यह अनुभाग डिवाइस को इकट्ठा करने का तरीका बताता है। संक्षेप में, क्लैंपिंग सिस्टम को निष्फल और कड़ा किया जाता है, जिसके बाद नीचे पीसी ढक्कन को क्लैंप के आधार पर रखा जाता है। फिर, लेपित गैसकेट और शीर्ष पीसी ढक्कन एक दूसरे पर ढेर हो जाते हैं, इसके बाद क्लैंप का शीर्ष भाग होता है। अंत में, गैसकेट्स को संपीड़ित करने और सिस्टम को रिसाव मुक्त और गैसटाइट बनाने के लिए क्लैंप को कस दिया जाता है। चित्र 4 विधानसभा के लिए आवश्यक विभिन्न भागों को दर्शाता है।- असेंबली से पहले क्लैंप और दो पीसी ढक्कन (ऊपर और नीचे) को ऑटोक्लेव करें।
- क्लैंप के शीर्ष और निचले हिस्सों को इकट्ठा करने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्क्रू को कस दें (चित्रा 4 सी, डी)। ऑटोक्लेविंग प्रक्रिया से पहले पेंच खोलें और बाद में उन्हें फिर से कस लें।
- पीसी ढक्कन के कोनों में चार स्क्रू पकड़कर लेपित और सूखे (चरण 2.2.3) नीचे पीसी ढक्कन (चित्रा 4 ए 1) को स्क्वायर पेट्री डिश से क्लैंप आधार के शीर्ष पर स्थानांतरित करें।
नोट: संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए पीसी ढक्कन को छूने से बचें। - बाँझ चिमटी का उपयोग करके पीसी ढक्कन पर उपकला कक्ष गैसकेट को ऊपर (यानी, शीर्ष पर झिल्ली के साथ) रखें। गैसकेट और पीसी ढक्कन को संरेखित करने के लिए स्क्रू का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ढक्कन के कोनों में इनलेट और आउटलेट पोर्ट गैसकेट में उद्घाटन के साथ संरेखित हैं (चित्रा 3)।
- बाँझ चिमटी का उपयोग करके, सैंडविच गैसकेट को कोलेजन गैसकेट के शीर्ष पर रखें, जिसमें शीर्ष पक्ष ऊपर की ओर हो।
- सैंडविच गैसकेट के शीर्ष पर शीर्ष पीसी ढक्कन रखें। संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, केवल ढक्कन के किनारों को छूकर ऐसा करें (ढक्कन के शीर्ष या निचले हिस्से को न छुएं)। सुनिश्चित करें कि क्लैंप ढक्कन पर बार्ब झिल्ली असेंबली पर खुलने वाले इनलेट और आउटलेट के साथ संरेखित होते हैं, और यह कि नीचे पीसी ढक्कन से पेंच शीर्ष पीसी ढक्कन के उद्घाटन में फिट होते हैं।
- डिवाइस को बंद करने के लिए, पीसी ढक्कन के शीर्ष पर क्लैंप ढक्कन (क्लैंप का शीर्ष भाग) रखें। सुनिश्चित करें कि ढक्कन के उद्घाटन शीर्ष पीसी ढक्कन के इनलेट और आउटलेट बार्ब के साथ मेल खाते हैं। कुंडी बंद करें। प्राइमेड टयूबिंग लाइनों (चरण 3.2.6) से कनेक्ट करने के लिए बंद डिवाइस (चित्रा 5) को हुड के नीचे रखें।
- ट्यूबिंग लाइनों की प्राइमिंग।
नोट: यह खंड बताता है कि ट्यूबिंग को इन-और बहिर्वाह बोतलों के साथ-साथ पंप से कैसे जोड़ा जाए, बाद में सफाई और नसबंदी के दौरान उपयोग किए जाने वाले किसी भी अवशिष्ट उत्पादों को हटाने के लिए माध्यम के साथ टयूबिंग को प्राइम करें, और यह सुनिश्चित करें कि टयूबिंग में कोई बुलबुले मौजूद नहीं हैं।- ट्यूबिंग लाइनों की प्राइमिंग जैव सुरक्षा कैबिनेट में की जाती है। प्रत्येक प्रवाह और बहिर्वाह बोतल के सेप्टम में फिल्टर के साथ वातन सुई डालें। साफ, बाँझ चिमटी का उपयोग करके, 250 एमएल सीरम बोतलों में 120 मिमी की सुई डालें। 50 एमएल सीरम बोतलों में 80 मिमी की सुई डालें।
- प्रत्येक ट्यूबिंग लाइन के अंत में 40 मिमी सुइयों को एक बहिर्वाह सीरम बोतल में डालें। प्रति डिवाइस, तीन टयूबिंग लाइनों के लिए दो बहिर्वाह बोतलें हैं। उपकला और न्यूरोनल ट्यूबिंग लाइनों की 40 मिमी सुइयों को मध्यम त्याग के लिए एक ही बहिर्वाह बोतल से जोड़ा जाता है। बैक्टीरियल ट्यूब लाइन दूसरी बहिर्वाह बोतल तक जाती है।
- पंप ट्यूबिंग लाइनों को पंप कैसेट में डालें। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग लाइनों के तीन-तरफा स्टॉपकॉक सभी खुले हैं।
- शुरुआत में, 5 आरपीएम की गति से बहिर्वाह बोतल तक मीडिया को निर्देशित करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप सेट करें ( तालिका 4 देखें)।
नोट: ट्यूबिंग लाइन प्राइमिंग के दौरान, प्रक्रिया को तेज करने के लिए गति को 10 आरपीएम तक बढ़ाया जा सकता है। - स्टार्ट बटन दबाकर पंप शुरू करें और सुनिश्चित करें कि पंपिंग कार्रवाई की दिशा घड़ी की दिशा है। एक बार जब मीडिया बहिर्वाह बोतलों में गिर रहा है, तो सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है और ट्यूबिंग लाइनों और कनेक्शन बिंदुओं में कोई हवा के बुलबुले नहीं बचे हैं। ट्यूबिंग और कनेक्टर को टैप करके या पंप की गति बढ़ाकर किसी भी शेष बुलबुले को हटा दें।
- जब सभी ट्यूब लाइनें बहिर्वाह बोतलों में गिर रही हैं, तो प्रारंभिक डिवाइस को जोड़ने के लिए प्रवाह दर को 2 आरपीएम पर सेट करें।
- डिवाइस की प्राइमिंग
नोट: यह खंड बताता है कि सेल कल्चर माध्यम के साथ डिवाइस को कैसे प्राइम किया जाए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी कक्ष ों को माध्यम से भरा और प्रीकोट किया जाए, ताकि सिस्टम में कोई बुलबुले न बचे और कोशिकाएं टीकाकरण के दौरान आसानी से पालन कर सकें।- डिवाइस की प्राइमिंग बाँझ परिस्थितियों में जैव सुरक्षा कैबिनेट में की जाती है। डिवाइस को कनेक्ट करने के लिए, डिवाइस के निचले कक्ष, न्यूरोनल लाइन को जोड़कर शुरू करें।
- एक लाइन को जोड़ने के लिए, तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व (चित्रा 5 सी) को बंद करें, जो बहिर्वाह पक्ष से पहले शुरू होता है, जहां शॉर्ट टयूबिंग को महिला ल्यूर कनेक्टर से डिस्कनेक्ट कर दिया जाता है और डिवाइस से आउटलेट पोर्ट से जोड़ा जाता है, बारब पर टयूबिंग को धक्का देकर। उचित कनेक्शन सुनिश्चित करने और लीक और / या संदूषण होने की संभावना को कम करने के लिए, सुनिश्चित करें कि टयूबिंग कनेक्टर पर नीचे धकेलकर ढक्कन के संपर्क में है। इनफ्लो ट्यूबिंग को उसी तरह कनेक्ट करें। एक बार जब एक लाइन पूरी तरह से डिवाइस (इनफ्लो और आउटफ्लो) से जुड़ जाती है, तो तीन-तरफा स्टॉपकॉक खोलें।
