Summary
यहां, हम हड्डी मेटास्टेसिस घावों के साथ एक माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
सबसे आम पुरुष दुर्दमता के रूप में, प्रोस्टेट कैंसर (पीसी) मृत्यु दर में दूसरे स्थान पर है, मुख्य रूप से 65% -75% हड्डी मेटास्टेसिस दर के कारण। इसलिए, नए चिकित्सीय विकसित करने के लिए प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस की प्रक्रिया और संबंधित तंत्र को समझना आवश्यक है। इसके लिए, हड्डी मेटास्टेसिस का एक पशु मॉडल एक आवश्यक उपकरण है। यहां, हम प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से हड्डी मेटास्टेसिस माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं की रिपोर्ट करते हैं। एक बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम यह निर्धारित कर सकता है कि प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को हृदय में सटीक रूप से इंजेक्ट किया गया है और कैंसर सेल मेटास्टेसिस की निगरानी की जाती है क्योंकि मेटास्टैटिक घाव के विकास की निगरानी में इसके बहुत फायदे हैं। यह मॉडल हड्डी में माइक्रो-मेटास्टेस बनाने के लिए प्रसारित कैंसर कोशिकाओं के प्राकृतिक विकास को दोहराता है और प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस की रोग प्रक्रिया की नकल करता है। यह आणविक तंत्र और इस बीमारी के विवो चिकित्सीय प्रभावों की आगे की खोज के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करता है।
Introduction
प्रोस्टेट कैंसर 112 देशों में पुरुषों में सबसे अधिक होने वाला कैंसर है और उच्च मानव विकाससूचकांक देशों 1,2 में मृत्यु दर के लिए दूसरे स्थान पर है। प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में अधिकांश मौतें मेटास्टेसिस के कारण होती हैं, और लगभग 65% -75% मामलों में हड्डी मेटास्टेसिस 3,4 विकसित होगा। इसलिए, प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों के नैदानिक परिणाम में सुधार के लिए प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेस की रोकथाम और उपचार की तत्काल आवश्यकता है। अस्थि मेटास्टेसिस का पशु मॉडल प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के प्रत्येक चरण में शामिल मल्टीस्टेज प्रक्रिया और आणविक तंत्र की खोज के लिए एक अनिवार्य उपकरण है, इस प्रकार चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करना और नवीन चिकित्सीय विकसित करना5.
प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के प्रयोगात्मक पशु मॉडल उत्पन्न करने के सबसे आम तरीकों में ऑर्थोटोपिक, इंट्रा-डायफिसिस (जैसे इंट्रा-टिबियल), और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन शामिल हैं। ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के साथ हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल सीधे माउस 6,7 के प्रोस्टेट में प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करके उत्पन्न होता है। इस प्रयोगात्मक पशु मॉडल में प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के समान नैदानिक विशेषताएं हैं। हालांकि, मेटास्टेसिस मुख्य रूप से एक्सिलरी लिम्फ नोड और फेफड़े में हड्डी 8,9 के बजाय होता है। प्रोस्टेट कैंसर के लिए इंट्रा-टिबियल इंजेक्शन मॉडल सीधे हड्डी (टिबिया) 10,11 में उच्च ट्यूमर गठन दर के साथ टिबिया में प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करता है; हालांकि, अस्थि