Summary
Delvis isjiasnerveligering induserer langvarig kronisk nevropatisk smerte, preget av overdrevne responser på termiske og mekaniske stimuli. Denne musemodellen av nevropatisk smerte brukes ofte til å studere innovative terapier for smertebehandling. Denne artikkelen beskriver i detalj den kirurgiske prosedyren for å forbedre standardisering og reproduserbarhet.
Abstract
Behandling av kroniske smerter er fortsatt utfordrende til denne dagen, og dagens behandlinger er forbundet med bivirkninger, inkludert toleranse og avhengighet. Kronisk nevropatisk smerte skyldes lesjoner eller sykdommer i det somatosensoriske systemet. For å undersøke potensielle terapier med reduserte bivirkninger, er dyresmertemodeller gullstandarden i prekliniske studier. Derfor er godt karakteriserte og godt beskrevne modeller avgjørende for utvikling og validering av innovative terapier.
Delvis ligering av isjiasnerven (pSNL) er en prosedyre som induserer kronisk nevropatisk smerte hos mus, preget av mekanisk og termisk overfølsomhet, pågående smerte og endringer i lemtemperatur, noe som gjør denne modellen til en god passform for å studere nevropatisk smerte preklinisk. pSNL er en fordelaktig modell for å studere nevropatisk smerte, da den reproduserer mange symptomer observert hos mennesker med nevropatisk smerte. Videre er den kirurgiske prosedyren relativt rask og grei å utføre. Ensidig pSNL i ett lem muliggjør sammenligning mellom ipsilaterale og kontralaterale poter, samt evaluering av sentral sensibilisering.
For å indusere kronisk nevropatisk overfølsomhet brukes en 9-0 ikke-absorberbar nylontråd til å ligere den dorsale tredjedelen av isjiasnerven. Denne artikkelen beskriver den kirurgiske prosedyren og karakteriserer utviklingen av kronisk nevropatisk smerte gjennom flere vanlige atferdstester. Som en mengde innovative terapier blir nå undersøkt for å behandle kroniske smerter, gir denne artikkelen viktige begreper for standardisering og en nøyaktig beskrivelse av operasjoner som kreves for å indusere nevropatisk smerte.
Introduction
Kronisk smerte er et betydelig helseproblem over hele verden og er et av de dyreste helseproblemene i USA. Kronisk smerte håndteres bedre når både farmakologiske og ikke-farmakologiske modaliteter utnyttes på en tverrfaglig måte1. Behandling av kronisk smerte er utfordrende, og i noen tilfeller behandler ikke smertentilstrekkelig 2. Derfor er det behov for nye og komplementære metoder for å forbedre kronisk smertebehandling, og dyremodeller er avgjørende for å undersøke innovative terapier.
Kronisk nevropatisk smerte skyldes lesjoner eller sykdommer i det somatosensoriske systemet, inkludert diabetes, infeksjoner, nervekompresjoner eller autoimmune sykdommer3. Neuropatisk smerte er avhengig av både perifere og sentrale sensibiliseringsmekanismer og stammer fra en lesjon av nerver. Denne smerten kan karakteriseres av både berørings- og termisk fremkalt hyperalgesi og allodyni, pågående smerte og endringer i temperaturen på den berørte lemmen4. For bedre å forstå mekanismene og fremme nye behandlinger, har flere modeller blitt utviklet hos gnagere for å etterligne symptomene og årsakene til nevropatisk smerte5. For eksempel kan nevropatisk smerte induseres med kjemoterapeutiske middelinjeksjoner, spinalnerveligering (SNL), kronisk innsnevringsskade (CCI) av isjiasnerven, pSNL, spart nerveskade, isjiasnervetranseksjon og isjiasnervetriseksjon6. Spesielt reproduserer ligering av isjiasnerven flere funksjoner av nevropatisk smerte observert hos mennesker, for eksempel mekanisk og termisk overfølsomhet, eller endringer i temperaturen på den berørte lemmen, karakteristisk for komplekst regionalt smertesyndrom (CRPS)7. Dermed er denne modellen godt egnet for studier av CRPS eller andre nerveskadeaffeksjoner som induserer kronisk nevropatisk smerte. Modellen ble først utviklet av Seltzer i 19908, og er mye brukt i smertestudier for å undersøke nye smertestillende forbindelser eller evaluere kognitive effekter av kronisk smerte9,10,11,12,13. Modellen presenterer høy reproduserbarhet, og den partielle ligeringen bevarer atferdsresponser på perifere stimuli6.
Mange av dagens modeller har mangler som ikke er observert i pSNL. CCI-modellen har en mye høyere variasjon av skade mellom hvert dyr avhengig av tettheten til constrictoren, og autotomi endrer bakpotesifrene som gjør modellen uegnet for atferdsanalyse6. SNL-modellen er en langt mer komplisert og lengre operasjon som ikke bare krever avanserte tekniske ferdigheter, men som også har høy risiko for alvorlige motoriske utfall3. Disse manglene ser vi ikke i pSNL-modellen. Den enkle reproduserbarheten, den korte varigheten av operasjonen og den reduserte risikoen for motoriske underskudd sett postoperativt gjør denne modellen verdifull for å studere perifer nevropatisk smerte 8,14. Likevel kan den delvise ligeringsprosedyren i seg selv ha variabilitet mellom eksperimenter, noe som resulterer i mindre konsistens i antall ligerte nervefibre. Derfor er presentasjon av detaljene i operasjonen avgjørende for å øke reproduserbarheten blant studier.