- उपकला रेखा के साथ पिछले चरण को दोहराएं, और फिर जीवाणु रेखा के साथ। पंप को 2 आरपीएम की प्रवाह दर पर रखें। दबाव निर्माण के कारण रिसाव से बचने के लिए पंप की गति को 2.5 आरपीएम तक बढ़ाएं, लेकिन अधिक नहीं। पंप को डिवाइस में कक्षों को प्राइम करने की अनुमति दें।
- हर समय बहिर्वाह सीरम बोतलों की निगरानी करें। यदि हवा के बुलबुले कक्षों, लाइनों या कनेक्टर में फंस जाते हैं, तो अंदर एक एयर बबल के साथ एक टयूबिंग लाइन बहिर्वाह कक्ष में अब नहीं गिरेगी। हवा के बुलबुले से छुटकारा पाने के लिए, पहले उपकरणों को कुछ मिनटों के लिए चलने दें। यदि यह समस्या हल नहीं होती है, तो बहिर्वाह के तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक को बंद करके थोड़े समय के लिए गिरने वाली अन्य लाइनों में से एक को बंद करें।
- एक बार जब डिवाइस के सभी कक्ष पूरी तरह से प्राइमेड हो जाते हैं-सभी कक्ष सेल कल्चर माध्यम से भरे होते हैं और डिवाइस में कोई बुलबुले नहीं रहते हैं-पंप की गति को 0.5 आरपीएम तक कम करें। डिवाइस अब सेल टीकाकरण के लिए तैयार है।
4. सेल की तैयारी और टीकाकरण
नोट: यह खंड बताता है कि डिवाइस को टीका लगाने के लिए आवश्यक विभिन्न सेल प्रकारों को कैसे तैयार किया जाए, साथ ही उन्हें बाँझ तरीके से और हवा के बुलबुले पेश किए बिना डिवाइस में कैसे टीका लगाया जाए। इसके अलावा, यह वर्णन करता है कि न्यूरोनल कोशिकाओं के लिए मध्यम जलपान कैसे करें, और डिवाइस में बैक्टीरिया संस्कृति के लिए माध्यम कैसे तैयार करें।
- उपकला कोशिकाएं
- ट्रिप्सिन-एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) का उपयोग करके फ्लास्क से काको -2 कोशिकाओं को अलग करें, आरपीएमआई 1640 + 10% एफबीएस में पुन: निलंबित करें, और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परख का उपयोग करके न्यूबाउर सेल काउंटर में गिनती करें। कैको -2 सेल निलंबन (3 मिनट, 300 × ग्राम) को सेंट्रीफ्यूज करें, और शेष ट्रिप्सिन-ईडीटीए को हटाने के लिए सुपरनैटेंट को छोड़ दें। RMPI 1640 + 10% FBS में Caco-2 कोशिकाओं को 350,000 कोशिकाओं / mL का निलंबन प्राप्त करने के लिए पुन: निलंबित करें। प्रत्येक डिवाइस के लिए, 1.5 एमएल की मात्रा की आवश्यकता होती है।
- कैको -2 सेल सस्पेंशन के 1.5 एमएल को एक बाँझ 2 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें और सिरिंज में रहने वाली किसी भी हवा या बुलबुले को हटा दें।
- बैक्टीरियल और न्यूरोनल कक्षों के टयूबिंग के तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व को बंद करें। रोटर से संबंधित टयूबिंग के साथ कैसेट को हटाकर पंप से बैक्टीरिया और न्यूरोनल कक्षों की ट्यूबिंग को डिस्कनेक्ट करें।
- उपकला कक्ष की ओर जाने वाले इनफ्लो ट्यूबिंग के तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व की टोपी खोलें और डिवाइस से 'ओपन कनेक्टर' (चित्रा 5 सी) में मध्यम प्रवाह को पुनर्निर्देशित करने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व को चालू करें। माध्यम को तब तक बहने दें जब तक कि तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व के खुले छोर पर माध्यम की एक बूंद दिखाई न दे।
- हवा के बुलबुले की शुरूआत के बिना कनेक्टर में सिरिंज को सम्मिलित करने की अनुमति देने के लिए ड्रॉप-ड्रॉप कनेक्शन विधि का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं वाले सिरिंज को 'ओपन कनेक्टर' में डालें। प्रवाह बोतल (पंप के माध्यम से) से माध्यम के प्रवाह को रोकने के लिए तीन-तरफा स्टॉपकॉक के वाल्व को चालू करें और जुड़े सिरिंज से प्रारंभिक डिवाइस तक प्रवाह की अनुमति दें। पंप से उपकला चैनल को डिस्कनेक्ट करें।
- सेल निलंबन के साथ उपकला कक्ष को टीका लगाने के लिए धीरे-धीरे सिरिंज दबाएं। सुनिश्चित करें कि बहिर्वाह बोतल में प्रति 3 एस में लगभग एक बूंद गिरती है।
- सेल निलंबन के 1.5 एमएल जोड़ें, फिर बहिर्वाह तीन-तरफा स्टॉपकॉक के वाल्व को बंद करें। सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और टोपी के साथ तीन-तरफा स्टॉपकॉक के खुले छोर को बंद करें। कक्ष को कम से कम 2 घंटे के लिए बंद रखें। इस बीच, न्यूरोनल कोशिकाओं को टीका लगाएं।
- न्यूरोनल कोशिकाएं
- एक पिपेट का उपयोग करके संबंधित कुओं से मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित करके कुएं से न्यूरोनल कोशिकाओं को अलग करें। प्रत्येक डिवाइस को 6-वेल प्लेट के एक कुएं (9.6 सेमी2) से पूरी तरह से कंफ्लुएंट कोशिकाओं के साथ टीका लगाएं।
- सेल गोली को संबंधित N2B27 मध्यम मात्रा (प्रति डिवाइस 1.5 मिलीलीटर मीडिया) + 1 μL फाइब्रोनेक्टिन / एमएल सेल निलंबन में पुन: निलंबित करें। पुन: निलंबित सेल निलंबन के 1.5 एमएल को 2 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें और सिरिंज में रहने वाले किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। भरे हुए सिरिंज को एक बाँझ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें और प्राइमेड HuMiX डिवाइस युक्त जैव सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरित करें।
- ट्यूब लाइन के परिवर्तन को छोड़कर, उपकला कक्ष टीकाकरण के लिए पहले वर्णित समान टीकाकरण प्रक्रिया का पालन करें। यहां, पंप से बैक्टीरिया और उपकला ट्यूब लाइनों को डिस्कनेक्ट करें।
- न्यूरोनल सेल टीकाकरण के बाद, ट्यूब लाइनों के सभी तीन-तरफा स्टॉपकॉक को बंद करें और पंप से डिस्कनेक्ट करें। डिवाइस को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें। कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए सभी चैनलों को बंद रखें।
- 2 घंटे के बाद, बैक्टीरिया और उपकला चैनलों को पंप से कनेक्ट करें और दोनों लाइनों के प्रवाह और बहिर्वाह तीन-तरफा स्टॉपकॉक खोलें। प्रारंभिक डिवाइस चलाने के आने वाले 14 दिनों के दौरान न्यूरोनल चैंबर को बंद रखें, मध्यम परिवर्तन के दौरान।
- 14 दिनों की दौड़ के दौरान, हर 3-4 दिनों में न्यूरोनल कक्ष के माध्यम को बदलें। मध्यम ताज़ा के लिए, प्रति डिवाइस 3 मिलीलीटर ताजा एन 2 बी 27 माध्यम तैयार करें और एक बाँझ 20 एमएल सीरम बोतल में स्थानांतरित करें। एक बाँझ सेप्टम और एक एल्यूमीनियम क्रिम्प सील का उपयोग करके माध्यम से सीरम बोतल को बंद करें।