प्रांतस्था और अस्थि मज्जा गुहा आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाते हैं। इसके अतिरिक्त, टिबियल इंजेक्शन विधि प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस की रोग प्रक्रिया को उत्तेजित नहीं कर सकती है जिसमें कैंसर कोशिकाएं परिसंचरण के माध्यम से हड्डी का उपनिवेश करती हैं। कैंसर कोशिकाओं की उच्च हड्डी मेटास्टेसिस दर के साथ परिसंचरण, संवहनी बहिर्वाह और दूरस्थ मेटास्टेसिस की जांच करने के लिए, माउस 8,12,13 के बाएं वेंट्रिकल में प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को सीधे इंजेक्ट करके एक इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन तकनीक विकसित की गई है। यह हड्डी मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान पशु मॉडल बनाताहै। इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन विधि लगभग 75% 9,14 की हड्डी मेटास्टेसिस दर दिखाती है, जो ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन विधि से बहुत अधिक है। इसलिए, इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के साथ एक पशु मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक आदर्श तरीका है।
इस काम का उद्देश्य प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेस के माउस मॉडल की स्थापना की प्रक्रिया का वर्णन करना है, जिससे पाठकों को मॉडल स्थापना की कल्पना करने की अनुमति मिलती है। वर्तमान काम एथिमिक चूहों में मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के माध्यम से हड्डी मेटास्टेसिस जेनोग्राफ्ट मॉडल उत्पन्न करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं, सावधानियां और चित्रण चित्र प्रदान करता है। यह विधि आणविक तंत्र और प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के विवो चिकित्सीय प्रभावों की खोज के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करती है।
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Protocol
छह से आठ सप्ताह के नर बीएएलबी/सी एथिमिक चूहों (एन = 10) को 12 घंटे के प्रकाश/अंधेरे चक्र की स्थितियों के तहत एक विशिष्ट-रोगज़नक़-मुक्त (एसपीएफ) पशु कक्ष में व्यक्तिगत रूप से हवादार चूहों के पिंजरों (5 चूहों / पिंजरे) में रखा गया था, जिसमें एसपीएफ फ़ीड और बाँझ पानी तक मुफ्त पहुंच थी। प्रयोगों से पहले चूहों को एक सप्ताह के लिए अनुकूली रूप से खिलाया गया था। सभी पशु प्रयोगों को पारंपरिक चीनी चिकित्सा के शंघाई विश्वविद्यालय की पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. सेल की तैयारी
- प्रोस्टेट कैंसर सेल इंजेक्शन के दिन, प्री-कोल्ड स्टेराइल पीबीएस (पीएच 7.4) के साथ 10 सेमी सेल कल्चर डिश में संवर्धित पीसी -3 कोशिकाओं (पीसी -3-ल्यूसिफेरस) लेबल वाले 80% -90% कंफ्लुएंट ल्यूसिफेरस को दो बार धोएं। 0.25% ट्रिप्सिन के 1.5 एमएल के साथ 3 मिनट के लिए ट्रिप्सिनाइज्ड करें, और 10% सीरम युक्त एफ -12 माध्यम के 6 एमएल के साथ ट्रिप्सिन को बुझाने के बाद कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
नोट: पीसी -3-ल्यूसिफेरस सेल लाइन को पीएलवी-ल्यूसिफेरस वेक्टर15 के साथ स्थानांतरित होने के बाद पीसी -3 सेल लाइन से लिया गया है। - एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें और सेल सस्पेंशन के 20 μL को सेल काउंटिंग प्लेट में स्थानांतरित करके सेल एकाग्रता की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 800 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
