Summary
Här presenterar vi ett protokoll för odling av IDG-SW3-celler i en tredimensionell (3D) extracellulär matrix.
Abstract
Osteocyter anses vara icke-proliferativa celler som är terminalt differentierade från osteoblaster. Osteoblaster inbäddade i benets extracellulära matris (osteoid) uttrycker Pdpn-genen för att bilda cellulära dendriter och omvandlas till preosteocyter. Senare uttrycker preosteocyter Dmp1-genen för att främja matrismineralisering och därigenom omvandlas till mogna osteocyter. Denna process kallas osteocytogenes. IDG-SW3 är en välkänd cellinje för in vitro-studier av osteocytogenes. Många tidigare metoder har använt kollagen I som huvudsaklig eller enda komponent i odlingsmatrisen. Men förutom kollagen I innehåller osteoiden också ett grundämne, som är en viktig komponent för att främja celltillväxt, vidhäftning och migration. Dessutom är matrissubstansen transparent, vilket ökar transparensen hos den kollagen I-bildade gelen och därmed hjälper till att utforska dendritbildning genom avbildningstekniker. Således beskriver denna artikel ett protokoll för att etablera en 3D-gel med hjälp av en extracellulär matris tillsammans med kollagen I för IDG-SW3-överlevnad. I detta arbete analyserades dendritbildning och genuttryck under osteocytogenesen. Efter 7 dagars osteogen odling observerades ett omfattande dendritnätverk tydligt under ett fluorescenskonfokalmikroskop. Realtids-PCR visade att mRNA-nivåerna av Pdpn och Dmp1 kontinuerligt ökade under 3 veckor. Vid vecka 4 avslöjade stereomikroskopet en ogenomskinlig gel fylld med mineralpartiklar, i överensstämmelse med röntgenfluorescensanalysen (XRF). Dessa resultat indikerar att denna odlingsmatris framgångsrikt underlättar övergången från osteoblaster till mogna osteocyter.
Introduction
Osteocyter är terminalt differentierade celler som härrör från osteoblaster 1,2. När osteoblasten är begravd av osteoiden genomgår den osteocytogenes och uttrycker Pdpn-genen för att bilda preosteocyter, Dmp1-genen för att mineralisera osteoiden och Sost- och Fgf23-generna för att fungera som en mogen osteocyt i benvävnad3. Här introduceras ett 3D-odlingssystem för att identifiera dendritförlängning och markörgenuttryck i osteocytogenesprocessen.
IDG-SW3-celler är en odödliggjord primär cellinje som härrör från transgena möss och kan expandera eller replikera osteoblast till sen osteocytdifferentiering när de odlas iolika medier. Jämfört med MLO-A5, MLO-Y4 och andra cellinjer är uttrycksprofilen för funktionella proteiner, förmågan att utföra kalciumsaltavsättning och svaren på olika hormoner i IDG-SW3-celler mer benägna att vara desamma som för primära osteocyter i benvävnaden4.
Jämfört med 2D-system är 3D-odlingssystem mer kapabla att efterlikna den cellulära tillväxtmiljön in vivo, inklusive näringsgradienten, låg mekanisk styvhet och omgivande mekaniskt område (tabell 1). De flesta av de tidigare metoderna för att odla osteoblastiska celler i ett 3D-system använde kollagen I som den unika komponenten i formuleringar 4,5,6, eftersom kollagen I-fibrer fungerar som platsen för kalcium- och fosforavsättning. En oumbärlig beståndsdel i osteoiden, den extracellulära matrisen, innehåller dock en stor grupp cellulära faktorer som främjar cellulär tillväxt, vidhäftning och migration 7,8 och är transparent och bekväm för avbildningsobservation. Således använder detta protokoll Matrigel (hädanefter kallad basalmembranmatris) som en sekundär komponent för osteocytogenesstudien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är lämpligt för odling av celler i fyra brunnar med 24-brunnars plattor. Om flera prover eller plattor bereds bör mängden reagenser ökas i enlighet med detta.
1. Beredning av kollagen I-blandningen
OBS: Kollagen I och basalmembranmatrisgel snabbt vid rumstemperatur. Därför bör kollagen hanteras på is (2 °C till 8 °C). Alla munstycken och tuber som används skall förkylas om inte annat anges. Alla procedurer ska utföras i en säkerhetshuva.
- Lägg alla reagenser och centrifugrör på is.