- नई बोतल के सेप्टम में एक वातन और 80 मिमी सुई डालें। पुरानी मीडिया बोतल को इनक्यूबेटर में नए के साथ बदलें, पुरानी बोतल की सुई से पुरुष ल्यूर को नई बोतल की सुई से डिस्कनेक्ट करके।
- कैसेट को न्यूरोनल चैंबर के पंप ट्यूबिंग के साथ पंप से कनेक्ट करें और तीन-तरफा स्टॉपकॉक खोलें। न्यूरोनल ट्यूबिंग के तीन-तरफा स्टॉपकॉक को बंद करने और पंप से डिस्कनेक्ट करने से पहले मीडिया को 2 घंटे के लिए 0.5 आरपीएम पर बहने दें, अगले मध्यम विनिमय तक।
5. बैक्टीरियल कल्चर और टीकाकरण
नोट: इस अध्ययन में, 12 वें दिन, ग्लिसरॉल स्टॉक से लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी स्ट्रेन एफ 275 की एक तरल संस्कृति को फिर से तैयार किया गया था। जरूरतों या अध्ययन डिजाइनों के आधार पर, अन्य जीवाणु प्रजातियों का उपयोग किया जा सकता है।
- एमआरएस शोरबा के 5 एमएल के साथ तीन ट्यूब तैयार करें- एक बाँझ नियंत्रण ट्यूब और दो एल रेयूटेरी टीकाकरण के लिए। एक टीकाकरण लूप के साथ, ग्लिसरॉल स्टॉक के शीर्ष को खुरचें और इसे एक ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक दूसरे टीकाकरण ट्यूब के साथ दोहराएं। ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस, 170 आरपीएम पर रात भर इनक्यूबेट करें।
नोट: ग्लिसरॉल स्टॉक को पिघलने न दें। - रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) 1640 + 10% एफबीएस को 5% एमआरएस शोरबा के साथ मिलाकर प्रारंभिक उपकरणों के लिए ताजा माध्यम तैयार करें। प्रति डिवाइस 25 एमएल तैयार करें और बाँझ परिस्थितियों में 100 एमएल सीरम बोतलों में स्थानांतरित करें। बोतलों को बाँझ सेप्टम और एल्यूमीनियम क्रिम्प के साथ बंद करें। बोतलों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर रखें।
- बोतलों को बैक्टीरियल ट्यूब लाइन से जोड़ने से पहले, आरपीएमआई 1640 / एमआरएस मीडिया की प्रत्येक बोतल में एक वातन सुई और 80 मिमी सुई जोड़ें।
- नए ट्यूब तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में आरपीएमआई 1640 + 10% एफबीएस + 5% एमआरएस शोरबा का 3 एमएल हो। प्रति डिवाइस कम से कम दो ट्यूब, एक नियंत्रण और एक ट्यूब तैयार करें। नए तैयार ट्यूबों में से दो में एल रियूटेरी ओवरनाइट कल्चर (ऑप्टिकल घनत्व [ओडी] > 2) के 15 μL को टीका लगाएं।
- ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस, 170 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, जिसके बाद 0.05-0.10 का ओडी पहुंच जाता है, जो ~ 1 × 107 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) / एमएल के अनुरूप होता है। 1.5 एमएल को 2 एमएल सिरिंज (प्रति डिवाइस एक) में स्थानांतरित करें। सीएफयू चढ़ाना और जीवित / मृत धुंधलापन के लिए शेष जीवाणु निलंबन का उपयोग करें।
- डिवाइस के जीवाणु टीकाकरण के लिए, चरण 4.1 में उल्लिखित उसी प्रक्रिया का पालन करें, सिवाय इसके कि यहां न्यूरोनल और उपकला ट्यूब लाइनें बंद हैं।
- टीकाकरण के बाद, वाल्व बंद करके और 30 मिनट के लिए पंप से डिस्कनेक्ट करके बैक्टीरियल ट्यूब लाइन को भी बंद करें। उपकला और जीवाणु ट्यूब लाइनों को कनेक्ट करें और फिर से खोलें। उपकरणों को 37 डिग्री सेल्सियस और 0.5 आरपीएम पर एक और 24 घंटे तक चलने दें।
6. HuMiX खोलने और नमूनाकरण
नोट: नीचे दिया गया अनुभाग विभिन्न सेल प्रकारों के नमूने का वर्णन करता है। उदाहरण के लिए, न्यूरोनल सेल छर्रों का उपयोग आरएनए निष्कर्षण और बाद में मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर), डीएनए निष्कर्षण और 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण के लिए बैक्टीरियल छर्रों और एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसेस (ईएलआईएसए) और अन्य परखों (जैसे, लैक्टेट परख) के लिए किया जाता है।
- 14 वें दिन, उद्घाटन के दिन, सभी तीन-तरफा स्टॉपकॉक बंद करें, पंप से टयूबिंग को डिस्कनेक्ट करें, और इनक्यूबेटर के डिवाइस को लैब बेंच पर ले जाएं।
नोट: डिवाइस को स्थानांतरित करते समय, वास्तविक डिवाइस को क्षैतिज रखना सुनिश्चित करें। - धीरे-धीरे क्लैंप खोलने से पहले डिवाइस से जुड़ी ट्यूबिंग लाइनों को हटा दें और क्लैंप ढक्कन को हटा दें। देखभाल के साथ, शीर्ष पीसी ढक्कन को हटा दें, मीडिया को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें, और इसे बर्फ पर रखें।
- उपकला कक्ष से मीडिया एकत्र करते समय धीरे से सैंडविच गैसकेट को हटा दें; सावधान रहें कि सेल परत को न छुएं। सैंडविच गैसकेट को एक चौकोर पेट्री डिश में रखें और एच2ओ में बाँझ 0.9% एनएसीएल समाधान को बैक्टीरिया कक्ष में जोड़ें जब तक कि कक्ष पूरी तरह से कवर न हो जाए (लगभग 1 एमएल)।
- न्यूरोनल कक्ष से मीडिया को इकट्ठा करते समय धीरे-धीरे कोलेजन गैसकेट को हटा दें और इसे माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सभी मीडिया ट्यूबों को बर्फ पर रखें। कोलेजन गैसकेट को एक चौकोर डिश में रखें और धीरे से 1x PBS के कुछ मिलीलीटर को Caco-2 परत में जोड़ें जब तक कि सेल परत पूरी तरह से कवर न हो जाए।
- एक चौकोर पेट्री डिश में नीचे पीसी ढक्कन रखें और धीरे से न्यूरोनल कोशिकाओं के शीर्ष पर लगभग 2 मिलीलीटर 1x पीबीएस जोड़ें, ताकि वे नमूना प्रक्रिया के दौरान सूख न जाएं।
- बैक्टीरियल मीडिया ट्यूब को 5,000 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। उपकला और न्यूरोनल मीडिया ट्यूबों को 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रत्येक ट्यूब के सुपरनैटेंट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और तुरंत इसे सूखी बर्फ पर रखें।
- उपकला कोशिकाएं
- धीरे से पीबीएस को गैसकेट से निकालें और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। कोशिकाओं में 2 एमएल ट्रिप्सिन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 5 मिनट के लिए गैसकेट को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद गैसकेट में आरपीएमआई 1640 के 2 एमएल जोड़ें, कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और एक और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