- सतह पर तैरनेवाला को छोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और एफ -12 माध्यम ( सामग्री की तालिका देखें) में सेल गोली को 1 x 107 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व तक पुन: निलंबित करें।
- इंजेक्शन तक कोशिकाओं को हर समय बर्फ पर रखें।
- कोशिकाओं को सर्जरी कक्ष में लाएं और 2 घंटे के भीतर सेल इंजेक्शन समाप्त करें।
नोट: सटीक इंजेक्शन खुराक सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सेल सस्पेंशन (आमतौर पर आवश्यकतानुसार दोगुनी मात्रा) तैयार करें (उदाहरण के लिए, सिरिंज के अंदर मृत स्थान से बचने के लिए)।
2. मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के लिए सर्जरी
नोट: इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाने वाला सर्जिकल उपकरण 1 एमएल सिरिंज है (चित्रा 1)। एनेस्थीसिया से जानवर की वसूली तक पूरी प्रक्रिया में थर्मल सहायता प्रदान करें।
- माउस को एसपीएफ पशु कमरे में रखें। एक सड़न रोकनेवाला कैबिनेट के भीतर निष्फल उपकरणों के साथ सभी प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
- 2 एल / मिनट ऑक्सीजन प्रवाह दर के तहत 98% ऑक्सीजन के साथ 2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें।
नोट: संज्ञाहरण के दौरान सूखापन से बचने के लिए माउस की आंखों पर थोड़ी मात्रा में नेत्र मरहम लगाएं। पूरी सर्जरी एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में करें। सुनिश्चित करें कि सेल इंजेक्शन से पहले माउस के पैर की उंगलियों को चुटकी मारकर माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज किया गया है। यदि प्रतिक्रियाएं (जैसे, एक झटका या चिकोटी) बनी रहती हैं, तो संज्ञाहरण प्रभावी होने के लिए अतिरिक्त समय की प्रतीक्षा करें। - माउस को एक सुपोन स्थिति में रखें और दोनों ऊपरी अंगों को मध्य रेखा से लंबवत रूप से फैलाएं (चित्रा 2 ए)।
- सर्जिकल चिपकने वाला टेप के साथ पेट से नीचे माउस को गतिहीन करें। कठोर दबाने और आंतरिक अंगों को विस्थापित करने से बचें (चित्रा 2 बी)।
नोट: स्थलाकृतिक शरीर रचना विज्ञान (यानी, चिपकने वाला टेप के साथ फिक्सिंग) को बनाए रखना आवश्यक है क्योंकि इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन अंधा है (यानी, दिल पर सटीक इंजेक्शन साइट नग्न आंखों के लिए अदृश्य है)। - 70% इथेनॉल स्वैब के साथ वक्ष की त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- पूर्वकाल छाती की दीवार के बीच में नीचे की ओर झुककर मध्य-उरोस्थि के सबसे निचले छोर पर अवसाद में माउस ज़िफॉइड प्रक्रिया की पहचान करें। पूर्ववर्ती छाती की दीवार के बीच से ऊपर की ओर झुककर मैनुब्रियम की ऊपरी सीमा पर केंद्रीय अवसाद में माउस जुगुलर नॉच की पहचान करें।
- मार्कर पेन (चित्रा 2 ए) के साथ एक्ज़िफॉइड प्रक्रिया और जुगुलर नॉच के सबसे हीन बिंदु को लेबल करें। इन दो स्थलों के बीच में एक तीसरा निशान बनाएं और तीसरे इंटरकोस्टल स्पेस में दिल के ठीक ऊपर दाईं ओर (जानवर के बाएं) थोड़ा सा निशान बनाएं।
नोट: इंजेक्शन की साइट मध्य रेखा के 1-2 मिमी बाईं ओर है, और इंजेक्शन बिंदु माउस की तीसरी और चौथी पसलियों के बीच है (चित्रा 2 ए)। - सेल सस्पेंशन के 200 μL को 1 mL सिरिंज में लोड करें।