For å indusere kronisk nevropati brukes en 9-0 ikke-absorberbar nylonsutur til å ligere en tredjedel av bredden av isjiasnerven. Etter operasjonen er responsen på termiske og mekaniske stimuli overdrevet, fra dag 1 postoperativt og varer mer enn 50 dager8. Her ble både termiske og mekaniske følsomheter evaluert over 28 dager ved hjelp av Hargreaves-, kokeplate- og von Frey-filamenttester. Alle atferdsanalysene viste konsistensen av den langvarige overfølsomheten. Denne modellen har vist seg å ha doseavhengige effekter av både morfin og ibuprofen, noe som bekrefter at den er velegnet for prekliniske smertestudier. Spesielt beskriver denne artikkelen instruksjonene for et unikt håndlaget glassverktøy, referert til som "nerveglasskrok." Dette verktøyet brukes i stedet for tang for å manipulere nerven og forhindre utilsiktet ekstra nerveskade under operasjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Arizona og er i samsvar med retningslinjene for bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health (NIH publikasjon nr. 80-23, 1966). Patogenfrie, voksne C57Bl6 / J-mus (vekt ved testing: 22-28 g) ble plassert i standard vivarium musebur (fem mus per bur) i klimakontrollerte rom på en 12 timers lys / mørk syklus og fikk tilgang til mat og vann ad libitum. Alle atferdseksperimenter ble utført av eksperimenter blindet for behandlingsbetingelsene.
1. Baseline: måling av mekanisk følsomhet
- Ved ankomst av musene, la dem venne seg til dyreavdelingen i 1 uke. Deretter tilvennes dyrene til eksperimentell håndtering i ≥7 dager etterpå.
- Tilvenne musene til von Frey-testapparatet i 1 time før testingen ved å plassere dem i klare pleksiglassbokser, på et netting, i samme rom som testrommet - helst med eksperimentøren til stede i rommet under habituering.
- Etablere baseline pote uttaksterskel via "opp-og-ned" metoden ved hjelp av von Frey filamenter beskrevet i tilleggstabell S1, starter med 3,61 (3,9 mN) filament.
- Mål abstinensresponsen på sondering av bakpoten med en serie kalibrerte fine (von Frey) monofilamenter. Påfør hvert filament vinkelrett én gang på plantaroverflaten på pSNLs ipsilaterale bakpote på dyrene som holdes i hengende nettingbur. Evaluer mekanisk følsomhet ved hjelp av "opp-og-ned" -metoden15: bestem uttaksterskelen ved å øke eller redusere stimulusstyrken i rekkefølge, tilsvarende filamentets størrelse. Påfør hvert filament sekvensielt én gang.
MERK: Eksperimentøren må unngå å stimulere noen av fotputene for å oppnå konsistente resultater mellom dyrene. - For eksempel, hvis dyret ikke reagerer på 3,61 filamentet, bruk det tykkere 4,08 filamentet (9,8 mN) (et svar noteres visuelt som uttak, risting eller slikking av den berørte poten); Hvis dyret reagerte første gang, bruk det tynnere 3,22 (1,6 mN) filamentet. Fortsett å bruke enten avtagende eller stadig tykkere filamenter, avhengig av om dyret hadde henholdsvis positive eller negative påfølgende responser. Rapportere negative og positive svar i databladet presentert i tilleggstabell S1. Test samme pote 4x med forskjellige filamenter etter den første positive responsen.
- Mål abstinensresponsen på sondering av bakpoten med en serie kalibrerte fine (von Frey) monofilamenter. Påfør hvert filament vinkelrett én gang på plantaroverflaten på pSNLs ipsilaterale bakpote på dyrene som holdes i hengende nettingbur. Evaluer mekanisk følsomhet ved hjelp av "opp-og-ned" -metoden15: bestem uttaksterskelen ved å øke eller redusere stimulusstyrken i rekkefølge, tilsvarende filamentets størrelse. Påfør hvert filament sekvensielt én gang.
2. Baseline: måling av termisk følsomhet ved bruk av Hargreaves-testen
- Ved ankomst av musene, la dem venne seg til dyreavdelingen i 1 uke. Deretter tilvennes dyrene til eksperimentell håndtering i ≥7 dager etterpå.
- Habituate musene til Hargreaves testapparat i 1 time før testing ved å plassere dem i klare pleksiglassbokser, i samme rom som testrommet - helst med eksperimentøren til stede i rommet under habituering.
MERK: Hargreaves-testen krever at dyret står stille i noen sekunder. Hos mus er tilvenning nøkkelen til et vellykket eksperiment. Dermed, hvis musene forblir veldig aktive etter 1 time med tilvenning, la dem akklimatisere seg lenger etter behov.- Bestem poteuttaksforsinkelser som beskrevet av Hargreaves et al.16. Akklimatisere musene i pleksiglasskabinetter på en klar pleksiglassplate.
- Fokuser en strålevarmekilde (høyintensitets projektorlampe) på plantaroverflaten på bakpoten ipsilateralt til pSNL. Juster intensiteten til varmekilden for å oppnå en grunnlinje med poteuttaksforsinkelse på ca. 10 s. Hold deretter intensiteten konstant for resten av eksperimentet.
