Summary
Vi præsenterer en trin-for-trin protokol til isolering af langsigtede hæmatopoietiske stamceller (LT-HSC'er) og kortsigtede HSC'er (ST-HSC'er) ved hjælp af Hoxb5-reportersystemet.
Abstract
Selvfornyelseskapacitet og multi-lineage differentieringspotentiale betragtes generelt som de definerende egenskaber ved hæmatopoietiske stamceller (HSC'er). Imidlertid har adskillige undersøgelser antydet, at funktionel heterogenitet eksisterer i HSC-rummet. Nylige enkeltcelleanalyser har rapporteret HSC-kloner med forskellige celleskæbner i HSC-rummet, der kaldes partiske HSC-kloner. De mekanismer, der ligger til grund for heterogene eller dårligt reproducerbare resultater, er lidt forstået, især med hensyn til længden af selvfornyelse, når rensede HSC-fraktioner transplanteres ved konventionel immunfarvning. Derfor er det afgørende at etablere en reproducerbar isolationsmetode for langsigtede HSC'er (LT-HSC'er) og kortsigtede HSC'er (ST-HSC'er), defineret ved længden af deres selvfornyelse, for at løse dette problem. Ved hjælp af upartisk flertrinsscreening identificerede vi en transkriptionsfaktor, Hoxb5, som kan være en eksklusiv markør for LT-HSC'er i musens hæmatopoietiske system. Baseret på dette fund etablerede vi en Hoxb5-reportermuselinje og isolerede LT-HSC'er og ST-HSC'er med succes. Her beskriver vi en detaljeret protokol til isolering af LT-HSC'er og ST-HSC'er ved hjælp af Hoxb5-reportersystemet . Denne isolationsmetode vil hjælpe forskere med bedre at forstå mekanismerne for selvfornyelse og det biologiske grundlag for en sådan heterogenitet i HSC-rummet.
Introduction
Hæmatopoietiske stamceller (HSC'er), som har selvfornyelseskapacitet og multipotens, befinder sig øverst i det hæmatopoietiske hierarki 1,2. I 1988 demonstrerede Weissman og kolleger for første gang, at isolering af HSC'er til mus kunne opnås ved hjælp af flowcytometri3. Derefter blev en fraktion defineret af en kombination af celleoverflademarkører, Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, rapporteret at indeholde alle HSC'er i mus 4,5,6,7,8.
Immunofænotypisk definerede (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC'er (herefter pHSC'er) blev tidligere betragtet som funktionelt homogene. Imidlertid har nylige enkeltcelleanalyser afsløret, at pHSC'er stadig udviser heterogenitet med hensyn til deres selvfornyelseskapacitet9,10 og multipotens11,12. Specifikt synes der at eksistere to populationer i pHSC-fraktionen med hensyn til deres selvfornyelseskapacitet: langsigtede hæmatopoietiske stamceller (LT-HSC'er), som har kontinuerlig selvfornyelseskapacitet, og kortvarige hæmatopoietiske stamceller (ST-HSC'er), som har forbigående selvfornyelseskapacitet 9,10.
Til dato er de molekylære mekanismer for selvfornyelseskapacitet, der adskiller LT-HSC'er og ST-HSC'er, stadig dårligt forstået. Det er afgørende at isolere begge cellepopulationer baseret på deres selvfornyelseskapacitet og at opdage underliggende molekylære mekanismer. Flere reportersystemer er også blevet introduceret til rensning af LT-HSC'er13,14,15; LT-HSC-renheden, der er defineret af hvert rapporteringssystem, er imidlertid variabel, og eksklusiv LT-HSC-rensning er endnu ikke opnået.
Derfor vil udviklingen af et isolationssystem for LT-HSC'er og ST-HSC'er fremskynde forskningen vedrørende selvfornyelseskapacitet i pHSC-fraktionen. I isolationen af LT-HSC'er og ST-HSC'er identificerede en undersøgelse ved hjælp af multi-step, upartisk screening et enkelt gen, Hoxb5, der heterogent udtrykkes i pHSC fraktion16. Derudover afslørede knoglemarvsanalyse af Hoxb5-reportermusene, at ca. 20% -25% af pHSC-fraktionen består af Hoxb5 pos-celler. Et konkurrencedygtigt transplantationsassay ved hjælp af Hoxb5 pos pHSC'er og Hoxb5 neg pHSC'er afslørede, at kun Hoxb5pos pHSC'er har langsigtet selvfornyelseskapacitet, mens Hoxb5 neg pHSC'er mister deres selvfornyelseskapacitet inden for en kort periode, hvilket indikerer, at Hoxb5 identificerer LT-HSC'er i pHSC-fraktion16.