नोट: सिरिंज में एक एयर बबल रखें, जैसा कि चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि रक्त स्पंदित है। लोड करने से पहले सेल सस्पेंशन को अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए। - इंजेक्शन साइट (चित्रा 2 डी) के माध्यम से लंबवत रूप से 26 ग्राम सुई डालें।
- सिरिंज को पकड़ने वाले हाथ को मेज पर स्थिर रखें, या इसे स्थिर रखने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज की लंबी धुरी इंजेक्शन साइट के लंबवत है, और सिरिंज को लगभग 2 मिमी चमड़े के नीचे डालें।
- सुई हब और / या सेल निलंबन में उज्ज्वल-लाल रक्त स्पंदन दिखाई देता है जब सुई की नोक को सही ढंग से बाएं वेंट्रिकल में डाला जाता है। यदि रक्त स्पंदन अदृश्य है, तो सुई की नोक दिल में नहीं है। सुई को मोड़ें और बदलें (यदि सुई के अंदर रक्त के थक्के रक्त स्पंदन को रोकते हैं)। सुई को एक बार फिर से डालें।
- कोशिकाओं को इंजेक्ट करें। सेल सस्पेंशन (100 μL) को 40-60 s में बहुत धीरे-धीरे इंजेक्ट करें और सिरिंज को पकड़ने वाले हाथ को हर समय स्थिर रखें।
नोट: सिरिंज में सेल निलंबन पर कड़ी नजर रखें, और सिरिंज के अंदर हवा के बुलबुले को दिल में इंजेक्ट न करें। - सुई को वापस लेने पर हेमोस्टेसिस सुनिश्चित करने के लिए 15 सेकंड के लिए सूखे कपास के फाहे के साथ इंजेक्शन साइट पर दबाव लागू करें।
- माउस को साफ पिंजरे में वापस करें और जानवर की निगरानी करें जब तक कि वह संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
- इंजेक्शन के बाद 24 घंटे के भीतर एक इनविवो बायोल्यूमिनेसेंस सिस्टम के साथ माउस की छवि बनाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कैंसर कोशिकाएं प्रणालीगत परिसंचरण में प्रवेश कर चुकी हैं।
नोट: सही ढंग से इंजेक्ट की गई कैंसर कोशिकाएं बाएं हृदय वेंट्रिकल के माध्यम से धमनी परिसंचरण में प्रवेश करती हैं, जो पूरे शरीर में दिखाई देने वाले बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नलिंग द्वारा देखी जाती है (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए देखें)। - विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में प्रदर्शन करें।
- उपकरण और कंप्यूटर चालू करें। उपकरण और कंप्यूटर पर पावर इंडिकेटर उज्ज्वल होने पर सॉफ़्टवेयर खोलें, और उसके बाद छवि अधिग्रहण विंडो खोलें।
- डिवाइस फलक में कंप्यूटर से कनेक्टेड इन विवो इमेजिंग सिस्टम की पहचान करें। माउस को लापरवाह स्थिति में इमेजिंग कक्ष में चित्रित करने के लिए रखें। फिर इमेजिंग कक्ष का दरवाजा बंद करें।
- छवि अधिग्रहण विंडो में उपलब्ध कराए गए सेटिंग फलक पर पैरामीटर सेट करें।
- छवियों को स्पष्ट करने के लिए लेंस > ज़ूम > 1x, लेंस > फोकस > 108 और लेंस > आइरिस > एफ 2.8 के साथ पैरामीटर सेट करें।
- फ़िल्टर &लाइट में शूटिंग चैनल सेट करें : फ़िल्टर &लाइट > फ़िल्टर > ल्यूमिनेसेंस > फ़िल्टर&लाइट > ऑफ़, और बीच > प्रकाश तीव्रता > फ़िल्टर&लाइट फ़िल्टर करें।
- ली जाने वाली छवि का प्रकार सेट करें: इमेजिंग > टाइप > सिंगल-फ्रेम, इमेजिंग > एक्सपोजर टाइम 500 एमएस >, इमेजिंग > एचडीआर मोड > लो गेनमोड। छवि प्राप्त करने के लिए अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें।
- विवो बायोल्यूमिनेसेंस के साथ मेटास्टैटिक कैंसर के विकास की कल्पना करें।
