يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بالإضافة إلى تشكيل حاجز عالي المقاومة ، يفترض أن الظهارة البولية المبطنة للحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب لاستشعار ونقل المعلومات حول بيئتها إلى الأنسجة الكامنة ، مما يعزز وظيفة الإفراغ والسلوك. يمكن أن يؤدي تعطيل حاجز الظهارة البولية ، أو وظيفته الحسية / محول الطاقة ، إلى المرض. تعوق دراسة هذه الأحداث المعقدة عدم وجود استراتيجيات بسيطة لتغيير التعبير الجيني والبروتيني في الظهارة البولية. يتم وصف الطرق هنا التي تسمح للمحققين بتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي العيار ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض بكفاءة عالية ، وبطريقة مباشرة نسبيا. يمكن التعبير عن كل من cDNAs والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل باستخدام نقل الفيروس الغدي ، ويمكن تقييم تأثير التعبير الجيني على وظيفة الظهارة البولية بعد 12 ساعة إلى عدة أيام. هذه الطرق لها قابلية تطبيق واسعة على دراسات بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية وغير الطبيعية باستخدام نماذج الفئران أو الفئران.
المقدمة
الظهارة البولية هي الظهارة المتخصصة التي تبطن الحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب1. وهو يتألف من ثلاث طبقات: طبقة من الخلايا المظلة ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب في كثير من الأحيان، والتي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ و طبقة خلية وسيطة مع مجموعة من الخلايا العابرة ثنائية النواة التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا مظلة سطحية استجابة لفقدانها الحاد ؛ وطبقة واحدة من الخلايا القاعدية ، تعمل مجموعة فرعية منها كخلايا جذعية يمكنها تجديد كامل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء التجارب التي تنطوي على توليد الفيروسات الغدية ، والتي تتطلب شهادة BSL2 ، بموجب موافقة من مكاتب الصحة والسلامة البيئية بجامعة بيتسبرغ ولجنة السلامة البيولوجية المؤسسية. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات ، بما في ذلك نقل الفيروسات الغدية (الذي يتطلب شهادة ABSL2) ، وفقا للمبادئ التوجيهية / اللوائح ذات الصلة لسياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وقانون رعاية الحيوان ، وبموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة بيتسبرغ. يتم ارتداء القفازات وحماية العين والزي المناسب لجميع الإجراءات التي تنطوي على الفيروسات المؤتلفة. يجب التخلص من أي نفايات سائلة أو صلبة كما هو موضح أدناه. وينبغي معاملة فراش الحيوانات بعد نقل اللحية وأي جثث ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إعداد الفيروس
يظهر مثال على تنقية الفيروس عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة في الشكل 1 أ. يتكون الشريط الوردي الفاتح ، الموجود في واجهة المادة الخلوية المحملة وطبقة CsCl 1.25 جم / مل ، بشكل أساسي من الخلايا المعطلة وحطامها (انظر السهم الأرجواني في الشكل 1A). يستمد لونه الوردي من الكمية الصغيرة من وسط الاستزراع الذي يتم نقله من الخطوة 1.5 في البروتوكول. توجد جزيئات الفيروس محل الاهتمام ، والتي تظهر كشريط أبيض حليبي ، في واجهة محاليل CsCl 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بينما ركز Ramesh et al. على تطوير استراتيجيات لاستخدام نقل الفيروسات الغدية في علاج سرطان المثانة 18 ، أظهرت التقارير الحديثة فائدة هذه التقنيات في دراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية / علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية 10،18،19،20،21 . تشمل السمات المهمة لهذا النهج ما يلي: (ط) في كامل جدار المثانة القوارض ، يتم تحويل الظهارة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مشروع تجريبي من خلال P30DK079307 (إلى M.G.D.) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK129473 (إلى GA) ، جائزة التطوير الوظيفي لجمعية المسالك البولية الأمريكية ومنحة مؤسسة وينترز (إلى NM) ، من قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى في مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307) ، وبواسطة S10OD028596 (إلى G.A.) ، التي مولت شراء نظام متحد البؤر المستخدم لالتقاط بعض الصور المعروضة في هذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ماصة 10 مل | Corning Costar (Millipore Sigma | ) CLS4488 | ماصة معقمة ، مصلية ، ملفوفة بشكل فردي |