Her demonstrerer vi en trinvis protokol til isolering af LT-HSC'er og ST-HSC'er ved hjælp af Hoxb5-reportersystemet . Derudover præsenterer vi et konkurrencedygtigt transplantationsassay for at vurdere selvfornyelseskapaciteten for Hoxb5pos/neg pHSC'er (figur 1). Dette Hoxb5-rapporteringssystem giver os mulighed for fremadrettet at isolere LT-HSC'er og ST-HSC'er og bidrager til forståelsen af LT-HSC-specifikke egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne dyreforsøg blev godkendt af RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Forkonditionering af recipientmusene
- Forbered C57BL/6 kongene hanmus i alderen 8-10 uger som modtagermus. Antallet af modtagermus afhænger af den eksperimentelle protokol. Vi forbereder typisk 10-20 mus til hver tilstand.
- Foder musene med steriliseret vand suppleret med enrofloxacin (170 mg/l). Da bestrålede recipientmus er meget modtagelige for infektion, skal burene holdes så rene som muligt.
BEMÆRK: Tilskud med antibiotika starter 24 timer før bestrålingen og fortsætter i 3 uger efter transplantation for at undgå infektioner.
- Foder musene med steriliseret vand suppleret med enrofloxacin (170 mg/l). Da bestrålede recipientmus er meget modtagelige for infektion, skal burene holdes så rene som muligt.
- Bestråling af kroppen i alt
- Total kropsbestråling ødelægger modtagerens knoglemarvsceller for at sikre indkapsling af donorcellerne. Overfør modtagermusene til et bestrålingsbur. Lethally bestråle modtagermusene med en enkeltdosis på 8,7 Gy 12-16 timer før transplantation.
BEMÆRK: Strålingsdosis og -tid kan variere afhængigt af udstyret. Den dødelige strålingsdosis skal bekræftes med forskerens bestråler og musestamme. - Sæt dem tilbage i deres bure efter den samlede kropsbestråling.
- Total kropsbestråling ødelægger modtagerens knoglemarvsceller for at sikre indkapsling af donorcellerne. Overfør modtagermusene til et bestrålingsbur. Lethally bestråle modtagermusene med en enkeltdosis på 8,7 Gy 12-16 timer før transplantation.
2. Indsamling af donorknoglemarvsceller
- Forbered en hanmus af typen Hoxb5-tri-mCherry i alderen 12 uger, og aflive musen ved CO2 eksponering efterfulgt af cervikal dislokation eller ved hjælp af metoder, der er godkendt af den lokale dyreetiske komité.
BEMÆRK: Reagensvolumen pr. mus er beskrevet i følgende trin. - Under sterile forhold skal du fjerne huden og udsætte knoglerne (lårben, tibia, bækken, humerus). Skær de store muskler, og tag knoglerne (lårben, skinneben, bækken, humerus) fra musen. Placer dem i sterile cellekulturskåle med Ca 2+- og Mg2+-fri, iskold PBS.
- Trim muskler og fibrøst væv fra knoglerne ved hjælp af pincet, lille saks og klud for at forhindre forurening. Pas på ikke at bryde knoglerne under dette trin. Kassér eventuelle brækkede knogler for at opretholde sterilitet.
- Steriliser en morter og støderi med 70% ethanol (EtOH), og lad dem tørre helt. Ligevægt med cellefarvningsbuffer (Ca 2+- og Mg2+-fri PBS suppleret med 2% varmeinaktiveret FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin).
- Sæt knoglerne i mørtel, og tilsæt 3 ml cellefarvningsbuffer. Knus knoglerne åbne med støderen. Opdel celleklumperne ved forsigtig pipettering, og overfør cellesuspensionen gennem en 100 μm cellesi til et 50 ml rør.