नोट: विज़ुअलाइज़ेशन के प्रत्येक समय बिंदु पर, इंट्रापरिटोनियल रूप से 200 μL लूसिफेरिन सब्सट्रेट को 20 ग्राम माउस (150 मिलीग्राम / किग्रा) में इंजेक्ट करें और संज्ञाहरण से पहले 15 मिनट प्रतीक्षा करें (2% आइसोफ्लुरेन एक प्रेरण कक्ष में 98% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित है)। माउस को बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम प्लेटफॉर्म पर रखें। 2% आइसोफ्लुरेन के साथ नाक मास्क के माध्यम से संज्ञाहरण बनाए रखें।
3. पैथोलॉजिकल जांच
- सेल इंजेक्शन के चार सप्ताह बाद, सीओ2 इनहेलेशन और फिर ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस का बलिदान करें।
- माउस को लापरवाह स्थिति में स्थिर करें। कैंसर के घावों और/ या पैथोलॉजिकल परिवर्तनों के लिए पेट और वक्ष में सभी अंगों को उजागर करने और पूरी तरह से जांच करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ पेट से वक्ष तक एक ऊर्ध्वाधर चीरा (लगभग 6 सेमी) बनाएं।
नोट: एक इंट्रा-कार्डियक कैंसर सेल इंजेक्शन अध्ययन के लिए, दिल से सटे मीडियास्टिनम में कैंसर के घाव गलत तरीके से कैंसर कोशिकाओं का सुझाव देते हैं (कोशिकाओं को बाएं कार्डियक वेंट्रिकल में इंजेक्ट नहीं किया जाता है); इसलिए, इन चूहों को अंतिम डेटा संग्रह में शामिल नहीं किया गया है। - कैंची के साथ मेटास्टैटिक ट्यूमर का उत्पादन। सूत्र V = 1/2 × a × b2 का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा (V) की गणना करने के लिए कैलिपर्स का उपयोग करके ट्यूमर के लंबे व्यास (ए) और छोटे व्यास (बी) को मापें, और इलेक्ट्रॉनिक पैमाने का उपयोग करके ट्यूमर का वजन करें।
- पैराफिन में एम्बेड करने के बाद 10% फॉर्मेलिन समाधान में ट्यूमर के ऊतकों को ठीक करें। वैकल्पिक रूप से, तरल नाइट्रोजन में ट्यूमर को स्नैप-फ्रीज करें।
- मेटास्टैटिक घावों के साथ हड्डियों (पिछले अंग, कशेरुक, और / या पसलियों) का उत्पादन। त्वचा और मांसपेशियों को हटाने के बाद 24 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन घोल के 20 मिलीलीटर वाले 50 एमएल ट्यूब में प्रत्येक माउस के नमूने को ठीक करें, इसके बाद लगातार बफर परिवर्तन (हर 3 दिन) के साथ 10% ईडीटीए समाधान में 14 दिनों के लिए डीकैल्सीफिकेशन करें।
- पैराफिन में नमूना एम्बेड करें और नियमित हिस्टोलॉजिकलपरीक्षा के लिए नमूने को अनुभाग करें।
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Representative Results
बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन मॉडल के लिए मेटास्टैटिक घाव के विकास की निगरानी में जबरदस्त फायदे प्रदान करता है। कैंसर सेल इंजेक्शन (24 घंटे के भीतर) के तुरंत बाद, सामान्य परिसंचरण में प्रवेश करने वाली कैंसर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया गया था (चित्रा 3 ए)। पूरे शरीर में स्पष्ट बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नलिंग तब देखा जाएगा जब कैंसर कोशिकाओं को धमनी परिसंचरण में ठीक से इंजेक्ट किया जाता है। केवल इंजेक्शन साइट (हृदय) पर बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल दिखाने वाले चूहों के डेटा को अंतिम डेटा संग्रह से बाहर रखा जाना चाहिए। सेल इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद पिछले अंगों में मेटास्टैटिक घाव देखे गए (चित्रा 3 बी-डी)। जैसे-जैसे समय आगे बढ़ा, मेटास्टैटिक घाव बड़े हो गए और उरोस्थि, पसलियों और जबड़े सहित अन्य साइटों में दिखाई दिए।