| 12 مل أنبوب الطرد المركزي الفائق | ThermoFisher | 06-752 | PET أنبوب الطرد المركزي الفائق thinwall |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي | Falcon (Corning) | 352097 | معقم |
| 18 G إبرة | BD & nbsp ؛ | 305196 | 18 جم × 1.5 بوصة إبرة |
| 20 مل ماصة | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | ماصة معقمة مصلية ، ملفوفة بشكل فردي |
| 50 مل أنبوب طرد مركزي مخروطي | Falcon (Corning) | 352098 | |
| ماصة معقمة سعة 5 مل | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | ماصة معقمة ومصلية ملفوفة بشكل فردي |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | محلول مضاد للفيروسات |
| طبق زراعة الخلايا - 15 سم | فالكون (كورنينج) | 353025 | معقم ، معالج بزراعة الأنسجة ؛ (طبق 150 مم × 25 مم) |
| مكشطة الخلية | Sarstedt | 893.1832 | طول المقبض 24 سم ، طول الشفرة 1.7 سم |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | درجة البيولوجيا الجزيئية > 98٪ |
| DMEM وسط ثقافة (جلوكوز عالي) | جيبكو (ThermoFisher) | 11965092 | مع 4.5 جم / لتر جلوكوز + L-glutamine + فينول أحمر |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade & 99٪ |
| مصل الأبقار الجنينية | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | مصل محدد |
| ماصة زجاجية | فيشر Scientific | 13-678-20A | 5.75 في ماصة زجاجية ، معقمة |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | درجة البيولوجيا الجزيئية & 99٪ |
| خلايا HEK293 | خلايا ATCC | CRL-3216 | HEK293T هي نوع مختلف من خلايا HEK293 التي تعبر عن مستضد T الكبير SV40 |
| Isoflurane | قسطرة Covetrus | 29405 | |
| IV - ماوس | سميث ميديكال جيلكو | 3063 | 24 جم × 3/4 في قسطرة السلامة IV القسطرة الراديوية |
| - الجرذ | سميث ميديكال جيلكو | 3060 | 22 جم × 1 في قسطرة السلامة IV بقلية للإشعاع |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | درجة البيولوجيا الجزيئية > 99٪ |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Millipore Sigma | P5655 | درجة ثقافة الخلية ≥ 99٪ |
| Na2HPO4& bull; 7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | & جي ؛ 99.99٪ |
| كلوريد الصوديوم | Millipore Sigma | S3014 | درجة البيولوجيا الجزيئية ≥ 99٪ |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | & جي ؛ 98٪ |
| مخروط الأنف لحيوانات متعددة | المصممة | واحدة من عمود Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 ؛ | GE Healthcare | 17-085-01 | أعمدة معبأة مسبقا مملوءة بمضاد حيوي Sephadex G-25M |
| Penicillin / Streptomycin (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | محلول مركز 100x |
| مقياس الطيف | الضوئي Eppendorf ؛ | الضوء الحيوي | |
| حامل ومشبك | فيشر Scientific | 14-679Q و 05-769-8FQ | متاح من العديد من الموردين |
| وحدة تصفية معقمة | فيشر Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 & micro ؛ م وحدة مرشح التدفق السريع (150 مل) |
| وحدة تصفية معقمة 0.2 وميكرو ؛ م (حقنة) | فيشر العلمية | SLGV004SL | ميليبور سيجما ميليكس 0.22 & مايكرو; وحدة التصفية m التي تعلق على حقنة |
| السرعة أجهزة الطرد المركزي | Eppendorf & nbsp ؛ | 5810R | مع Eppendorf F34-6-38 دوار بزاوية ثابتة (12,000 دورة في الدقيقة) |
| حقنة (1 مل) | BD | 309628 | مل حقنة Luer-lok طرف - |
| حقنة معقمة (3 مل) | BD | 309656 | انزلاق حقنة سعة 3 مل - |
| طرد مركزي معقم على سطح الطاولة (سرعة منخفضة) | Eppendorf | 5702 | مع دلو متأرجح |
| نقل ماصات | فيشر ساينتفيك | 13-711-9AM | بولي إيثيلين 3.4 مل ماصة نقل |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | درجة البيولوجيا الجزيئية |
| TrypLE حدد محلول البروتياز | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | إنزيم TrypLE Express (1x) ، لا يوجد فينول أحمر |
| Ultra Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | مع دوار Beckman SW41 (41,000 دورة في الدقيقة) Vaporizer |
| ؛ | خدمات التخدير العامة | Tec 3 | Isoflurane مبخر |
| دوامة خلاط | VWR | 10153-838 | خلاط دوامة تناظرية |
المراجع
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