- Gentag trin 2.5, indtil opløsningen bliver klar. Normalt er tre gange nok.
3. Adskillelse af c-kit + celler ved magnetisk sortering
- Antistoffarvning til magnetisk sortering
- Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes i 1 ml cellefarvningsbuffer. Der tilsættes 10 μL rotte-IgG (5 mg/ml) for at reducere ikke-specifik antistofbinding, og pipetter forsigtigt op og ned med en P1.000-pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Der tilsættes c-Kit-antistoffet (klon 2B8) i en koncentration på 4 μg/ml, og blandes med en P1.000-pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Tilsæt 5 ml cellefarvningsbuffer, og bland godt. Prøverne centrifugeres ved 400 x g, 4 °C, 5 min. Supernatanten suges op, og pelletsen opslæmmes igen i 500 μL cellefarvningsbuffer.
- Tilsæt 35 μL anti-APC-mikroperler for at berige c-Kit+ -cellerne, og bland med en P1.000-pipette. Inkuber på is i 15 min.
- Tilsæt 4-5 ml cellefarvningsbuffer. Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes i 1 ml cellefarvningsbuffer.
- Sortering af c-Kit+ cellerne magnetisk
- Følg producentens anvisninger for at sortere cellerne. Kort sagt, prime en magnetisk sorteringskolonne med 3 ml cellefarvningsbuffer. Prøven (1 ml) filtreres gennem en 40 μm cellesi, og prøven lægges på den magnetiske sorteringskolonne.
- Vask ved at tilsætte 3 ml cellefarvningsbuffer tre gange. Tilføj kun cellefarvningsbufferen, når kolonnebeholderen er tom.
- Sæt den magnetiske sorteringskolonne oven på et iskoldt 15 ml rør, og tilsæt 5 ml cellefarvningsbuffer. Skyl cellerne ud ved at trykke stemplet hårdt ind i søjlen. Hold gennemstrømningen på is.
BEMÆRK: I tilfælde af utilsigtet prøvetab beholder vi gennemstrømningen indtil eksperimentets afslutning.
4. Hæmatopoietisk stamcellefarvning
- Prøven fremstillet i trin 3.2.3 centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Opsug supernatanten.
- Der tilsættes CD34-antistoffet (klon RAM34) i en koncentration på 50 μg/ml til pelleten, og inkuberes på is i 60 minutter.
BEMÆRK: Forberedelse af støttecellerne i løbet af den første time af inkubation med CD34 anbefales for at forkorte behandlingstiden. - Forbered antistofmasterblandingen i henhold til tabel 1. Der tilsættes 100 μL af masterblandingen til prøven, og der inkuberes på is i 30 minutter. Antistoffet mod CD34-antigenet (klon; RAM34) kræver 90 min for tilstrækkelig farvning.
- Tilsæt 4-5 ml cellefarvningsbuffer. Prøven centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Opsug supernatanten. Tilsæt streptavidin-BUV737 i en koncentration på 3 μg/ml til pelleten, og inkuber på is i 30 min.
- Tilsæt 4-5 ml cellefarvningsbuffer. Prøven centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter. Supernatanten suges op, og pelletsen resuspenderes i 400 μL cellefarvningsbuffer. Opbevar prøven på is.
5. Understøttende celleforberedelse
- Forbered en CD45.1+ CD45.2+ kongen mus på 12 uger gammel; Ideelt set bør dette være samme alder som donormusen. Aflive musen ved CO2 eksponering efterfulgt af cervikal dislokation eller ved hjælp af metoder, der er godkendt af den lokale dyreetiske komité.
BEMÆRK: I det medfølgende eksempel blev CD45.1+ CD45.2+ kongene mus opdrættet internt ved at krydse B6. CD45.1 kongene mus med C57BL/6J mus16. - Under sterile forhold skal du tage både lårben og skinneben og placere dem i sterile cellekulturskåle med Ca 2+- og Mg2+-fri, iskold PBS. Trim musklerne og fibrøst væv fra knoglerne ved hjælp af pincet og lille saks.