- Pipettera långsamt 0,48 ml kollagen I (5 mg/ml) och 0,1 ml 10x minsta essentiella medium (MEM) (med fenolrött) i ett sterilt 15 ml centrifugrör som hålls på is. Blanda väl genom att pipettera försiktigt upp och ner.
- Enligt färgpaletten för fenolrödindikatorn, använd en lämplig volym på 7.5 % (w/v) NaHCO3 (cirka 0.2 ml) för att justera fenolrödindikatorn till orange, vilket indikerar att pH-värdet ligger i intervallet 7.0-7.4.
OBS: Beroende på mediets pH används en volym NaHCO3 för att få pH till cirka 7,0-7,4. Dessutom används NaOH för pH-neutralisering. - Värm upp den slutliga volymen av blandningen till 1 ml genom att tillsätta en lämplig volym ddH2O. Blanda väl genom att pipettera försiktigt upp och ner för att förbereda för användning.
OBS: Den slutliga volymen av ddH2O beror på mängden NaHCO 3 eller NaOH som användes i steg1.3 .
2. Beredning av cell-matrisblandningen
- Pipettera långsamt 0,9 ml basalmembranmatris i ett nytt 15 ml centrifugrör på isen.
- Odla IDG-SW3-cellerna i en T25-kolv med 4 ml helmedium (alfa-MEM innehållande 10 % fetalt bovint serum [FBS]) tillsatt med 50 E/ml INF-γ vid 33 °C.
- När IDG-SW3-cellerna når 90 % sammanflöde, ta bort mediet och tvätta cellerna med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4 i hela protokollet) med en pipett. Smält cellerna med 0,5 ml 0,25 % trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) vid 37 °C i 30 s.
- Inaktiverar trypsinet genom att tillsätta 3,5 ml helmedium (alfa-MEM innehållande 10 % fetalt bovint serum [FBS]). Överför 4 ml cellsuspensionen till ett 15 ml centrifugrör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 300 × g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml av det kompletta mediet på is.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och justera den slutliga celltätheten med hela mediet till 4 × 105 celler/ml. Tillsätt 0,1 ml av den beredda cellsuspensionen till 0,9 ml av den extracellulära matrisen från steg 2.1. Blanda väl genom att pipettera försiktigt upp och ner.
OBS: Om en cellfri kontroll behövs, tillsätt 0.1 ml av hela mediet till 0.9 ml extracellulär matris som en negativ kontroll.
3. Plätering av cell-gelblandningen
- Blanda försiktigt de två blandningarna väl från steg 2.6 och steg 1.4 till 2 ml genom att pipettera upp och ner på isen. Pipettera 0,5 ml av den slutliga blandningen i varje brunn (fyra brunnar på en 24-hålsplatta). Inkubera vid 37 °C i 1 timme så att en cellgelblandning bildas.
- Tillsätt 0,5 ml osteogent medium (helmedium innehållande 50 μg/ml askorbinsyra och 4 mM β-glycerofosfat, även kallat osteogent induktionsmedium)4 till cellgelblandningen i varje brunn för att starta den osteogena differentieringen vid 37 °C. Se detta som dag 0.
- Varannan dag, byt ut halva mediet mot färskt osteogent medium som hålls vid 37 °C. Fortsätt odlingen i 35 dagar.
4. Identifiering av cellviabilitet och cellulära dendriter med hjälp av ett konfokalmikroskop
- Cellfärgning
OBS: Kalceinacetoximetylester (calcein AM) är ett cellpermeant färgämne som kan användas för att bestämma cellviabilitet. Etidiumhomodimer-I (EthD-1) passerar inte membranet hos intakta/livskraftiga celler9. Således kan calcein AM/EthD-1 användas för att identifiera cellviabilitet och cellulära dendriter.- På dag 1 och dag 7 av odlingen, avlägsna stamlösningen calcein AM (4 mM i DMSO) och stamlösningen EthD-1 (2 mM i DMSO/H2O 1:4 [v/v]) från frysen och låt dem värmas upp till rumstemperatur.
OBS: Den mineraliserade matrisen har en stark autofluorescenssignal, så preosteocytstadiet utan Dmp1-uttryck inom 7 dagar efter odling4 är mer lämpligt för observation av cellfärgning. - Tillsätt 4 μl av stamlösningen av 2 mM EthD-1 och 5 μl av stamlösningen av kalcein av 4 mM till 2 ml av Dulbeccos fosfatbuffrade koksaltlösning (D-PBS) och blanda väl. Detta ger cirka 2 μM calcein AM och 4 μM EthD-1 som arbetslösningar.