- Vent til en bevegelsesdetektor automatisk stopper stimulansen og tidtakeren når poten trekkes tilbake. Bruk en maksimal grenseverdi på 33,5 s for å forhindre vevskader.
MERK: Cut-off bestemmes basert på tidligere eksperimenter og artikler for å unngå ytterligere hudskader11,17,18. Med intensiteten som ble brukt i denne studien, er 33,5 cut-off, tilsvarende en stimulusintensitet på 30 (50 W) ved bruk av Hargreaves-apparatet. Den observerte oppførselen er en refleksoppførsel, ikke en frivillig. - Etablere baseline poteuttaksforsinkelser ved hjelp av Hargreaves-apparatet og sikte på plantaroverflaten av pSNL ipsilateral bakpote. Start termisk stimulering og registrer tilbaketrekningsforsinkelse. For å unngå å påvirke temperaturen på varmestimulansen, rengjør urin under forsøkene.
3. Baseline: måling av termisk følsomhet ved hjelp av varmplatetesten
- Habituate dyrene til testrommet i 1 time før testing.
MERK: Siden romtemperatur er viktig og kan påvirke responsen på kokeplatetesten, må du sørge for at temperaturen i rommet er konsekvent rundt 22 °C under habitueringsperioden og gjennom testperioden. - Sett kokeplaten på 52 °C, da denne temperaturen ideelt sett fremkaller en aversiv termisk respons19.
- Plasser dyret i testkammeret og start et kronometer.
- Vær oppmerksom på nocifensiv atferd (dvs. poteuttak, slikking, risting). Ettersom pSNL-operasjonen påvirker bakbenet, må du se bort fra atferd observert i forbenene (spesielt slikking i forbenene).
- Stopp kronometeret så snart nocifensiv oppførsel er observert.
- Fjern dyret fra kammeret og registrer ventetiden til denne oppførselen.
MERK: Fjern dyrene fra kammeret etter maksimalt 30 s for å forhindre vevskader. I tillegg er det viktig å merke seg at den observerte oppførselen er en refleksadferd, ikke en frivillig. - Rengjør testkammeret med 70% etanol mellom dyr for å redusere atferdspåvirkningen av lukt. For å unngå å påvirke temperaturen på varmestimulansen, rengjør apparatet for urin mellom hvert testede dyr.
- For å bekrefte resultatene, ta opp videoer av dyrene i kokeplatekammeret under testing for gjennomgang etter at dyrene er testet.
MERK: Ved å bruke videogjennomgang for å kvantifisere ventetider, kan eksperimentøren gjentatte ganger observere testen og nøye analysere nocifensiv atferd som kan ha blitt savnet under sanntidsobservasjon.
4. Preoperativ forberedelse
MERK: Sørg for at rene bur er tilgjengelige for å gjenopprette musene etter operasjonen. Rengjør operasjonsområdet med 70% etanol, desinfiser hendene med 70% etanol, bruk sterile hansker, bruk riktig personlig verneutstyr (PPE) (laboratoriefrakk, hårnett, skodeksler) og praktiser sterile teknikker gjennom hele operasjonen.
- Forbered verktøyene (tilleggsfigur S1) og tilleggsressurser (gasbind) som skal brukes i kirurgi ved å autoklavere dem på forhånd.
- Indusere anestesi ved bruk av flyktig isofluran og juster etter behov for å opprettholde et kirurgisk plan. Sørg for at oksygenet har en passende strømningshastighet.
- For å sikre at dyret er bedøvet, klem tærne på en bakpote med pinsett for å sikre fravær av poterefleksen og kontroller hornhinnenes blinkrefleks før du smører oftalmisk salve.
MERK: Analgetika kan ikke tilbys i denne studien, da de kan endre smerteveien som er ment å bli analysert eller til og med nøytralisere og ugyldiggjøre atferden som måles i samsvar med smerteforskningsmål20,21,22. - Når du velger hvilken side du skal utføre operasjonen på (til venstre er demonstrert her), barber du dyrets bakben rundt lårregionen, dårligere mot patellaen, overlegen mot hoften og over lårbenet. Tørk 3x med klorhexidin i en retning med tre separate gasbind, vekslet med varm steril saltvann.
MERK: Fremover, sørg for at hvert dyr har operasjonen utført på samme side for å opprettholde konsistens. - Slip benet gjennom en spalt laget i en 10 cm x 10 cm steril drapering for å skape et sterilt felt rundt det valgte benet.
5. Kirurgisk prosedyre
- Bruk fin kirurgisk saks (tilleggsfigur S1F) til å lage et lite 2 mm kutt av huden i midtlinjen av lårets sideside. Skyv saksen under huden i en sirkulær bevegelse for å bryte gjennom fascia og skape en klaring, forstørre snittrommet.
- Bruk tang (tilleggsfigur S1H) til å lage et skarpt snitt vertikalt i 90° vinkel i lårmuskulaturen, 1 cm dypt.
- Sett de fine små saksene (tilleggsfigur S1G) inn i samme snitt, også i 90° vinkel, og spre dem forsiktig for å skille musklene. Fortsett å gjøre dette til isjiasnerven er visualisert.