- 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए दोनों ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। पीबीएस के 300 μL में पीबीएस वॉश से गोली को फिर से निलंबित करें और पीबीएस के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
- स्वचालित सेल काउंटर और ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परख सेल गिनती के लिए प्रत्येक ट्यूब के 50 μL को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पुन: निलंबित सेल गोली (1 एमएल) को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और सेल गोली को 250 μL लाइसिस बफर + 1% बीटा-मर्कैप्टोइथेनॉल में फिर से निलंबित करें और ट्यूब को सूखी बर्फ पर रखें।
- न्यूरोनल कोशिकाएं
- स्क्वायर पेट्री डिश को पिछले चरण (6.5) से एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप तक न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ नीचे, पारदर्शी पीसी ढक्कन के साथ लें।
नोट: इसके शीर्ष पर पीबीएस के साथ पीसी ढक्कन को स्थानांतरित करते समय, बहुत सौम्य रहें, क्योंकि न्यूरोनल नेटवर्क बहुत आसानी से अलग हो जाता है। - ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूरोनल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और सेल घनत्व का अवलोकन करके टीकाकरण से पहले एक अंतिम गुणवत्ता जांच करें। सत्यापित करें कि कोशिकाएं स्फेरॉइड से माइग्रेट हो गई हैं और एक न्यूरोनल नेटवर्क का गठन हुआ है। न्यूरोनल नेटवर्क लगभग 90% कॉन्फ्लुएंट होना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए, फत्ताही एट अल.6 देखें।
- बेंच पर, पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 1.5 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। 3 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, सेल गोली को 250 μL लाइसिस बफर + 1% बीटा-मर्कैप्टोइथेनॉल में फिर से निलंबित करें, और सूखी बर्फ पर रखें।
नोट: पीसी ढक्कन पर न्यूरोनल कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला किया जा सकता है। यदि न्यूरोनल नेटवर्क को नष्ट नहीं करने के लिए आईएफ धुंधला होना पसंदीदा परख है, तो कोशिकाओं को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ पीसी ढक्कन पर तय किया जाना चाहिए, जो भविष्य के प्रयोगों में पीसी ढक्कन के पुन: उपयोग में बाधा डालता है।
- स्क्वायर पेट्री डिश को पिछले चरण (6.5) से एक उल्टे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप तक न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ नीचे, पारदर्शी पीसी ढक्कन के साथ लें।
- बैक्टीरियल कोशिकाएं
- 0.9% NaCl समाधान में झिल्ली से जुड़ी जीवाणु कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। यदि कोशिकाएं मजबूती से जुड़ी हुई हैं, तो झिल्ली से बैक्टीरिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए धीरे से सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
नोट: स्क्रैपर का उपयोग करने से कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है, जिससे अधिक मृत कोशिकाओं को देखने की संभावना बढ़ जाती है। - सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें। पहले एकत्र किए गए मीडिया से बचे हुए गोली को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और सेल गोली को 0.9% NaCl समाधान के 1 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
- इस मात्रा को तीन भागों में विभाजित करें: एक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (650 μL) के लिए एक जीवाणु गोली को फ्रीज करने के लिए, एक MRS प्लेटों पर CFU प्लेटिंग (50 μL) के लिए, और एक जीवित / मृत धुंधला (300 μL) के लिए। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए गोली की तैयारी के लिए, सेल निलंबन को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 5,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। सेल गोली को सूखी बर्फ पर रखें।
- नमूने के अंत में, सूखी बर्फ पर सभी ट्यूबों को बाद में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
नोट: सुपरनैटेंट का उपयोग गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, उद्घाटन के दौरान, कोलेजन-लेपित झिल्ली को अलग-अलग विश्लेषणों के लिए अलग-अलग भागों में विभाजित किया जा सकता है- एक आधा हिस्सा आईएफ ऑक्लुडिन-धुंधला करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, दूसरा हिस्सा आगे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए, और दूसरा हिस्सा सेल गिनती के लिए।
- 0.9% NaCl समाधान में झिल्ली से जुड़ी जीवाणु कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। यदि कोशिकाएं मजबूती से जुड़ी हुई हैं, तो झिल्ली से बैक्टीरिया कोशिकाओं को अलग करने के लिए धीरे से सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
Representative Results
न्यूरोहूमीएक्स में, हमने तीन अलग-अलग सेल प्रकारों को एक साथ सह-सुसंस्कृत किया- बैक्टीरिया, उपकला और न्यूरोनल कोशिकाएं (चित्रा 1)। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं सभी व्यवहार्य थीं, हमने विभिन्न सेल प्रकारों पर अलग-अलग परख की। उदाहरण के लिए, हमने उपकला कोशिकाओं पर जीवाणु कोशिकाओं, सेल गिनती और सेल व्यवहार्यता परख पर सीएफयू गणना की, जबकि न्यूरोनल कोशिकाओं का मूल्यांकन सूक्ष्म विश्लेषण के माध्यम से किया गया।