- Pipettera 0.5 ml av arbetslösningen i brunnarna i 24-hålsplattan. Inkubera i 30-45 minuter i rumstemperatur för att färga cell-gel-matrisen.
- Efter inkubationen tillsätts cirka 0,5 ml färsk D-PBS till en ny 35 mm odlingsskål med glasbotten. Täck över skålen för att förhindra kontaminering eller uttorkning av proverna.
- Använd en pincett med armbågsspets och överför försiktigt den färgade cellgelmatrisen från steg 4.1.3 till odlingsskålen med 35 mm från punkt 4.1.4. Undvik att skada eller klippa cell-gel-matrisen.
- View de märkta cellerna under ett laserkonfokalfluorescensmikroskop.
- På dag 1 och dag 7 av odlingen, avlägsna stamlösningen calcein AM (4 mM i DMSO) och stamlösningen EthD-1 (2 mM i DMSO/H2O 1:4 [v/v]) från frysen och låt dem värmas upp till rumstemperatur.
- Skanningsset för mikroskop
- Placera 35 mm fatet på scenen. Välj de områden i cell-gelmatrisen som ska skannas genom okularet med ett 10x objektiv. Högre förstoringsmål rekommenderas inte på grund av storleken på de förlängda dendriterna.
- Välj de optiska filtren. Kalcein kan ses som grönt med ett standard fluoresceinbandpassfilter, och EthD-1 kan ses som rött med filter för propidiumjodid eller Texas Red-färgämne. Välj "linjeläge" för skanning och ställ in "nålhålet" på 2 μm.
- Välj ett datadjup på 8 bitars datadjup och en bildupplösning på 1 024 pixlar x 1 024 pixlar.
- Bild med sekventiell linjeskanning med optimala laser- och detektorinställningar (håll en minimal laserenergi för att undvika potentiell fotoblekning).
OBS: Den optimala detektorinställningen beror på de slutliga fluorescenssignalerna.
- Samla in en "z-stack" med bilder
- Enligt den gröna kanalsignalen, definiera topp- och bottenpositionerna för cell-gelmatrisen som ska skannas genom att fokusera genom sample medan du kontinuerligt skannar, .
- När den övre och nedre delen av exemplet har angetts väljer du önskad skanningsram. Börja skanna. Provet skannas uppifrån och ned med de valda inställningarna från steg 4.2, vilket genererar ett galleri med bilder.
- Identifiering av cellviabilitet.
- Välj ett segment i steg 4.3. De gröna och röda kanalerna indikerar levande respektive döda celler.
- Identifiering av celldendrit.
- Välj den enda gröna kanalen för att generera 3D-rekonstruktioner med bildinsamlingsprogrammet. Djupinformationen visas som en serie regnbågspseudofärgbilder. Dendriterna längst ner på gelen visas i rött, medan de högst upp visas i blått.
5. Identifiera utseende med hjälp av ett stereomikroskop
- På dag 1, dag 7, dag 21 och dag 35 av kulturen, ta bort odlingsmediet och tvätta gelerna i plattan två gånger med D-PBS. Tillsätt 0,5 ml 4 % (v/v) paraformaldehyd i D-PBS i brunnen för att fixera cell-gel-matrisen i plattan i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort paraformaldehyden i brunnen och tvätta cell-gel-matrisen ytterligare två gånger med D-PBS i plattan. Lämna 0.5 ml D-PBS i varje brunn för avbildning.
- Placera plattan på scenen och välj den optimala positionen genom okularet med hjälp av ett 0.5x objektiv. Avbilda hela fältet view av cell-gel-matrisen i plattan individuellt med hjälp av "automatisk exponering" under det ljusa fältet.
6. Identifiering av mineralavsättning med en XRF-analys
- På dag 35 av odlingen, kontrollera om det flytande kvävet är tillräckligt. Starta XRF-systemet. Öppna provrummet och överför gelerna med armbågsspetsad pincett från plattan till mitten av provsteget på instrumentet. Stäng provrummet och vänta i 30 minuter så att instrumentet svalnar före användning.