- Finn isjiasnerven, som kan virke blank og tynn, som løper parallelt med det vertikale låret, i retning av hoften til kneet. Fjern saksen og bindingen tang fra kroppen før du fortsetter.
- Bruk den ekstra fine tangen (tilleggsfigur S1D) og nerveglasskroken (tilleggsfigur S1E) for å isolere nerven fra undersiden. Frigjør nerven forsiktig fra omkringliggende bindevev på et sted nær femurets trokanter, som er nærmest hoften og lengst fra kneet.
- La nerven hvile på glassstangen og sørg for at enden av stangen forhindrer nerven i å rulle av.
- Plasser en kirurgisk knute for å knytte 1/3 av bredden på isjiasnerven ved hjelp av en 9-0 nylonsutur, før den deler seg i de vanlige peroneale, tibiale og surale nervegrenene3.
MERK: Forgreningen oppstår når isjiasnerven går nedover kneet, vekk fra hoften. Siden disse tre grenene av nerven har tre forskjellige innerveringer, er det viktig å plassere den kirurgiske knuten før forgreningen for å sikre de samme nerveunderskuddene på tvers av alle dyreoperasjoner. - Pass på å holde trådene nær knuten når du trekker trådene stramt, for ikke å trekke i nerven med overdreven kraft for å unngå å skyve nerven av glassstangen og unngå ytterligere strekkskader.
- Forsiktig skli nerven av glassstangen når knuten er fullført, og stikk den tilbake til den opprinnelige plasseringen på nivået under de separerte musklene.
- Sutur muskelsnittet ved hjelp av en absorberbar polyglykolisk 5-0 sutur. Sutur huden separat med en ikke-absorberbar polypropylen 6-0 sutur.
- Registrer operasjonen og anestesiens stopptid. La musen våkne opp, alene i et oppvåkningsbur, før du returnerer den til et nytt rent bur.
MERK: Gjennom hele operasjonen, klem dyrets tær for å bekrefte tilstrekkelig vedlikehold av anestesi og overvåke pusten og kroppslig perfusjon (rød, rosa, blek). Hvis pusten er betydelig redusert eller dyret virker blekt, bør du vurdere å redusere anestesistrømmen eller øke oksygenstrømmen og ha en sprøyte fylt med saltvann klar til å injisere subkutant for å rehydrere dyret. Til enhver tid bør dyret ha en varmekilde plassert under den for å opprettholde kroppsvarmen.
6. Sham kirurgi prosedyre for kontrolldyr
- Følg trinn 5.1-5.11 i den kirurgiske prosedyren; Ekskluder trinn 5.4–5.9.
7. Postkirurgiske atferdstester
MERK: Sørg for at eksperimentøren er blindet for noen behandling. Kronisk nevropatisk smerte vil utvikle seg over 2 uker etter operasjonen, hvoretter atferdstester kan utføres etter administrering av forbindelser av interesse.
- Bruk von Frey, Hargreaves eller kokeplatetest for å evaluere både termisk og mekanisk overfølsomhet og potensiell reversering.
- Fjern ethvert dyr fra studien hvis det oppfyller endepunktskriteriene som beskrevet av institusjonens komité for dyrepleie og bruk.
- Avlive dyrene etter prosedyrer beskrevet av institusjonens dyrepleie- og brukskomité ved slutten av atferdstestingen.
8. Dataanalyse
- von Frey:
- Analyser dataene ved hjelp av den ikke-parametriske metoden til Dixon, som beskrevet av Chaplan og kolleger23, og uttrykk dataene som gjennomsnittlig tilbaketrekningsterskel.
- På hovedsiden til den refererte programvaren (se Materialfortegnelse), velg alle filamentene som ble brukt til studien (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 og 4.56). I gruppepanelet velger du filamentet som tilsvarer den siste simuleringen. I den tomme boksen rapporterer du de positive (X ) og negative (o) svarene. Skriv ned tersklene som er rapportert i boksen til venstre for det observerte mønsteret av svar.
MERK: Et eksempel på mønster og kvantifisering er presentert i tilleggsfigur S2.
- På hovedsiden til den refererte programvaren (se Materialfortegnelse), velg alle filamentene som ble brukt til studien (2.44, 2.83, 3.22, 3.61, 4.08, 4.31 og 4.56). I gruppepanelet velger du filamentet som tilsvarer den siste simuleringen. I den tomme boksen rapporterer du de positive (X ) og negative (o) svarene. Skriv ned tersklene som er rapportert i boksen til venstre for det observerte mønsteret av svar.
- Analyser dataene ved hjelp av den ikke-parametriske metoden til Dixon, som beskrevet av Chaplan og kolleger23, og uttrykk dataene som gjennomsnittlig tilbaketrekningsterskel.
- Hargreaves og kokeplate:
- Rapporter forsinkelsene i et regneark for videre statistisk analyse.
- Plott resultatene som gjennomsnittet av følsomhetene (terskler eller latenser) som en funksjon av tid.
9. Instruksjoner om hvordan du lager nerveglasskroken
MERK: Øv på brannsikkerhet gjennom hele denne prosessen. Bruk riktig beskyttelse, for eksempel varmebestandige hansker eller briller etter behov.
- Slå på Bunsen-brenneren.