- Skær begge ender af knoglerne med skarp, steril saks. Brug en 23 G kanyle og en 5 ml sprøjte fyldt med iskold cellesuspensionsbuffer (Ca 2+- og Mg2+-fri PBS suppleret med 2% varmeinaktiveret FBS, 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin) til at skylle knoglemarven ud i en steril cellekulturskål med cellesuspensionsbuffer. Opdel celleklumperne ved forsigtig pipettering.
- Cellesuspensionen filtreres gennem en 40 μm cellesi ved hjælp af en P1.000-pipette. Cellenummeret på cellesuspensionen tælles ved hjælp af et hæmocytometer, og der fremstilles en knoglemarvscellesuspension indeholdende 1 x 106 celler/ml.
- Overfør 200 μL af knoglemarvscellesuspensionen (2 x 105 celler) til en 96-brønds, rundbundet plade. Opbevares på is indtil brug.
BEMÆRK: Rundbundede plader anbefales for nem celleopsamling.
6. Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Gating opsætning
- 400 μL af prøven fremstillet i trin 4.5 overføres til et rundbundet polystyrenreagensglas med en 35 μm cellesi-snaphætte. Forbered farvningsreagens med døde celler, og tilsæt det til prøven før analysen i henhold til producentens anvisninger.
- Tænd for et flowcytometer, og start analysesoftwaren i henhold til producentens anvisninger. Tryk derefter på Indlæs, og hent dataene.
BEMÆRK: Et flowcytometer udstyret med fem lasere og en 70 μm dyse anbefales for at forbedre renheden af de sorterede celler. - Efter at have ekskluderet dubletter, døde celler og afstamningspositive celler, skal du gate Lineage-c-Kit+Sca-1+-fraktionen. Derefter skal du lukke Flk2+-fraktionen ud. Derefter gate Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC'er i CD150+CD34−/low-fraktionen (figur 2). Udfør kompensation for spektraloverlapningen i det første eksperiment.
BEMÆRK: Hoxb5-positive celler forventes at repræsentere 20% -25% af Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34-/lav Flk2-fraktion.
- Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC sortering
- Forbered et 1,5 ml lavproteinbindingsrør med 600 μL Ca 2+- og Mg2+-fri PBS suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS.
- Indstil det 1,5 ml lavproteinbindende rør på en sorteringsopsamlingsenhed, og sorter Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC'erne i 1,5 ml røret ved hjælp af gating-strategien i trin 6.1.3. I den første sortering skal du bruge udbyttet fra sorteringspræcisionstilstanden.
- Sæt 96-brøndpladen med støttecellerne forberedt i trin 5.5 på ACDU-trinnet (automated cell deposition unit). Det 1,5 ml lavproteinbindingsrør, der er fremstillet i trin 6.2.2, indstilles til påfyldningsporten på et flowcytometer.
- Sorter Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC'erne i en 96-brønds plade med støttecellerne ved hjælp af gating-strategien i trin 6.1.3. Sorter 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC'er for at teste deres evne til selvfornyelse.
BEMÆRK: Dobbeltsortering anbefales for at forbedre renheden. I den anden sortering skal du bruge renhed som den anbefalede sorteringspræcisionstilstand. - Typisk høstes 500-1.000 Hoxb5pos pHSC'er og 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSC'er efter dobbeltsortering. Fortsæt med transplantationsprocedurerne så hurtigt som muligt efter HSC-sorteringen for at forbedre cellelevedygtigheden (ideelt inden for 1-2 timer).
7. Transplantation
- Den HSC-sorterede plade med 96 brønde, der er forberedt i trin 6.2.4, lægges på is. Håndter den HSC-sorterede 96-brønds plade under sterile forhold, ideelt set i en cellehætte.
- Bedøv en modtagermus med 2% isofluran i et gasanæstesiinduktionskammer. Når dyret er fuldt bedøvet, skal du fjerne det og placere det på sin side. For at sikre tilstrækkelig anæstesi skal du bekræfte ingen bevægelse som reaktion på en skadelig stimulus.
- Efter bekræftelse af korrekt anæstesi skal du udføre en retro-orbital injektion så hurtigt som muligt for at forhindre musen i at genvinde bevidstheden. Den retro-orbitale injektion tager mindre end 30 s.