एक्स-रे छवियों ने हड्डी में मेटास्टैटिक घावों का प्रतिनिधित्व करने वाली हड्डी के विनाश को दिखाया (चित्रा 4 ए)। माइक्रो-सीटी स्कैनिंग द्वारा हड्डियों के विनाश का भी पता लगाया गया था। माइक्रो-सीटी स्कैनिंग 3 डी मोड में 3 डीकैल्क, शंकु पुनर्निर्माण और एक मॉडल विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन से जुड़े माइक्रो-सीटी (μCT80) का उपयोग करके किया गया था। 3 डी मॉडल बनाने के लिए बिटमैप डेटा का पुनर्निर्माण प्राप्त किया गया था। समीपस्थ टिबिया में हड्डी के विनाश की एक प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी छवि चित्रा 4 बी में दिखाई गई है। मेटास्टैटिक घावों को एच एंड ई धुंधला (चित्रा 4 सी) द्वारा पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों में और पुष्टि की गई थी।
चित्र 1: शल्य चिकित्सा उपकरण। एक 1 एमएल सिरिंज। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं का इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन । (ए) पैनल जुगुलर नॉच, एक्ज़िफॉइड प्रक्रिया, रिब पिंजरे (कम मार्जिन), और मध्य रेखा को दर्शाता है। इंजेक्शन साइट xiphoid प्रक्रिया और जुगुलर नॉच से समान दूरी पर है। (बी) इंजेक्शन के दौरान माउस आंदोलन को रोकने के लिए सर्जिकल टेप का उपयोग पेट में क्षैतिज रूप से किया जाता है। (सी) सेल निलंबन और एक एयर बबल की उपस्थिति से भरी एक सिरिंज। हवा का बुलबुला रक्त स्पंदन की कल्पना करने में मदद करता है। (डी) सुई को इंजेक्शन साइट के माध्यम से लंबवत रूप से डाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम के साथ इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन मॉडल की पुष्टि। (ए) बाएं हृदय वेंट्रिकल में पीसी -3 कोशिकाओं (1 × 106 कोशिकाओं) को इंजेक्ट करने के 24 घंटे बाद एक पुरुष एथिमिक माउस के विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में। प्रणालीगत परिसंचरण में सही ढंग से इंजेक्ट किए गए कैंसर कोशिकाओं को पूरे शरीर से जारी बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल द्वारा देखा जाता है। (B-D) प्रगतिशील मेटास्टेसिस विकास प्रदर्शित करने वाले प्रतिनिधि माउस की बायोल्यूमिनेसेंस छवियां। (बी) इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को दिखाने वाली एक छवि। (सी) इंजेक्शन के 3 सप्ताह बाद प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को दिखाने वाली एक छवि। (डी) इंजेक्शन के 4 सप्ताह बाद प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं को दिखाने वाली एक छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्रोस्टेट कैंसर सेल-प्रेरित हड्डी मेटास्टेस के विभिन्न पहचान विधियां। (ए) एक प्रतिनिधि एक्स-रे छवि; लाल तीर समीपस्थ टिबिया में हड्डी के विनाश को दर्शाता है। (बी) टिबिया की एक प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी छवि। (सी) प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं की हड्डी मेटास्टेसिस दिखाने वाली एच एंड ई छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
हड्डी मेटास्टेसिस उत्पन्न करने के लिए मानव प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं का इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस के कार्यों और तंत्र की खोज और चिकित्सीय प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श माउस मॉडल है। अध्ययनों से पता चला है कि हड्डी की क्षति सबसे अधिक समीपस्थ टिबिया और डिस्टल फीमर17 में होती है, जो उनके उच्च वैस्कुलराइजेशन और चयापचय गतिविधि के कारण हो सकती है।