चित्रा 1: न्यूरोहूमीएक्स और इसके प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ए) तीन कक्षों को बंद रखने के लिए दो पीसी ढक्कन के बीच रखा जाता है। प्रत्येक कक्ष अंदर उगने वाली कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट माध्यम से भरा होता है। विभिन्न कक्षों को अर्ध-पारगम्य झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है जो झिल्ली से गुजरने वाले घुलनशील कारकों के माध्यम से कोशिका संचार की अनुमति देता है। (बी) न्यूरोहूमीएक्स सेटअप का प्रतिनिधित्व। प्रत्येक कक्ष विभिन्न मीडिया बोतलों से जुड़ा हुआ है। बैक्टीरियल चैंबर के लिए, पहले 12.5 दिनों के लिए, चैंबर आरपीएमआई + 10% एफबीएस से जुड़ा होता है, अंतिम 36 घंटे के लिए आरपीएमआई + 10% एफबीएस + 5% एमआरएस में बदलने से पहले। पी/एल/एफ = पॉली एल-ऑर्निथिन/लैमिनिन/फाइब्रोनेक्टिन; आरपीएमआई = रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट सेल कल्चर माध्यम; एमआरएस = डी मैन, रोगोसा, और शापरे संस्कृति माध्यम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह निर्धारित करने के लिए कि क्या कोशिकाएं उचित रूप से जुड़ी थीं, उपकरणों को खोलने पर, हमने कोलेजन-लेपित झिल्ली (चित्रा 6 ए) पर एक सेल परत के गठन का आकलन किया। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डिवाइस में कोशिकाएं व्यवहार्य थीं, एक स्वचालित सेल काउंटर गिनती (चित्रा 6 बी) और एक ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परख सेल गिनती (चित्रा 6 सी) का प्रदर्शन किया गया था। तीन अलग-अलग HuMiX सेटअपों से Caco-2 कोशिकाओं पर परीक्षण किए गए थे: (i) ईएन के साथ संस्कृति में कैको -2, (ii) एल रेयूटेरी के साथ संस्कृति में कैको -2, और (iii) सभी तीन सेल प्रकारों के सह-संस्कृति वाले उपकरण। एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय परीक्षण ने सेल प्रकारों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिया, यह सुझाव देते हुए कि काको -2 कोशिकाएं इन सभी प्रारंभिक डिवाइस सेटअप और इस अध्ययन में परीक्षण की गई स्थितियों में व्यवहार्य रहीं। यह इस तथ्य को रेखांकित करता है कि एल रियूटेरी की सह-संस्कृति के दौरान पहुंचे जीवाणु घनत्व और दो मानव कोशिका प्रकारों का मानव कोशिकाओं पर साइटोटोक्सिक प्रभाव नहीं पड़ता है।
चित्रा 6: कोलेजन-लेपित झिल्ली पर कैको -2 कोशिकाओं का आकलन। (ए) खोलने के बाद कोलेजन-लेपित झिल्ली पर कैको -2 कोशिकाओं की परत। तीर कोलेजन-लेपित झिल्ली को इंगित करता है, जो एक धराशायी सर्कल से घिरा हुआ है। काको -2 कोशिकाएं झिल्ली पर सर्पिल आकार पर बढ़ रही थीं। HuMiX में 14 दिनों के बाद Caco-2 कोशिकाओं की सेल व्यवहार्यता। सेल गणना (बी) स्वचालित सेल काउंटर और (सी) ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण परख सेल गिनती का उपयोग करके प्राप्त की गई थी। प्रारंभिक डिवाइस में विभिन्न संस्कृति सेटअपों से कैको -2 सेल गणना निर्धारित की गई थी: एंटरिक न्यूरॉन्स (ईएनएस) (काले) के साथ सह-संस्कृति, एल रेयूटेरी (नारंगी) के साथ सह-संस्कृति, और डिवाइस में (ईएनएस और एल रेयूटेरी) (नीला)। एक वन-वे एनोवा का प्रदर्शन किया गया था, जिसमें दिखाया गया था कि विभिन्न संस्कृति सेटअप (एक-तरफ़ा एनोवा, पी = 0.1234 [एनएस]; त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि का संकेत देती हैं) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
स्तनधारी कोशिकाओं के साथ एल रियूटेरी को कल्चर करने में सक्षम होने के लिए, हमने पहले डिवाइस में उपयोग के लिए संस्कृति मीडिया को अनुकूलित और अनुकूलित किया। हमने पाया कि आरपीएमआई 1640 (10% एफबीएस के साथ पूरक) में एमआरएस का 5% मिश्रण एल रियूटेरी के विकास के लिए बेहतर रूप से अनुकूल था, जबकि इन परखों में उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी कोशिकाओं के लिए साइटोटोक्सिक नहीं था। इसके बाद, 24 घंटे के लिए डिवाइस में सुसंस्कृत होने पर एल रियूटेरी के विकास का आकलन करने के लिए एक सीएफयू गणना की गई थी। सीएफयू गणना का मूल्यांकन दो अलग-अलग प्रारंभिक डिवाइस सेटअप (चित्रा 7) के लिए किया गया था- एल रियूटेरी डिवाइस में कैको -2 और एल रियूटेरी के साथ सह-संवर्धित था। दोनों सेटअपों में, सीएफयू की गिनती हूमीएक्स इनोकुलम और कटी हुई कोशिकाओं (वन-वे एनोवा, पी = 0.0002) से काफी अलग थी, जो प्रारंभिक डिवाइस के अंदर बैक्टीरिया कोशिकाओं के विकास का संकेत देती है।
चित्र 7: लिमोसिलेक्टोबैसिलस रियूटेरी सीएफयू इनोकुलम (पतला 1: 100,000) और हूमीएक्स में 24 घंटे के बाद। दो अलग-अलग सेटअप: एल रियूटेरी और डिवाइस के साथ सह-संस्कृति में कैको -2 कोशिकाएं। एक तरफा एनोवा इनोकुलम और कटी हुई कोशिकाओं के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर (पी = 0.0002 [***) दिखाता है, जिसका अर्थ है कि बैक्टीरिया हूमीएक्स के अंदर बढ़ रहे हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि को इंगित करती हैं. संक्षेप: सीबी। एचएक्स = कैको -2 बैक्टीरिया HuMiX; nHX = neuroHuMiX। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह आकलन करने के लिए कि क्या डिवाइस के भीतर ईएन की खेती कोशिकाओं के फेनोटाइप को बदल देगी, ईएन की सकल आकृति विज्ञान को उल्टे चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा गया था। इस चरण के दौरान, कंफ्लुएंसी और ईएन आकृति विज्ञान दोनों का आकलन किया गया था। एक कंफ्लुएंट न्यूरोनल नेटवर्क की स्थापना ने संकेत दिया कि कोशिकाएं लेपित डिवाइस के पीसी ढक्कन पर अच्छी तरह से जुड़ी हुई थीं। महत्वपूर्ण रूप से, यह इस धारणा पर प्रकाश डालता है कि वे काको -2 और एल रियूटेरी के साथ सह-संस्कृति में बढ़े। कॉन्फ्लुएंट न्यूरोनल नेटवर्क और गैस्केट-चित्रित सर्पिल के बीच का किनारा स्पष्ट रूप से स्पष्ट था (चित्रा 8)।