BEMÆRK: Da injektionstiden er kort, afslutter vi proceduren uden at anvende oftalmisk salve i øjnene. Men hvis proceduren tager længere tid, anbefaler vi brug af oftalmisk salve. - Pipetter forsigtigt cellerne i den HSC-sorterede plade med 96 brønde for at blande dem. Donorcellerne samles i sorteringspladen ved hjælp af en 30 G insulinsprøjte, og injicer dem i retroorbital venøs plexus hos modtagermusene. Det anbefalede injicerbare volumen er ≤200 μL.
- Observer, indtil musene er ved bevidsthed og bevæger sig rundt i et rent bur. Returner dem til deres bur efter at have bekræftet deres opsving.
8. Perifer blodanalyse
- Opsaml 50 μL perifert blod fra halevenen, og resuspender det med 100 μL Ca 2+- og Mg2+-fri PBS med 2 mM EDTA. Overfør alle prøverne til en plade med 96 brønde. Der centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 min., og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 200 μL røde blodlegemer lysisbuffer, og inkuber på is i 3 min. Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og supernatanten kasseres. Gentag endnu en gang.
- Tilsæt 200 μL cellefarvningsbuffer. Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og supernatanten kasseres.
- Forbered antistofmasterblandingen i henhold til tabel 2. Tilsæt 50 μL antistofmasterblanding, og inkuber på is i 30 minutter.
- Tilsæt 150 μL cellefarvningsbuffer. Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og supernatanten kasseres.
- Tilsæt 200 μL cellefarvningsbuffer. Prøverne centrifugeres ved 400 x g og 4 °C i 5 minutter, og supernatanten kasseres. Resuspender i 200 μL cellefarvningsbuffer, og tilsæt døde cellefarvningsreagens før analysen i henhold til producentens anvisninger.
- Analyser perifer blodkimærisme ved hjælp af et flowcytometer som beskrevet tidligere16. Indsamle blod 4 uger, 8 uger, 12 uger og 16 uger efter transplantation for at følge multi-lineage rekonstitution. Repræsentative flowcytometriplots er angivet i figur 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere er selvfornyelseskapaciteten blevet målt ved hjælp af kompetitive transplantationsanalyser, hvor donor-HSC'er menes kun at bevare deres selvfornyelseskapacitet, hvis der observeres donorceller med flere afstamninger i modtagerens perifere blod17. Derudover definerer flere rapporter LT-HSC'er som celler, der fortsætter med at producere perifere blodlegemer flere måneder efter den anden knoglemarvstransplantation10,18. For at sammenligne deres evne til selvfornyelse blev 10 Hoxb5pos eller Hoxb5neg pHSC'er isoleret fra Hoxb5 reportermus transplanteret til dødeligt bestrålede primære modtagermus med 2 x 105 hele knoglemarvsceller. 16 uger efter den primære transplantation blev 1 x 107 knoglemarvsceller isoleret fra de primære recipientmus transplanteret til dødeligt bestrålede sekundære recipientmus for at vurdere den langsigtede selvfornyelseskapacitet (figur 1). Figur 2 viser repræsentative flowcytometriplots af knoglemarvsanalysen af Hoxb5-tri-mCherry-musene. Ca. 20%-25% af cellerne i pHSC-fraktionen defineret af Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2− var Hoxb5pos pHSC'er, som kun tegner sig for 0,001%-0,00125% af museknoglemarven. Figur 3 viser repræsentative flowcytometriplots for den perifere blodanalyse i modtagermusene. CD45.2-donormusene (Hoxb5-tri-mCherry-mus), CD45.1/CD45.2-støtteceller og CD45.1-modtagermusene blev forberedt på henholdsvis separat at analysere donor-, støtte- og modtagercellerne.