चूंकि हड्डी मेटास्टेसिस स्तन कैंसर के रोगियों में अक्सर देखा जाने वाला मेटास्टैटिक घाव है, इसलिए स्तन कैंसर कोशिकाओं के इंट्राकार्डियक इंजेक्शन द्वारा उत्पादित हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल का उपयोग आमतौर पर स्तन कैंसर18,19 पर अध्ययन में भी किया जाता है। इसलिए, वर्तमान काम स्तन और प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं के साथ एक इंट्राकार्डियक इंजेक्शन-निर्मित हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल विकसित करने में मदद कर सकता है।
लगातार ट्यूमर गठन के लिए, कुछ महत्वपूर्ण विचार हैं। संस्कृति से अलगाव के बाद कोशिकाओं को जल्द से जल्द इंजेक्ट किया जाना चाहिए। कैंसर सेल इंजेक्शन के बाद चूहों को प्रयोगात्मक समूहों में यादृच्छिक किया जाना चाहिए। इंजेक्शन की मात्रा सुसंगत होनी चाहिए और एक ही व्यक्ति को एक ही तकनीक का उपयोग करके सभी चूहों को कैंसर कोशिकाओं को इंजेक्ट करना चाहिए।
पूरी प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं। यदि इंजेक्शन साइट सही ढंग से स्थित है, तो इंजेक्शन के दौरान स्पंदनित रक्त देखा जाना चाहिए। सिरिंज को पकड़ने वाले हाथ की स्थिरता का नुकसान और सिरिंज प्लंजर को आगे बढ़ाते समय सुई की स्थिति में बदलाव संभावित समस्याएं हैं। अंदर एक रंगीन हब के साथ एक सिरिंज रक्त स्पंदन को आसानी से देखता है। यदि सुई डालते समय सुई हब में हवा के बुलबुले दिखाई देते हैं (फेफड़ों में गलत सम्मिलन का संकेत देते हैं), तो सुई को हटा दिया जाना चाहिए और स्थानांतरण के बाद फिर से डाला जाना चाहिए। यदि सुई हब में कोई लाल रक्त नाड़ी नहीं है, लेकिन इंजेक्शन लगाने वाले व्यक्ति को विश्वास है कि इंजेक्शन साइट सही है, तो कार्डियक वेंट्रिकल में इंजेक्शन को सत्यापित करने के लिए सिरिंज प्लंजर को थोड़ा खींचें। कैंसर सेल इंजेक्शन के 2-3 सप्ताह के बाद मेटास्टेसिस की कमी गलत इंजेक्शन का संकेत देती है। इंजेक्शन20 के बाद 24 घंटे के भीतर बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग द्वारा पूरे शरीर में कैंसर सेल परिसंचरण की पुष्टि करें। बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नलिंग पूरे शरीर में देखी जा सकती है यदि कैंसर कोशिकाओं को कार्डियक वेंट्रिकल में सटीक रूप से इंजेक्ट किया गया था। इसके अलावा, मेटास्टैटिक दर, स्थान और मेटास्टैटिक ट्यूमर की संख्या विभिन्न सेल लाइनों 8,21 में भिन्न हो सकती है।
सर्जरी के बाद, चूहों को नियमित रूप से जांच की जानी चाहिए। सर्जरी और एनेस्थेटिक एक्सपोजर के कारण, चूहों को महत्वपूर्ण संकट का अनुभव हो सकता है या यहां तक कि मर भी सकते हैं। इसलिए, सर्जरी के बाद पहला सप्ताह महत्वपूर्ण है, और चूहों की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए। हड्डी मेटास्टेसिस प्रयोग के दौरान, चूहों को गतिविधि के स्तर, गतिशीलता और कैशेक्सिया की शुरुआत के लिए दैनिक निगरानी की जानी चाहिए (चूहों में एक पैरानियोप्लास्टिक सिंड्रोम जो वजन घटाने, मांसपेशियों के शोष और कमजोरी, धनुषाकार उपस्थिति और सुस्ती22,23 की विशेषता है)। चूहों को इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए जब उनके शरीर के वजन का 10% -20% खो जाता है; ट्यूमर की प्रगति गतिशीलता को बाधित करती है (उदाहरण के लिए, लंबी हड्डी का फ्रैक्चर, सिर झुकाव, पैराप्लेजिया); या चूहे श्वसन संकट में प्रतीत होते हैं24.