चित्रा 8: डिवाइस में संस्कृति के 14 दिनों के बाद एंटरिक न्यूरॉन्स। छवि के बाईं ओर, न्यूरॉन्स सर्पिल पर एक कंफ्लुएंट परत तक बढ़ गए हैं। किनारे, न्यूरोनल परत और कोशिकाओं के बिना अंतरिक्ष के बीच, सर्पिल का किनारा है; 10x, स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: डिवाइस में उपयोग किए जाने वाले ढक्कन। चित्र शीर्ष (बाएं) और नीचे (दाएं) पीसी ढक्कन दिखाते हैं। पीसी ढक्कन का प्रत्येक पक्ष 6.4 सेमी है। संक्षिप्त नाम: पीसी = पॉली कार्बोनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: निचले पीसी ढक्कन पर उपकला कक्ष गैसकेट। नीचे पीसी ढक्कन (बाएं) पर रखे गए उपकला कक्ष गैसकेट का शीर्ष दृश्य, और नीचे का दृश्य (दाएं) नीचे पीसी ढक्कन के इनलेट और आउटलेट के साथ उपकला कक्ष गैसकेट के संरेखण को दर्शाता है। गैसकेट के प्रत्येक तरफ, साथ ही पीसी ढक्कन, 6.4 सेमी मापता है। संक्षिप्त नाम: पीसी = पॉली कार्बोनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: डिवाइस की असेंबली। (ए) HuMiX को इकट्ठा करने के लिए विभिन्न भाग: (1) नीचे पीसी ढक्कन; (2) कोलेजन-लेपित माइक्रोपोरस झिल्ली के साथ गैसकेट, जिसे (1) के शीर्ष पर रखा गया है; (3) बीच में एक श्लेष्म-लेपित नैनोपोरस झिल्ली के साथ सैंडविच गैसकेट और (2) के शीर्ष पर रखा गया; (4) शीर्ष पीसी ढक्कन (3) के शीर्ष पर रखा गया। गैसकेट और पीसी ढक्कन के प्रत्येक पक्ष का माप 6.4 सेमी है। (B) (A) के सभी भागों को एक साथ रखा गया है। (C, D) इकट्ठे डिवाइस-टॉप (बाएं) और साइड (दाएं) दृश्य। सिस्टम को बंद करने के लिए बी को क्लैंपिंग सिस्टम में रखा जाता है। (C) शीर्ष क्लैंप के प्रत्येक पक्ष का माप 8 सेमी है। संक्षिप्त नाम: पीसी = पॉली कार्बोनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: एक कक्ष के लिए ट्यूबिंग लाइन और इकट्ठी ट्यूबिंग लाइन के लिए आवश्यक भाग। (ए) एक ट्यूबिंग लाइन बनाने के लिए विभिन्न भाग: ए. पंप ट्यूबिंग लाइन; ख. तीन-तरफ़ा स्टॉपकॉक; 40 मिमी सुई; 80 मिमी सुई; 120 मिमी सुई; लंबी ट्यूबिंग लाइन (20 सेमी); छोटी ट्यूबिंग लाइन (8 सेमी); एच. पुरुष लुएर; i. महिला लुएर; जे एडाप्टर। (बी) बैक्टीरिया या उपकला कक्ष के लिए इकट्ठी ट्यूबिंग लाइन। न्यूरोनल कक्ष के लिए, 120 मिमी सुई को 80 मिमी सुई में बदलने की आवश्यकता होगी। (सी) तीन-तरफा स्टॉपकॉक वाल्व डिवाइस से मध्यम प्रवाह को 'ओपन कनेक्टर' में पुनर्निर्देशित करने और कक्ष को बंद करने के लिए बदल गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| दिन | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| मीडिया संरचना | 100% E6 | 100% E6 | 75% E6 | 50% E6 | 25% E6 | 100% N2 |
| + LDN | + LDN | 25% N2 | 50% N2 | 75% N2 | + LDN | |
| + SB | + SB | + LDN | + LDN | + LDN | + SB | |
| + CHIR | + SB | + SB | + SB | + CHIR | ||
| + CHIR | + CHIR | + CHIR | + आरए | |||
| + आरए | + आरए | |||||
| अणु | [एकाग्रता] | |||||
| LDN | 100 nM | |||||
| SB | 10 μM | |||||
| CHIR | 3 μM | |||||
| रेटिनोइक एसिड (आरए) | 1 μM |
तालिका 1: मीडिया संरचना।
| मीडिया | घटक (सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध सांद्रता) | वॉल्यूम (mL) |
| N2 मीडिया (50 mL) | DMEM-F12 | 48 |
| एन 2 पूरक | 0.5 | |
| एल-ग्लूटामाइन | 0.5 | |
| पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन | 0.5 | |
| एनईएए | 0.5 | |
| N2B27/ENS मीडिया (50 mL) | न्यूरोबेसल | 48 |
| एन 2 पूरक | 0.5 | |
| एल-ग्लूटामाइन | 0.5 | |
| पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन | 0.5 | |
| B27-A | 0.5 |
तालिका 2: मीडिया व्यंजनों.
| नसबंदी तापमान (°C) | 116 |
| नसबंदी का समय (मिनट) | 20 |
| शुष्क समय (मिनट) | 10 |
| दालों | 3 |
| अंत तापमान (°C) | 99 |
तालिका 3: HuMiX ऑटोक्लेव रन।
| घूर्णन प्रति मिनट (आरपीएम) | औसत प्रवाह दर (μL/min) |
| 0.5 | 13 |
| 2 | 79 |
| 5 | 180 |
तालिका 4: पेरिस्टालिक पंप की प्रवाह दर।
Discussion
अब यह स्थापित हो गया है कि मानव आंत माइक्रोबायोम मेजबान के स्वास्थ्य और बीमारी को प्रभावित करता है। हमारे माइक्रोबायोम के महत्व का सुझाव देने वाले ज्ञान के बावजूद, विशेष रूप से न्यूरोलॉजिकल विकारों जैसे अल्जाइमर या पार्किंसंस रोग 3,13 में, यह काफी हद तक अज्ञात है कि आंत माइक्रोबायोम आंत्र तंत्रिका तंत्र के साथ कैसे बातचीत करता है, और बाद में, मस्तिष्क के साथ।
आंत माइक्रोबायोम और तंत्रिका तंत्र के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिनिधि मॉडल अब तक अनुपलब्ध है। आंत-मस्तिष्क अक्ष के बारे में अध्ययन पारंपरिक रूप से मुराइन मॉडल13 का उपयोग करके किया गया है। चूहे और मनुष्य अपने जीनोमिक अनुक्रमोंका 85% साझा करते हैं, लेकिन मनुष्यों के लिए चूहों की तुलना करते समय विचार करने के लिए महत्वपूर्ण अंतर हैं। आंत के बारे में, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, मनुष्यों की तुलना में, चूहे विशेष रूप से शाकाहारी हैं। नतीजतन, उनके जठरांत्र संबंधी मार्ग लंबाई और विशेषताओं में भिन्न होते हैं, जैसे कि 'गैस्ट्रिक खाली' 14। मुराइन दिमाग भी महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं, जिससे चूहों और मनुष्यों के बीच समग्र संरचना अलग-अलगहोती है। महत्वपूर्ण रूप से, मनुष्यों में तंत्रिका पूर्वजों के लंबे सेल चक्र समय15 हैं। नतीजतन, प्रतिनिधि मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण है जिसमें आंतों और न्यूरोनल कोशिकाओंसहित मानव-व्युत्पन्न कोशिकाएं शामिल हैं। इस संदर्भ में, इन विट्रो मॉडल के माध्यम से अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अनुसंधान का विकास पशु मॉडल का उपयोग करने की आवश्यकता को कम करता है और प्रजनन क्षमता में सुधार करता है।