- Ställ in "Exponeringstid" på 35 ms, "Spektrumområde" på 0-40 keV och "Elektrisk ström" på 770 μA för förvärvsinställning.
- Välj tre till fem skanningsplatser för analys genom att flytta provsteget.
- Välj elementen (Ca och P) för identifiering. Starta identifieringen och exportera resultatet.
OBS: Ca och P är de vanligaste grundämnena i hydroxiapatit.
7. Identifiering av funktionellt genuttryck
- På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 och dag 35 av odlingen, ta bort odlingsmediet och tvätta cellgelmatrisen två gånger med iskall D-PBS i plattan.
- Överför gelerna med armbågsspetsad pincett från plattan till ett 2,0 ml rör (beroende på odlingstiden kommer cell-gel-matrisen gradvis att krympa till cirka 0,1 ml på dag 35). Se till att en gel placeras i ett rör. Tillsätt 1 ml fenolkloroform och två sterila visppärlor av rostfritt stål (4 mm, som lyseringsmatris) i varje rör. Placera rören symmetriskt i den förkylda provöppningen på den mekaniska visphomogenisatorn.
- Ställ in svävningen på en frekvens på 55 Hz och en amplitud på 1 cm i varje 1 minut av mekanisk svävning med en paus på 10 s, med totalt sex cykler. Börja pärlslagen.
- Extrahera det totala RNA:t från cell-gelmatrisen med fenol-kloroform-isoamylachohol-metoden. Omvänd transkribera 2 μg totalt RNA till cDNA med slumpmässiga hexamerprimrar.
- Designprimers som riktar sig mot β-aktin, Pdpn, Dmp1, Sost och Fgf23 för realtids-PCR (tabell 2). β-aktin är hushållsgenen som används för normalisering. Generna Pdpn10 och Dmp1 11 uttrycks huvudsakligen i pre-osteocyter och mineraliserade osteocyter, medan Sost12 och Fgf23 13 huvudsakligen uttrycks i mogna osteocyter.
- Placera röret på en termocykler med det uppvärmda locket inställt på 105 °C och utför PCR-amplifiering med följande PCR-cykelinställningar: 95 °C i 5 s och 60 °C i 30 s i 35 cykler med ett första denatureringssteg vid 95 °C i 5 minuter och ett sista förlängningssteg vid 60 °C i 30 s. Analysera veckförändringarna med ΔΔCt-metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter färgning av levande/döda celler visualiserades cellerna med hjälp av ett konfokalt lasermikroskop. Alla celler var calcein AM-positiva (grön färg), och det fanns nästan inga EthD-1-positiva celler (röd färg) i fältet, vilket indikerar att gelsystemet tillverkat med denna metod är mycket lämpligt för osteocytogenes (Figur 1A, vänster). För att bättre bestämma den rumsliga fördelningen av cellerna valdes en pseudofärgbild för att visa cellens dendriter på olika djup av gelen; Rött visar dendriterna längst ner på gelen och blått visar dendriterna längst upp. Resultaten indikerade att IDG-SW3-cellerna växte bra i denna cell-gel-matris, och de cellulära dendriterna utvidgades gradvis till ett nätverk i det osteogena mediet på dag 7 (Figur 1A, höger, och Figur 1B).
Under ett stereomikroskop fortsatte genomskinligheten i gelmatrisen att minska tills den blev ogenomskinlig vid dag 35, till skillnad från den cellfria gelmatrisen (Figur 2A). XRF-spektrumet för den ogenomskinliga gelen vid dag 35 indikerade att gelen var helt fylld med kalcium- och fosforavlagringar (Figur 2B).
På dag 1, dag 7, dag 21, dag 28 och dag 35 av odlingen analyserades uttrycket av flera markörgener med realtids-PCR. Resultaten visade att mRNA-nivåerna av Pdpn och Dmp1 kontinuerligt ökade från dag 1 till dag 21, medan mRNA-nivåerna av Pdpn minskade efter dag 21 (Figur 3). mRNA-nivåerna av Fgf23 och Sost ökade kontinuerligt under alla stadier (Figur 3).