इस मॉडल का लाभ यह है कि हड्डी में पाए गए कैंसर कोशिकाओं ने "मिट्टी को बीज दिया" 25, इस प्रकार प्रसारित कैंसर कोशिकाओं के सूक्ष्म-मेटास्टेस गठन की अधिक प्राकृतिक प्रगति की नकल की। इस मॉडल की भी कई सीमाएं हैं। यह इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों का उपयोग करके एक जेनोग्राफ्ट कैंसर मॉडल है। यह मॉडल हड्डी मेटास्टेसिस माइक्रोएन्वायरमेंट में कैंसर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए फायदेमंद नहीं है। यह अनुमान लगाया गया है कि मॉडलिंग के दौरान लगभग 30% चूहे मर जाएंगे; इसलिए, अभ्यास मॉडल विकास की सफलता दर में काफी सुधार करेगा। इसके अलावा, मेटास्टेसिस घाव मस्तिष्क, फेफड़े और गुर्दे में भी हो सकता है; कई मेटास्टेस का गठन हड्डी मेटास्टेसिस तंत्र 9,26,27,28 के अध्ययन में हस्तक्षेप करता है। हालांकि हड्डी मेटास्टेसिस दर ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन की तुलना में इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन द्वारा बहुत अधिक है, इंट्रा-कार्डियक इंजेक्शन तकनीक 100% 9,14 के बजाय लगभग 75% की हड्डी मेटास्टेसिस दर दिखाती है। कम दक्षता इसलिए हो सकती है क्योंकि इंजेक्शन वाली कैंसर कोशिकाएं रक्त परिसंचरण में प्रवेश करने में विफल रहीं या हृदय या फेफड़े को भेदने वाली सुई के कारण कार्डियक इंजेक्शन के दौरान प्राप्तकर्ता माउस की मृत्यु हो गई।
इन सीमाओं के बावजूद, प्रोस्टेट कैंसर हड्डी मेटास्टेसिस का यह स्थापित माउस मॉडल हड्डी और कैंसर क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने और कैंसर की प्रगति को रोकने और मेटास्टेसिस-प्रेरित हड्डी विनाश के चक्र को बाधित करने के लिए संभावित चिकित्सीय का मूल्यांकन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण साबित हुआ है।
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Disclosures
सभी लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यह काम चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2018YFC1704300 और 2020YFE0201600), राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (81973877 और 82174408), शंघाई विश्वविद्यालय के पारंपरिक चीनी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2021LK047) के बजट के भीतर अनुसंधान परियोजनाओं और अस्पताल टीसीएम तैयारी के औद्योगिक परिवर्तन के शंघाई सहयोगी नवाचार केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes and needles | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | The cells were injected into the ventricles of mice |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | Equipment for anesthetizing mice |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | For counting cells |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | Male | 6-8 week old, male mice |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | For tracking the tumor growth and pulmonary metastasis if the injected cells are labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | |
| EDTA solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | G1105 | For decalcification of bone tissure |
| F-12 medium | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 21700075, GIBCO | Cell culture medium |
| Formalin solution | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | BL539A | For fixing the specimen of each mouse |
| Isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | For anesthesia |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027, Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| PC-3 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | TCHu 158 | Prostate cancer cell line |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | Wash the human osteosarcoma cells |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | For detaching the cells |
| Vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid for transfection |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | For obtaining x-ray images to detect tumor growth |
| μCT80 | Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd | Scanco Medical AG,Switzerland | For detection of bone destruction. The mico-CT is equipped with 3DCalc, cone reconstruction, and μCT Ray V3.4A model visualization software. |
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