Figur 4 viser perifere blodanalyser hos modtagermusene 4 uger, 8 uger, 12 uger og 16 uger efter transplantation for at bekræfte donorkimærisme. Disse analyser afslørede, at selvom Hoxb5 pos og Hoxb5neg pHSC'er præsenterer lignende donorkimærisme 4 uger efter transplantation, blev kontinuerlig hæmatopoiesis kun observeret hos Hoxb5pos pHSC-modtagere (figur 4A, B). På den anden side begyndte Hoxb5neg HSC'er at miste evnen til at producere hæmatopoietiske celler 8 uger efter transplantation (figur 4A, B). I den sekundære transplantationsanalyse var det kun Hoxb5pos pHSC-modtagerne, der udviste robust hæmatopoiesis (figur 5A,B). I modsætning hertil blev donorceller næsten ikke observeret i Hoxb5 neg pHSC-modtagermus, hvilket tyder på, at Hoxb5neg pHSC'er mister deres selvfornyelsesevne inden for 16 uger efter transplantation i primære modtagermus. Disse data viser, at Hoxb5-udtryk kan bruges som en specifik markør for LT-HSC'er.
Figur 1: Eksperimentelt skematisk for langsigtede hæmatopoietiske rekonstitutionsassays. Modtagermusene blev dødeligt bestrålet og konkurrencetransplanteret med 10 HSC'er og 2 x 105 hele knoglemarvsceller (støtteceller). Til sekundære transplantationer blev 1 x 107 hele knoglemarvsceller overført fra de primære recipientmus. Forkortelser: PB = perifert blod; WBM = hele knoglemarven. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gating strategi til sortering Hoxb5pos og Hoxb5neg pHSC'er. Repræsentativ flowcytometri gating for at isolere LKS, Flk2−, pHSC, Hoxb5pos og Hoxb5neg pHSC'er efter udelukkelse af dubletter og døde celler. Værdierne angiver procentdelen af hver brøkdel ± s.d. (n = 3). Slægterne omfatter B220, CD3ε, CD4, CD8a, Gr-1 og Ter-119. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative FACS-plots af perifert blod i en modtagermus. Gating skema til identifikation af perifere blodlegemer (NK-celle, granulocyt, monocyt, T-celle og B-celle) i en modtagermus efter udelukkelse af dubletter og døde celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kimærisme hos recipientmus efter primær transplantation. (A) Procentvis kimærisme efter 4 uger, 8 uger, 12 uger og 16 uger hos primære modtagere, der modtager 10 Hoxb5neg (n = 9), Hoxb5lo (n = 13) eller Hoxb5hi (n = 18) pHSC'er. Hver kolonne repræsenterer en individuel mus. Hoxb5hi-fraktionen blev defineret som de øverste 5% af Hoxb5-udtrykket og andre som Hoxb5 lo-brøken. (B) Det gennemsnitlige donorafstamningsbidrag i 10 cellede primære transplantationer. Fejlbjælkerne angiver s.d. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Chimerisme hos recipientmusene efter sekundærtransplantationen. (A) Procentvis kimærisme efter 4 uger, 8 uger, 12 uger og 16 uger efter sekundærtransplantationen af hele knoglemarven. (B) Individuel donorkimærisme efter afstamning hos sekundære modtagere af hele knoglemarven. Hver linje repræsenterer en individuel mus. Dette tal er blevet ændret fra Chen et al.16. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof | Klon | Koncentration | Fluorkromer |
| Flk-2 | A2-F10 | 4 μg/ml | PerCP/eFlour710 |
| CD150 | TC15-12F12.2 | 4 μg/ml | BV421 |
| CD11b | M1/70 | 4 μg/ml | BV711 |
| SCA-1 | D7 | 4 μg/ml | BUV395 |
| CD16/32 | 93 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD127 | A7R34 | 4 μg/ml | A-700 |
| CD3ε | 145-2C11 | 10 μg/ml | Biotin |
| CD4 | GK1,5 | 10 μg/ml | Biotin |
| CD8a | 53-6.7 | 10 μg/ml | Biotin |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 10 μg/ml | Biotin |
| B220 | RA3-6B2 | 10 μg/ml | Biotin |
| Ter119 | TER119 | 10 μg/ml | Biotin |
Tabel 1: Antistofmasterblanding til hæmatopoietisk stamcellefarvning.