Figur 1: Det cellulära dendritnätverket i IDG-SW3 visualiserat med konfokalmikroskopi . (A) Representativa bilder av en del av det omfattande dendritnätverket i gelen. Den gröna färgen indikerar de levande cellerna och det utökade cellulära dendritnätverket. (B) Bildens pseudofärg i A (till höger, dag 7). Den röda (blå) färgen indikerar dendriterna som ligger längst ner (överst) av gelen. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mineraldeposition av IDG-SW3-cellerna efter osteogen odling . (A) Representativa fullfältsbilder av gelen med (överst) och utan (nedre) celler i en 24-hålsplatta vid de angivna tidpunkterna, som visualiseras av ett stereomikroskop. (B) Kalcium- och fosforhalten i cell-gel-matrisen på dag 35, analyserad med XRF-analysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Det funktionella genuttrycket hos IDG-SW3-cellerna efter osteogen odling. Förändringar i de funktionella generna i IDG-SW3-cellerna odlade med ett osteogent medium vid de angivna tidpunkterna. Förkortningar: D = dag; W = vecka. Data representeras som medelvärdet ± SEM. Veckförändringar analyserades med Ct-metoden, med hänvisning till β-aktingenen . Klicka här för att se en större version av denna figur.
| 2D | .3D | |
| Svårighet att förbereda sig | lätt | Medium |
| Gradient av näringsämne | frånvarande | gåva |
| Arrangemang av kollagen | Monolayer | multiaxiell diskret |
| Mekanikstyvhet hos ECM | hög | låg |
| Mekaniskt sortiment av ECM | ensidig | omgiva |
| Cellens rörlighet | plan yta | gratis |
| Intercellulär kommunikation | otillräcklig | tillräcklig |
Tabell 1: Jämförelse mellan 2D- och 3D-odlingssystem för IDG-SW3-celler.
| Namn | Sekvenser (5'- 3') |
| Pdpn-för | GGAGGGCTTAATGAATCTACTGG |
| Pdpn-rev | GGTTGTACTCTCGTGTTCTCTG |
| Dmp1-för | CCCAGTTGCCAGATACCAC |
| Dmp1-varv | CACTATTTGCCTGTCCCTCTG |
| Sost-för | ACAACCAGACCATGAACCG |
| Sost-rev | CAGGAAGCGGGTGTAGTG |
| FGF23-FÖR | GGTGATAACAGGAGCCATGAC |
| Fgf23-rev | TGCTTCTGCGACAAGTAGAC |
| β-aktin-för | ACCTTCTACAATGAGCTGCG |
| β-aktin-rev | CTGGATGGCTACGTACATGG |
Tabell 2: Primers som används i realtids-PCR-analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk punkt i detta protokoll är att steg 1 och steg 2 måste utföras på is för att förhindra spontan koagulation. I denna metod var den slutliga koncentrationen av kollagen I 1,2 mg/ml. Således bör en optimal ddH2O-volym beräknas för att matcha de olika kollagenerna från olika tillverkare.
In vivo involverar osteocytogenes en polär rörelse av osteoblaster från ytan till det inre av trabekulärt ben14. Detta protokoll befriar celler från tillväxt i matrisen utan riktad polaritet. Naturligtvis är det valfritt att plantera IDG-SW3-celler på den cellfria gelmatrisytan. Kollagenkoncentrationen som tillhandahålls i detta protokoll är dock inte tillräcklig för att bilda en teoretiskt plan yta för osteoblastinfiltration. Olika förhållanden mellan kollagen I och extracellulär matris bör testas för detta ändamål.
Jämfört med osteoiden är styvheten hos denna gel långt ifrån tillräcklig. Vissa artiklar rapporterar att man ökar styrkan hos geler genom att tillsätta flera kemiska material för att bättre efterlikna styvheten hos osteoiden in vivo 6,15. Fördelen med denna metod är att den bildade gelen kan ge ett medium med god transparens för avbildning och spårning av celler in situ snarare än att använda histologiska metoder15. Ändå är det svårt att tillfredsställa transparensen hos materialet för avbildning och samtidigt säkerställa att de in vitro fysikaliska och kemiska egenskaperna kan efterlikna osteoiden. Därför måste fler kulturmodeller utforskas för att ta itu med specifika vetenskapliga frågor.
Dessutom introducerades de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos denna IDG-SW3-mineraliserade gel, inklusive de reologiska egenskaperna, i en tidigare studie16. Således kan denna biogena mineraliserade gel som bildas med denna metod vara användbar som ett biomedicinskt material för framtida ortopedisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Lynda F. Bonewald för gåvan av IDG-SW3-cellinjen. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 och 81700778) och Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
References
- Bonewald, L. F.
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell ... and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