- Hold den ene enden av glassstangen (A) til ilden i den ene hånden. Når denne glassstaven smelter, bruk en annen glassstang (B) i den andre hånden for å lede og trekke i smelteglasset på stang A. Fjern glassstang A fra brannen og la enden av den smeltede delen naturlig rulle innover for å danne en liten kuleform. Bruk glassstangen B til å lede denne formen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kroniske nevropatiske smerter ble indusert gjennom delvis ligering av isjiasnerven hos C57Bl6/J-hannmus (figur 1A). Mekanisk følsomhet ble evaluert ved hjelp av von Frey-filamenter og "opp-og-ned"-metoden. Termisk følsomhet for varme ble evaluert ved hjelp av Hargreaves og kokeplatetester. Alle data ble analysert med gjentatte målinger toveis ANOVA med Geisser-Drivhuskorreksjon, for å sammenligne effekten av pSNL-kirurgi med narredyr over tid eller effekten av ulike doser morfin og ibuprofen.
Mus som gjennomgikk pSNL-kirurgi viste lavere terskel for mekaniske stimuli sammenlignet med skamdyr over 28 dager (figur 1B). Lignende resultater ble oppnådd med evaluering av termisk overfølsomhet; poteuttaksforsinkelser etter eksponering for strålevarmestimulus var økt hos pSNL-dyr (figur 1C), samt abstinensforsinkelser når dyr ble plassert på en 52 °C-plate (figur 1D).
Etter etablering av kronisk nevropatisk smerte, 14 dager etter operasjonen, evaluerte vi den antinociceptive effekten av forskjellige doser morfin eller ibuprofen. Mus ble injisert intraperitonealt med enten saltvannsoppløsning eller to forskjellige doser morfin (1 og 5 mg/kg). Begge morfininjiserte gruppene viste en reversering av pSNL-indusert hypersensitivitet, som varte fra 1 (1 mg/kg) til 2 timer (5 mg/kg) (figur 2A). Mekanisk overfølsomhet gikk tilbake til baseline 4 timer etter injeksjon av morfin. Når to forskjellige doser ibuprofen (10 og 30 mg / kg) ble administrert intraperitonealt til musene, viste resultatene redusert mekanisk overfølsomhet sammenlignet med saltvannsinjiserte mus (figur 2B). De antinociceptive effektene av ibuprofen varte opptil 2 timer. Samlet sett viste resultatene at pSNL-kirurgi induserer langvarig kronisk nevropatisk smerte. Videre kunne vi demonstrere at denne modellen er følsom for ulike doser smertestillende midler.
Figur 1 Langvarig termisk og mekanisk overfølsomhet hos mus på grunn av delvis ligering av isjiasnerven. Termisk følsomhet for varme (Hargreaves og varmplatetest) og mekanisk følsomhet for von Frey-filamenter ble vurdert for å undersøke induksjon og persistens av overfølsomhet i en modell av kronisk nevropatisk smerte (pSNL). Baselineverdier ble målt før ligering av isjiasnerven, og overfølsomhet ble evaluert over 28 dager etter operasjonen. (A) Illustrasjonen representerer delvis ligering av isjiasnerven. (B) Mekaniske uttaksterskler ble sammenlignet mellom humbug og pSNL-mus på hvert tidspunkt. Gjentatte målinger toveis ANOVA med Geisser-Drivhuskorreksjon viste signifikant effekt av pSNL (F(1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 per tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste signifikant økning i overfølsomhet mellom dag 1 og 28 (p < 0,05). (C) Termiske tilbaketrekningsforsinkelser, målt ved Hargreaves-testen, ble sammenlignet mellom humbug og pSNL-mus. Gjentatte målinger toveis ANOVA med Geisser-Drivhuskorreksjon viste signifikant effekt av pSNL (F(1, 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 per tilstand). Sidaks test for flere sammenligninger viste signifikant økning i overfølsomhet ved dag 2 og 14 (p < 0,05). (D) Termiske abstinensforsinkelser, målt ved varmeplatetesten, ble sammenlignet mellom humbug- og pSNL-mus. Ordinær toveis ANOVA viste signifikant effekt av pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 per tilstand). Sidaks multiple sammenligningstest viste signifikant økt følsomhet for varme 4 uker etter pSNL-kirurgi (p = 0,0026). Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. Forkortelser: pSNL = delvis ligering av isjiasnerven; BL = baseline. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Doseavhengig reversering av pSNL-indusert mekanisk hypersensitivitet ved intraperitoneal injeksjon av morfin eller ibuprofen. Mekanisk hypersensitivitet (ved bruk av von Frey-filamenter) ble vurdert for å undersøke potensielle antinociseptive effekter av morfin eller ibuprofen i en musemodell av pSNL. Baselineverdier (pre-pSNL) ble ervervet før isjiasnerveligering. Etter etablering av kronisk nevropatisk smerte ble dyr på dag 14 baselinert for andre gang for å sikre pSNL-indusert hypersensitivitet (post-pSNL). Deretter ble to doser av enten morfin (1/5 mg/kg) eller ibuprofen (10/30 mg/kg) injisert intraperitonealt. Potensiell reversering av mekanisk hypersensitivitet ble vurdert over 4 timer etter injeksjoner. (A) Mekaniske abstinensgrenser ble sammenlignet mellom saltvannstilstanden og de to dosene morfin. Gjentatte målinger toveis ANOVA med Geisser-Drivhuskorreksjon viste signifikant effekt av morfin på 1 mg/kg (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 per tilstand) og signifikant effekt på 5 mg/kg morfin (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 per tilstand). Sidaks test for flere sammenligninger viste en signifikant reduksjon av mekanisk overfølsomhet 1 time etter injeksjon for