| Antistof | Klon | Koncentration | Fluorkromer |
| CD45.1 | A20 | 1 μg/ml | FITC |
| CD45.2 | 104 | 1 μg/ml | PE |
| Gr-1 | RB6-8C5 | 2,5 μg/ml | A700 |
| NK1,1 | PK136 | 1 μg/ml | PerCP-cyanin5,5 |
| CD11b | M1/70 | 1 μg/ml | BUV395 |
| CD3ε | 145-2C11 | 1 μg/ml | BV421 |
| TCRβ | H57-597 | 1 μg/ml | BV421 |
| B220 | RA3-6B2 | 1 μg/ml | BV786 |
Tabel 2: Antistofmasterblanding til farvning af perifere blodlegemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traditionelt er celleoverflademarkørdefinerede HSC'er blevet forberedt til at studere HSC'ernes funktioner, såsom selvfornyelseskapacitet og multistyrke 19,20,21. Den immunofænotypisk definerede HSC-fraktion (Lineage-c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) indeholder imidlertid to diskrete HSC-populationer: LT-HSC'er og ST-HSC'er 9,10. Derfor er den specifikke analyse af bonafide HSC'er, LT-HSC'er, endnu ikke opnået. Derfor vil en isolationsmetode for LT-HSC'er ved hjælp af Hoxb5-reportersystemet betydeligt gavne søgningen efter de molekylære mekanismer for selvfornyelseskapacitet.
Her vil vi diskutere kritiske trin i denne protokol. Først skal trin 1 til trin 7 udføres uden afbrydelse. Disse trin tager normalt 9-12 timer, og det er vigtigt at holde prøverne ved 4 °C under disse procedurer så meget som muligt for at opretholde prøvens levedygtighed. Derefter høstes ca. 1 x 108 knoglemarvsceller fra en mus. Således skal vi bruge et tilstrækkeligt volumen antistoffer for at reproducere farvningsydelsen. Derudover er antistoffet til CD34-antigenet (klon; RAM34) kræver 90 min for tilstrækkelig farvning, mens 30 min er nok for andre antistoffer. For det andet forårsager bestråling normalt pancytopeni hos modtagermusene. Hvis modtagerafledte neutrofiler vedvarer i mange modtagermus, indikerer dette, at strålingsdosis var utilstrækkelig. I et sådant tilfælde anbefales optimering af strålingsdosis. For det tredje, hvis de fleste mus dør kort efter transplantationen, er der to mulige forklaringer: et utilstrækkeligt antal støtteceller eller mislykket retro-orbital injektion.
I årtier har det været kontroversielt, om den bonafide HSC-fraktion er homogen eller heterogen22,23,24. I denne undersøgelse præsenterede modtagermusene, der modtog Hoxb5pos pHSC-transplantationen, forskellige donorkimærer og differentieringsmønstre (figur 4A), hvilket indikerer, at denne fraktion kunne være heterogen. Disse udsving kan imidlertid skyldes både brugen af urensede knoglemarvsceller som støtteceller og de forskellige radiofølsomheder hos individuelle mus25.
Sammenfattende har vi demonstreret en trinvis protokol til isolering af LT-HSC'er og ST-HSC'er ved hjælp af Hoxb5-reportersystemet. Hidtil har påvisningen af LT-HSC'er været afhængig af det konkurrencedygtige transplantationsassay, hvilket kræver mere end 8 måneder. I modsætning hertil giver Hoxb5-reportersystemet os mulighed for at identificere både LT-HSC'er og ST-HSC'er prospektivt og bruge dem til forskellige funktionelle analyser. Figur 4 og figur 5 viser også, at Hoxb5-ekspressionsniveauet synes at være korreleret med graden af donorkimærisme hos de anden modtagermus. Derudover har vi ved at drage fordel af Hoxb5-reportersystemet tidligere afsløret, at LT-HSC'er og ST-HSC'er fungerer på en komplementær måde til kontinuerlig hæmatopoietisk rekonstitution efter hæmatopoietisk stamcelletransplantation26. Desuden demonstrerede vi, at eksogen Hoxb5-ekspression delvist kunne vende celleskæbnen for ST-HSC'er til LT-HSC'er, hvilket indikerer, at tilstedeværelsen eller fraværet af Hoxb5 forklarer heterogeniteten af selvfornyelsesevne i celleoverflademarkørdefineret HSC fraktion27.