neuroHuMiX पिछले HuMiX मॉडल9 का एक उन्नत संस्करण है। HuMiX एक आंत-ऑन-ए-चिप मॉडल है जो उपकला और जीवाणु कोशिकाओं के समीपस्थ और प्रतिनिधि सह-संस्कृतियों की अनुमति देता है। सेल-सेल संचार समीपस्थ सह-संस्कृति और अर्धपारगम्य झिल्ली के माध्यम से स्रावित कारकों और मेटाबोलाइट्स के प्रसार के माध्यम से संभव है। हालांकि, मानव आंत पर्यावरण का अध्ययन करने के लिए प्रारंभिक उपकरण की उपयोगिता का विस्तार करने के लिए, एक अतिरिक्त सेल प्रकार की शुरूआत की आवश्यकता होती है। इसे संबोधित करने के लिए, आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएन की शुरूआत के साथ विकसित न्यूरोहूमिक्स, बैक्टीरिया, आंतों के उपकला कोशिकाओं और ईएन के समीपस्थ सह-संस्कृति को सक्षम बनाता है। परिणामी इन विट्रो मॉडल हमें मानव तंत्रिका तंत्र के संबंध में मानव आंत माइक्रोबायोम के बारे में सवालों को संबोधित करने की अनुमति देता है। विभिन्न सेल प्रकारों, विशेष रूप से स्तनधारी कोशिकाओं और बैक्टीरिया की सह-संस्कृतियों को सह-संवर्धन में कई चुनौतियां हैं, जिनमें व्यवहार्यता का नुकसान, खराब आसंजन और संगम में समग्र हानिशामिल है। यहां, हमने दिखाया है कि इस डिवाइस के भीतर, हम सेल व्यवहार्यता को उच्च रखते हुए एक ही प्रणाली के भीतर तीन अलग-अलग सेल प्रकारों को सह-संस्कृति करने में सक्षम हैं।
प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम डिवाइस में प्रवेश करने से पहले न्यूरोनल कोशिकाओं -80% -90% सेल कंफ्लुएंसी और व्यवहार्यता के संयोजन को सुनिश्चित करना है। चूंकि रन के दौरान सेल की वृद्धि का आकलन करना संभव नहीं है, इसलिए यह सुनिश्चित करना अत्यंत महत्वपूर्ण है कि मॉडल में पेश करने से पहले कोशिकाएं अच्छी तरह से बढ़ रही हैं। हालांकि यह एक सीमित कारक हो सकता है, डिवाइस के भीतर देखी गई समग्र व्यवहार्यता और सामंजस्य आम तौर पर उच्च होता है।
डिवाइस को ट्यूबिंग लाइनों के माध्यम से एक पेरिस्टालिक पंप से जोड़ा जाता है। प्रत्येक सेल कक्ष की अपनी विशिष्ट टयूबिंग लाइन होती है। टयूबिंग में एक पंप ट्यूबिंग शामिल है जो माध्यम के छिड़काव के लिए एक पेरिस्टालिक पंप के उपयोग की अनुमति देता है, साथ ही पंप ट्यूबिंग को डिवाइस से जोड़ता है और डिवाइस को बहिर्वाह / अपशिष्ट बोतलों से जोड़ने वाला टयूबिंग करता है। बहिर्वाह माध्यम के टीकाकरण और नमूने की अनुमति देने के लिए डिवाइस से पहले और बाद में सैंपलिंग पोर्ट शामिल किए जाते हैं। प्रत्येक कक्ष को एक अलग माध्यम से जोड़ा जा सकता है, जिससे प्रत्येक व्यक्तिगत सेल प्रकार के लिए सर्वोत्तम संस्कृति की स्थिति हो सकती है। प्रत्येक कक्ष को मध्यम आपूर्ति के लिए विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर खोला या बंद किया जा सकता है। डिवाइस में, न्यूरोनल कक्ष अधिकांश प्रयोग के लिए बंद रहता है, जबकि बैक्टीरिया और उपकला कक्ष हर समय खुले रहते हैं, जिसका अर्थ है कि उन्हें पूरे प्रयोगात्मक रन में ताजा माध्यम मिलता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि माध्यम बिना किसी रुकावट के बह रहा है, ट्यूबिंग, कनेक्टर या डिवाइस में कोई हवा नहीं बची है। इसलिए, पहले प्राइमिंग चरण में उपकरणों को कुछ मिनटों के लिए चलाने देना महत्वपूर्ण है। यह अक्सर समस्या को हल करता है। यदि नहीं, तो गिरने वाली अन्य लाइनों में से एक को बहिर्वाह के तीन-तरफा स्टॉपकॉक को बंद करके थोड़े समय के लिए बंद किया जा सकता है। यह माध्यम को हवा के बुलबुले के साथ लाइन पर पुनर्निर्देशित करता है, इस प्रकार ट्यूबिंग के माध्यम से बुलबुले को बाहर धकेलकर समस्या को हल करता है।
किसी भी सेल कल्चर प्रयोग के लिए, माध्यम एक प्रमुख घटक है, जहां प्रत्येक सेल प्रकार का अपना संबंधित माध्यम होता है। एक सह-संस्कृति सेटअप में, माध्यम को न केवल इसमें बढ़ने वाले सेल प्रकार के लिए, बल्कि सह-संस्कृति के भीतर अन्य सेल प्रकारों के लिए भी संगत होना चाहिए। यह डिवाइस के लिए अलग नहीं है, जो एक अतिरिक्त चुनौती है क्योंकि हमारे पास तीन अलग-अलग सेल प्रकारों के साथ तीन अलग-अलग डिब्बे हैं- बैक्टीरियल, उपकला और न्यूरोनल कोशिकाएं। हालांकि, हमने दिखाया है कि बैक्टीरियल मीडिया को संशोधित करके- 10% एफबीएस के साथ आरपीएमआई 1640 में 5% एमआरएस को जोड़ने के साथ- सभी सेल प्रकार, विशेष रूप से बैक्टीरिया और उपकला कोशिकाओं में, सिस्टम के भीतर सफलतापूर्वक सह-सुसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, डिवाइस में, विभिन्न सेल प्रकार निकटता में सह-सुसंस्कृत होते हैं, और इसलिए एक दूसरे के सीधे संपर्क में नहीं होते हैं। भले ही यह मानव आंत में कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क का पूरी तरह से प्रतिनिधि नहीं है, और इसलिए एक सीमा है, समीपस्थ और प्रतिनिधि सह-संस्कृति स्थिति डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक ताकत है। घुलनशील कारक विभिन्न कक्षों और सेल प्रकारों के बीच आदान-प्रदान करते हैं; इसलिए, कोशिकाएं अभी भी एक दूसरे के साथ बातचीत कर रही हैं। इसके अतिरिक्त, तथ्य यह है कि सेल प्रकारों को अलग से काटा और विश्लेषण किया जा सकता है, हमें विभिन्न सेल प्रकारों (न्यूरोनल कोशिकाओं सहित) पर एक स्वस्थ और / या रोगग्रस्त माइक्रोबायोम के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है और इस तरह सेल प्रकार-विशिष्ट रीड-आउट निर्धारित / एक और सीमा यह है कि प्रयोगात्मक रन के दौरान कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का पालन नहीं किया जा सकता है, क्योंकि डिवाइस को केवल खोला जा सकता है और प्रत्येक प्रयोग के अंत में कोशिकाओं की जांच की जा सकती है।
हमारे ज्ञान के लिए, न्यूरोहूमीएक्स ईएन सहित पहला आंत-ऑन-चिप मॉडल है। यह आंत माइक्रोबायोटा और एंटरिक तंत्रिका तंत्र के बीच संचार को स्पष्ट करने की दिशा में एक कदम है। यह एक मॉडल है जो एक जीवाणु प्रजातियों, एक उपकला परत और ईएन के बीच परस्पर क्रिया की जांच की अनुमति देता है। इसका डिजाइन हमें विभिन्न सेल प्रकारों द्वारा स्रावित घुलनशील कारकों के आदान-प्रदान और एक दूसरे पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है। आगे बढ़ते हुए, डिवाइस को व्यक्तिगत मॉडल में बदलने के लिए न केवल आईपीएससी-व्युत्पन्न ईएन, बल्कि डिवाइस के अंदर आईपीएससी-व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं का होना भी महत्वपूर्ण होगा। महत्वपूर्ण रूप से, इस व्यक्तिगत मॉडल का उपयोग पूर्व, समर्थक और सिंबायोटिक्स10,11 का परीक्षण करने और संभावित रूप से व्यक्तिगत स्क्रीनिंग औरचिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए किया जा सकता है। व्यक्तिगत न्यूरोहूमीएक्स अंततः मानव आंत माइक्रोबायोम के 'डार्क मैटर' और आंत माइक्रोबायोम-तंत्रिका तंत्र अक्ष के साथ तंत्रिका तंत्र के साथ इसकी बातचीत पर प्रकाश डाल सकता है, जिससे चिकित्सीय मूल्यांकन और हस्तक्षेप का मार्ग प्रशस्त होता है।
हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि आंत्र न्यूरोनल सिस्टम सहित आंत-ऑन-ए-चिप रखने में सक्षम होना आंत माइक्रोबायोम-तंत्रिका तंत्र अक्ष के साथ बातचीत के अध्ययन और समझ में प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है। न्यूरोहूमीएक्स हमें मेजबान कोशिकाओं पर जीवाणु प्रजातियों के प्रभावों का अध्ययन करने की अनुमति देता है और हमें मॉडल को और भी अधिक शारीरिक रूप से प्रतिनिधि तरीके से बेहतर बनाने के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करता है।
Disclosures
पी.डब्ल्यू. ने पेटेंट पर एक आविष्कारक के रूप में सूचीबद्ध होने की घोषणा की पीसीटी / ईपी 2013 / 056607, पीसीटी / ईपी 2016 / 062024, पीसीटी / यूएस 2017 / 061602, और पीसीटी / ईपी 2019 / 081424। P.W., C.S., और L.G. पेटेंट LU503075 पर आविष्कारकों के रूप में सूचीबद्ध होने की घोषणा करते हैं।
Acknowledgments
जेरेड स्टर्नकेर्ट हमें K7 लाइन से कोशिकाओं के साथ प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम इंजीनियरिंग पहलुओं के साथ उनकी सहायता के लिए एरिज़ोना विश्वविद्यालय से लंबे समय से सहयोगी डॉ फ्रेडरिक ज़ेनहौसर और मैथ्यू डब्ल्यू बैरेट को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम न्यूरोहूमीएक्स के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व को डिजाइन करने में उनकी मदद के लिए डॉ वैलेंटिना गलाटा को भी स्वीकार करना चाहते हैं। इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता 863664) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से धन प्राप्त हुआ है। चित्रा 1 आंशिक रूप से Biorender.com के साथ बनाया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 10712 | |
| Aeration cannula (length: 1.10 diameter: 30 mm) | VWR (B.Braun) | BRAU4190050 | |
| Agar-agar | Merck Millipore | 1.01614.1000 | |
| Aluminium Crimp | Glasgerätebau Ochs | 102050 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bacterial Cell Membrane, pore size: 1 µm | VWR (Whatman) | 515-2084 | |
| Caco-2 cells | DSMZ | ACC169 | |
| Cell Counter & Analyzer CASY | OMNI Life Sceince | ||
| CHIR | Axon Mechem BV | CT99021 | |
| Collagen I, Rat Tail | Invitrogen | A1048301 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3471 | |
| Difco Lactobacilli MRS Broth | BD Biosciences | 288130 | |
| Discofix 3-way stopcock | B. Braun | BRAU40951111 | |
| DMEM/F12, no glutamine | Thermofisher Scientific | 21331020 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, D-PBS | Sigma Aldrich | 14190-169 | |
| Essential 6 Medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| Essential 8 Medium | Thermofisher Scientific | A1517001 | |
| Female Luer Lock to Barb Connector | Qosina | 11733 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Foetal Bovine Serum, FBS | Thermofisher Scientific | 10500-064 | |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | |
| Human Cell Membrane, pore size: 50 nm | Sigma Aldrich (GE Healthcare) | WHA111703 | |
| HuMiX Gasket Collagen | Auer Precision | 216891-003 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Bottom | Auer Precision | 216891-002 | |
| HuMiX Gasket Sandwich Top | Auer Precision | 216891-001 | |
| iPSC | Max Planck Institute for Molecular Biomedicine | K7 line | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Laminin from Engelbreth-Holmswarm | Sigma Aldrich | L2020 | |
| LDN193189 | Sigma Aldrich | SML0559 | |
| Limosilactobacillus reuteri | ATCC | 23272 | |
| Live/Dead BacLight Bacterial Viability kit | Thermofisher Scientific | L7012 | |
| Male Luer with Spin Lock to Barb | Qosina | 11735 | |
| Marprene tubing (0.8 mm x 1.6 mm) | Watson-Marlow | 902.0008.J16 | |
| Matrigel hESC-qualified matrix | Corning | 354277 | |
| Mucin, from porcine stomach | Sigma Aldrich | T3924 | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEAA | Thermofisher Scientific | 11140050 | |
| Needle (length: 120 mm; diameter: 0.80 mm) | B.Braun (color code: green) | 466 5643 | |
| Needle (length: 40 mm; diameter: 0.70 mm) | Henke Sass Wolf (color code: black) | 4710007040 | |
| Needle (length: 80 mm; diameter: 0.60 mm) | B.Braun (color code: blue) | 466 5635 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| PE/Cy7 anti-human CD49d antibody | Biolegend | 304314 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Peristaltic pump | Watson-Marlow | 205CA | |
| Poly-L-ornithine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | |
| Polycarbonate lids (HuMiX) | University of Arizona | HuMiX 1.0 / 2.0 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | |
| RLT Buffer (RNeasy Minikit) | Qiagen | 74104 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermofisher Scientific | 72400-021 | |
| SB431542, ALK inhibitor | Abcam | ab120163 | |
| Serum bottles | Glasgerätebau Ochs | 102091 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309110 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T3924 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
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