begge dosene, men bare en signifikant effekt for tilstanden 5 mg/kg ved 2 timer (*p < 0,05). (B) Mekaniske tilbaketrekningsterskler ble sammenlignet mellom saltvannstilstanden og de to dosene med ibuprofen. Gjentatte målinger toveis ANOVA med Geisser-Drivhuskorreksjon viste signifikant effekt på 10 mg/kg iburofen (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 per tilstand) og signifikant effekt på 30 mg/kg ibuprofen (F(1, 10) = 18,79, p = 0,0015, n = 6 per tilstand). Sidaks test for flere sammenligninger viste signifikant reduksjon av mekanisk overfølsomhet 1 og 2 timer etter injeksjon for begge doser (*p < 0,05). Data er presentert som gjennomsnitt ± S.E.M. Forkortelser: pSNL = delvis ligering av isjiasnerven; IP = intraperitoneal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur S1: Kirurgisk verktøy. De to bildene illustrerer de ulike verktøyene som ble brukt i operasjonen. (A) Fin Castroviejo nåleholder; (B) Castroviejo kanyleholder; (c) Mikro Adson tang; (D) ekstra fine Graefe tang; (E) nerveglasskrok; (F) fin saks (11,5 cm); (G) fin saks (9 cm); (H) binde tang; (I) iristang. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Representativt mønster av poteuttaksresponser målt ved von Frey filamenttest. For dette forsøket reagerte ikke musen på de tre første stimuleringene, men trakk poten på den fjerde stimuleringen med 4,56 filament. Etter positiv respons (x) ble et tynnere filament brukt (4,31), etterfulgt av filamenter av mindre størrelser til musen ikke reagerte på et annet filament (i dette tilfellet 4,08). Eksperimentøren må redusere størrelsen på filamentene, en etter en, til et fravær av respons (o). Etter et fravær av respons brukte eksperimentøren et tykkere filament til de fikk et positivt svar og reduserte størrelsen etter det positive svaret (oppnådd her med 4.31-filamentet). Fire stimuli ble utført etter den første positive responsen; det kronologiske mønsteret for hver stimulering er kommentert med tall i rødt i panel A. I dette tilfellet ble filamenter 2,44 til 3,22 aldri brukt, da dyret ikke viste en positiv respons med 3,61 filamentet. (B) Mønsteret av svar ble deretter fylt ut i Allodynia programvare, rapportert i samme rekkefølge filamenter ble brukt (000xx0x0), i boksen uthevet i hvitt. Den resulterende terskelen ble deretter beregnet av programvaren (2,60839). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstabell S1: Datainnsamlingsark for von Frey-testing. Denne tabellen gjør det mulig for eksperimenter å fylle ut svarmønstre når de bruker von Frey-filamenter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk smertebehandling krever ofte langvarig medisinering, noe som gjør smertebehandling utfordrende. Dermed er prekliniske modeller et viktig verktøy for å evaluere de potensielle fordelene ved innovative terapier som er avhengige av farmakologiske eller ikke-farmakologiske tilnærminger. De mange modellene av kronisk nevropatisk smerte gir utfordringer på grunn av økt variasjon i kirurgiske teknikker blant ulike forskere, noe som fører til redusert reproduserbarhet. Det er derfor viktig å karakterisere de potensielle antinociceptive effektene av nye terapier i flere modeller som er godt karakterisert og standardisert.
Denne rapporten viser at delvis ligering av nervesystemet resulterer i utvikling av langvarig kronisk nevropatisk smerte hos mus ved hjelp av relativt billige metoder. pSNL overdriver responsen på termiske og mekaniske stimuli, og modellen responderer på administrering av vanlig brukte analgetika på en doseavhengig måte. Derfor ser pSNL-modellen ut til å være en praktisk og sensitiv modell for å evaluere potensielle fordeler av nye legemidler. De primære egenskapene til nevropatisk smerte er hyperalgesi og allodyni. Denne rapporten viser hvordan mekanisk allodyni og termisk hyperalgesi påvirkes. Mekanisk hyperalgesi ble imidlertid ikke målt. Det er et stort grått område av overlapping mellom allodyni og hyperalgesi. Begge følelsene faller under paraplyen av generell overfølsomhet overfor en sensorisk stimulus24. Dermed kan den stimulerte følelsen oppfattes som en annen følelse, for eksempel varme som kuldesmerter eller berøring som følelsen av å brenne. Derfor er hyperalgesi og allodyni ofte vanskelig å skille, spesielt i dyresmertemodeller.
pSNL-modellen har blitt brukt i flere kroniske smertestudier for å evaluere effekten av smertestillende forbindelser, de underliggende mekanismene for kronisk smerte, eller til og med den kognitive effekten av langvarig nevropatisk smerte. Persistensen av mekanisk overfølsomhet opptil 70 dager tillater studier av langsiktige effekter av nye legemidler25. Det er viktig at den optimale perioden for atferdstesting omfatter den første, andre og tredje uken etter operasjonen, når kronisk smerte er etablert 8,11,26,27. For å evaluere styrken og effekten av et legemiddel eller en ikke-farmakologisk terapi, bør positive kontrollbehandlinger som morfin eller ibuprofen vurderes, avhengig av eksperimentell design. I motsetning til halefliktesten, bruker kokeplatetesten en stimulans til poten som integrerer supraspinale veier19. Kokeplatetesten har blitt mye brukt til å karakterisere antinociceptive egenskaper i modeller av kronisk nevropatisk smerte i nyere studier 19,28,29,30,31,32,33.