Ud over disse fund giver den potentielle isolering af LT-HSC'er os mulighed for at analysere LT-HSC'er under forskellige fysiologiske forhold, såsom aldring, betændelse og så videre. Disse analyser vil i høj grad lette forståelsen af LT-HSC'ernes funktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter forbundet med denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi anerkender taknemmeligt Hiroshi Kiyonari for dyrepleje og for at levere modtagermus på RIKEN BDR samt Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka og Masaki Miyahashi til laboratorieledelse ved Kobe University. Forfatterne sætter også stor pris på den løbende støtte til dette arbejde. Masanori Miyanishi blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 og JP20H03268, Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders og AMED-PRIME, AMED under bevillingsnummer JP18gm6110020. Taro Sakamaki er støttet af JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 og JP22K16334 og blev støttet af JSPS Core-to-Core Program og RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi blev støttet af JSPS bevillingsnummer KAKENHI JP18J13408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL Strip of 8 Tubes, Dome Cap | SSIbio | 3230-00 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 µm Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| 30G insulin syringe | BD | 326668 | |
| 40 µm Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | FALCON | 352235 | |
| 7-AAD Viability Staining Solution | BioLegend | 420404 | |
| 96 well U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspirator with trap flask | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotin (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6.CD45.1 congenic mice | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II special order system | BD | N/A | |
| Brilliant stain buffer | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotin (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotin (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 congenic mice | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotin (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotin (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Centrifuge Tube 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Centrifuge Tube 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) without Ca and Mg, liquid | Nacalai | 14249-24 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo version 10 | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mCherry mice (C57BL/6J background) | N/A | N/A | Bred in our Laboratory |
| IgG from rat serum, technical grade, >=80% (SDS-PAGE), buffered aqueous solution | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurane | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| LS Columns | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Lysis buffer | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Microplate for Tissue Culture (For Adhesion Cell) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| MidiMACS Separator | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Mouse Pie Cages | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Multipurpose refrigerated Centrifuge | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | nacalai | 26253-84 | |
| Porcelain Mortar φ120mm with Pestle | Asone | 6-549-03 | |
| Protein LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Stainless steel scalpel blade | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Restrainer for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotin (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Concentric Luer-Slip Syringe | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Hypodermic Needle 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
References
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241 (4861), 58-62 (1988).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Ikuta, K., Weissman, I. L. Evidence that hematopoietic stem cells express mouse c-kit but do not depend on steel factor for their generation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (4), 1502-1506 (1992).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Christensen, J. L., Weissman, I. L. Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1 (8), 661-673 (1994).
- Spangrude, G. J., Brooks, D. M., Tumas, D. B. Long-term repopulation of irradiated mice with limiting numbers of purified hematopoietic stem cells: In vivo expansion of stem cell phenotype but not function. Blood. 85 (4), 1006-1016 (1995).
- Dykstra, B., Olthof, S., Schreuder, J., Ritsema, M., de Haan, G. Clonal analysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoietic stem cells. Journal of Experimental Medicine. 208 (13), 2691-2703 (2011).
- Grover, A., et al. Single-cell RNA sequencing reveals molecular and functional platelet bias of aged haematopoietic stem cells. Nature Communications. 7, 11075 (2016).
- Kataoka, K., et al. Evi1 is essential for hematopoietic stem cell self-renewal, and its expression marks hematopoietic cells with long-term multilineage repopulating activity. Journal of Experimental Medicine. 208 (12), 2403-2416 (2011).
- Gazit, R., et al. Fgd5 identifies hematopoietic stem cells in the murine bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 211 (7), 1315-1331 (2014).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Chen, J. Y., et al. Hoxb5 marks long-term haematopoietic stem cells and reveals a homogenous perivascular niche. Nature. 530 (7589), 223-227 (2016).
- Ema, H., et al. Quantification of self-renewal capacity in single hematopoietic stem cells from normal and Lnk-deficient mice. Developmental Cell. 8 (6), 907-914 (2005).
- Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment. Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).
- Yamamoto, R., et al. Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Fathman, J. W., et al. Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential. Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
- Schroeder, T. Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior. Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).
- Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine. Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
- Nishi, K., et al. Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation. British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).
- Sakamaki, T., et al. Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment. Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).