Denne modellen ble brukt til å karakterisere nye ikke-opioide behandlinger og identifisere en ny smertevei som involverer nevrotensinreseptor type 211,13. Det ble også brukt til å demonstrere involvering av glycinerge modulasjoner i kronisk smerte12 og utvikling av nye terapier og veier i skjæringspunktet mellom søvn og smerte10. Likevel har ingen artikler til dags dato presentert en detaljert forklaring av operasjonen supplert med en beskrivende video.
En vanlig kritikk av pSNL og lignende modeller er påliteligheten av konsistensen av graden av skade forårsaket av nevropatisk nerveskade blant dyr6. Denne artikkelen beskriver en prosedyre for å manuelt smelte og forme en glassstang for å lage en spesiell nerveglasskrok for å løse dette problemet. De fleste dyreoperasjoner bruker tang for å plukke opp fine nerver eller kar. Nerveglasskrokverktøyet gir en sikrere, mindre skadeutsatt metode for å håndtere nerven. Selv om formålet med denne modellen er å skape nerveskade, er det forsvarlig å unngå ytterligere skade på nerven annet enn det som skyldes suturen plassert gjennom en tredjedel av bredden av isjiasnerven. Nerveglasskroken er en glatt, ikke-skadelig overflate for nerven å hvile på; I tillegg gir ballen/kroken på enden enkel opphenting og stabilisering. Videre, når du syr nerven, anbefaler teknikken beskrevet ovenfor (protokollavsnitt note 5.7) å holde trådene dypt inne i kroppshulen, nærmest hvor knuten vil dukke opp. Dette unngår å trekke i enden av suturene og fremmer påføring av spenning på suturen nærmest nerven når du strammer knuten. Denne teknikken forhindrer ytterligere strekkskade hvis nerven utilsiktet skulle trekkes av nerveglasskroken, mot utsiden av hulrommet i ferd med å knytte knuten strammere. En ekstra fordel er bruken av fin saks for å gjøre det første kuttet. Dette muliggjør et mye mindre snittsted og dermed raskere helbredelse, i motsetning til de større kuttene som er laget med skalpellblad.
Metodene rapportert i denne artikkelen har også noen begrensninger. Utviklingen av kroniske smerter i pSNL-modellen påvirkes av dyrenes kjønn34. Derfor er det viktig at forskningsstudier inkluderer begge kjønn i analysen. Hensikten med denne rapporten var å fokusere på et kirurgisk inngrep og karakteriserte ikke seksuell dimorfisme av smertemodellen. Det er verdt å nevne at målinger av termisk følsomhet hos mus ved hjelp av Hargreaves-testen er utfordrende; Dyr må stå stille i et lite kabinett i noen sekunder mens stimulansen påføres. Dermed er tilvenning av musene til pleksiglasskabinettet en nøkkelfaktor for å oppnå vellykkede resultater. Måling av fremkalt smerte krever også nøye eksperimentell trening. Både fremkalte og spontane atferdstester anbefales for å evaluere termisk og mekanisk følsomhet, samt lemmens funksjonalitet. I tillegg ble morfin og ibuprofen i denne studien brukt som positive kontroller for antinociceptiv effekt. Disse to stoffene ble valgt da de ofte brukes som positive kontroller i flere smertemodeller og tillater en bedre sammenligning mellom de forskjellige modellene. Likevel er det viktig å nevne at pregabalin og gabapentin ofte foreskrives for å behandle nevropatisk smerte, og studier som fokuserer på nevropatisk smertebehandling bør inkludere disse legemidlene som positive kontroller.
Denne rapporten beskriver med presisjon en operasjon som vanligvis brukes til studier av kronisk nevropatisk smerte. Å la forskere og praktikanter dra nytte av en visuell beskrivelse av denne musemodellen, vil lette utviklingen av forskningsprosjekter som fokuserer på å forstå mekanismene for kronisk smerte eller sikte på karakterisering av innovative terapier. Videre er bruk av flere smertemodeller avgjørende for å forbedre reproduserbarheten, og denne rapporten vil lette implementeringen av pSNL-modellen i nye laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å rapportere. Ingen av forfatterne av manuskriptet mottok noen godtgjørelse eller godtgjørelse eller honorar på annen måte. Forfatterne er ikke tilknyttet noen leverandør eller farmasøytisk selskap tilknyttet denne studien.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Nasjonalt senter for komplementær og integrert helse [R01AT009716, 2017] (MMI), Comprehensive Chronic Pain and Addiction Center-University of Arizona (MMI), og Medical Scientist Training Program (MSTP) ved University of Arizona, College of Medicine, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
References
- Hassett, A. L., Gevirtz, R. N. Nonpharmacologic treatment for fibromyalgia: patient education, cognitive-behavioral therapy, relaxation techniques, and complementary and alternative medicine. Rheumatic Disease Clinics of North America. 35 (2), 393-407 (2009).
- Hylands-White, N., Duarte, R. V., Raphael, J. H. An overview of treatment approaches for chronic pain management. Rheumatology International. 37 (1), 29-42 (2017).
- Campbell, J. N., Meyer, R. A.
- Colloca, L., et al.
- Colleoni, M., Sacerdote, P. Murine models of human neuropathic pain. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (10), 924-933 (2010).
- Challa, S. R. Surgical animal models of neuropathic pain: Pros and cons. International Journal of Neuroscience. 125 (3), 170-174 (2015).
- Bennett, G. J., Xie, Y. K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33 (1), 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43 (2), 205-218 (1990).
- Hasnie, F. S., Wallace, V. C., Hefner, K., Holmes, A., Rice, A. S. Mechanical and cold hypersensitivity in nerve-injured C57BL/6J mice is not associated with fear-avoidance-and depression-related behaviour. British Journal of Anaesthia. 98 (6), 816-822 (2007).
- Ito, H., et al. Suvorexant and mirtazapine improve chronic pain-related changes in parameters of sleep and voluntary physical performance in mice with sciatic nerve ligation. PLoS One. 17 (2), 0264386 (2022).
- Martin, L., et al. Conotoxin contulakin-G engages a neurotensin receptor 2/R-type calcium channel (Cav2.3) pathway to mediate spinal antinociception. Pain. 163 (9), 1751-1762 (2021).
- Peiser-Oliver, J. M., et al. Glycinergic modulation of pain in behavioral animal models. Frontiers in Pharmacology. 13, 860903 (2022).
- Ramiro, I. B. L., et al. Somatostatin venom analogs evolved by fish-hunting cone snails: From prey capture behavior to identifying drug leads. Science Advances. 8 (12), (2022).
- Chung, J. M. Encyclopedia of Pain. Schmidt, R. F., Willis, W. D. , Springer. Berlin Heidelberg. 1299-1300 (2007).
- Zahn, P. K., Brennan, T. J. Primary and secondary hyperalgesia in a rat model for human postoperative pain. Anesthesiology. 90 (3), 863-872 (1999).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Yeomans, D. C., Proudfit, H. K. Characterization of the foot withdrawal response to noxious radiant heat in the rat. Pain. 59 (1), 85-94 (1994).
- Cheah, M., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. Assessment of thermal pain sensation in rats and mice using the Hargreaves test. Bio-Protocol. 7 (16), 2506 (2017).
- Hook, M. A., et al. The impact of morphine after a spinal cord injury. Behavioural brain research. 179 (2), 281-293 (2007).
- Loram, L. C., et al. Prior exposure to repeated morphine potentiates mechanical allodynia induced by peripheral inflammation and neuropathy. Brain, behavior, and immunity. 26 (8), 1256-1264 (2007).
- Green-Fulgham, S. M., et al. Oxycodone, fentanyl, and morphine amplify established neuropathic pain in male rats. Pain. 160 (11), 2634-2640 (2019).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurology. 13 (9), 924-935 (2014).
- Malmberg, A. B., Gilbert, H., McCabe, R. T., Basbaum, A. I. Powerful antinociceptive effects of the cone snail venom-derived subtype-selective NMDA receptor antagonists conantokins G and T. Pain. 101 (1-2), 109-116 (2003).
- Nakamura, Y., et al. Neuropathic pain in rats with a partial sciatic nerve ligation is alleviated by intravenous injection of monoclonal antibody to high mobility group box-1. PLoS One. 8 (8), 73640 (2013).
- Sherman, K., et al. Heterogeneity in patterns of pain development after nerve injury in rats and the influence of sex. Neurobiology of Pain. 10, 100069 (2021).
- Ba, X., et al. Cinobufacini protects against paclitaxel-induced peripheral neuropathic pain and suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation in rats. Biomedicine Pharmacotherapy. 108, 76-84 (2018).
- Hao, Y., et al. Huachansu suppresses TRPV1 up-regulation and spinal astrocyte activation to prevent oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain in rats. Gene. 680, 43-50 (2019).
- Guo, J., et al. Effects of resveratrol in the signaling of neuropathic pain involving P2X3 in the dorsal root ganglion of rats. Acta Neurologica Belgica. 121 (2), 365-372 (2021).
- Ni, W., Zheng, X., Hu, L., Kong, C., Xu, Q. Preventing oxaliplatin-induced neuropathic pain: Using berberine to inhibit the activation of NF-kappaB and release of pro-inflammatory cytokines in dorsal root ganglions in rats. Experimental and Therapeutic Medicine. 21 (2), 135 (2021).
- Wang, J., et al. Selective activation of metabotropic glutamate receptor 7 blocks paclitaxel-induced acute neuropathic pain and suppresses spinal glial reactivity in rats. Psychopharmacology. 238 (1), 107-119 (2021).
- Sun, C., Wu, G., Zhang, Z., Cao, R., Cui, S. Protein tyrosine phosphatase receptor type D regulates neuropathic pain after nerve injury via the STING-IFN-I pathway. Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 859166 (2022).
- Coyle, D. E., Sehlhorst, C. S., Mascari, C. Female rats are more susceptible to the development of neuropathic pain using the partial sciatic nerve ligation (PSNL) model. Neuroscience Letters. 186 (2-3), 135-138 (1995).
