Summary
I dette arbejde beskrives en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gæren Saccharomyces cerevisiae . Denne metode er især nyttig til kvantificering af præzygotiske barrierer i specieringsundersøgelser.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae er en meget anvendt modelorganisme inden for genetik, evolution og molekylærbiologi. I de senere år er det også blevet en populær modelorganisme at studere problemer relateret til speciering. Gærens livscyklus involverer både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. Den lette udførelse af evolutionseksperimenter og organismens korte generationstid giver mulighed for undersøgelse af udviklingen af reproduktive barrierer. Den effektivitet, hvormed de to parringstyper (a og α) parrer sig for at danne a/α-diploide, kaldes parringseffektiviteten. Ethvert fald i parringseffektiviteten mellem haploider indikerer en præ-zygotisk barriere. For at kvantificere omfanget af reproduktiv isolation mellem to haploider kræves der således en robust metode til at kvantificere parringseffektiviteten. Til dette formål præsenteres en enkel og meget reproducerbar protokol her. Protokollen involverer fire hovedtrin, som inkluderer lapning af haploider på en YPD-plade, blanding af haploider i lige store mængder, fortynding og plettering for enkeltkolonier og endelig beregning af effektiviteten baseret på antallet af kolonier på en drop-out plade. Auxotrofiske markører anvendes til klart at skelne mellem haploider og diploider.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, almindeligvis kaldet spirende gær, er en encellet eukaryot. Den har to parringstyper, a og α, og udviser både aseksuelle og seksuelle reproduktive cyklusser. A- og α parringstyperne er haploider og kan dele sig mitotisk i fravær af den anden parringstype i det omgivende miljø, som repræsenterer gærens aseksuelle cyklus. Når de to parringstyper er tæt på hinanden, holder de op med at dele sig mitotisk og smelter sammen for at danne en diploid celle. Den diploide gær kan enten opdele mitotisk, når næringsstoffer er til stede eller gennemgå meiose under betingelserne for kvælstofsult i nærværelse af en dårlig kulstofkilde, der ikke kan fermenteres, såsom acetat1. Dette resulterer i dannelsen af sporer, som forbliver sovende, indtil der er gunstige vækstbetingelser. Livscyklussen er afsluttet, når disse sporer spirer, og de to haploide typer frigives tilbage til den haploide pulje 2,3 (figur 1).
Parring af gærceller indbefatter flere trin, såsom agglutination, dannelse af en parringsprojektion eller "shmoo" efterfulgt af celle- og nuklear fusion 4,5. De to parringstyper a og α producerer henholdsvis a-faktor og α-faktor for at indlede parring. Disse faktorer er polypeptidferomoner, der binder til receptorerne (Ste2 og Ste3), der er til stede på celleoverfladen af den modsatte parringstype5. Bindingen af feromonerne til receptorerne initierer feromonresponsvejen, den mitogenaktiverede proteinkinase (MAPK) signaltransduktionsvej 6,7,8. Dette resulterer i anholdelse af cellecyklussen i G1-fasen, hvilket fører til en metabolisk aktiv stationær fase9. Cellerne holder derefter op med at dele sig mitotisk, og de proteiner, der kræves til parring, syntetiseres. Da de haploide celler ikke kan bevæge sig mod hinanden, er en parringsprojektion eller "shmoo" rettet mod parringspartneren. Når cellerne kommer i kontakt, nedbrydes cellevæggen, og det cytoplasmatiske indhold smelter sammen, hvilket resulterer i parring til dannelse af en diploid celle10,11. Parringseffektiviteten mellem haploider er blevet brugt som et mål for speciering i laboratorieudviklede stammer såvel som mellem eksisterende arter12.
At være en simpel eukaryot organisme er gær den valgte model for et stort antal forskningsspørgsmål forbundet med komplekse eukaryote organismer. Et sådant spørgsmål er forbundet med speciering og udviklingen af reproduktive barrierer13,14. For seksuelt reproducerende organismer defineres en art af det biologiske artskoncept (BSC) foreslået af Ernst Mayr15. Ifølge dette koncept siges to individer i en befolkning at tilhøre to forskellige arter, hvis de ikke kan krydse hinanden og er reproduktivt isoleret. Nedbrydning af den seksuelle reproduktive cyklus (som involverer fusion af kønsceller til dannelse af en zygote, udviklingen af zygoten til et afkom og opnåelse af seksuel modenhed hos afkommet) fører til reproduktiv isolation. Som vist i figur 1 er livscyklussen for S. cerevisiae sammenlignelig med den seksuelle reproduktionscyklus: a) fusionen af de to parringstyper a og α svarer til fusionen af kønsceller i seksuelt reproducerende organismer; b) diploidens evne til at gennemgå mitotisk opdeling svarer til, at zygoten udvikler sig til afkom; og c) den diploide, der gennemgår sporulation, er sammenlignelig med processen med gametogenese14.
Pre-zygotisk isolering opstår, når assortativ parring observeres. Givet lige mulighed for at parre sig med to genetisk forskellige a-typer , parrer en α type fortrinsvis med den ene frem for den anden eller omvendt14. I tilfælde af evolutionseksperimenter, hvor haploider er blevet udviklet i forskellige miljøer, kan tilstedeværelsen af en præparringsbarriere bestemmes ved at udføre et parringsassay. Et fald i parringseffektiviteten sammenlignet med forfaderen indikerer udviklingen af en præparringsbarriere. Postzygotisk isolation kan opstå på grund af diploidens manglende evne til at gennemgå effektiv mitotisk deling og/eller sporulation til dannelse af haploide sporer14. Disse kan kvantificeres ved at måle henholdsvis diploidernes væksthastighed og beregne sporulationseffektiviteten. For at studere udviklingen af reproduktive barrierer kræves der derfor robuste metoder til kvantificering af (a) parringseffektiviteten, (b) den mitotiske vækst af diploiden og (c) diploidens sporulationseffektivitet. I dette arbejde rapporteres en robust metode til at kvantificere gærstammernes parringseffektivitet.
I laboratorieforsøg er en af måderne, hvorpå forekomsten af parring kan detekteres, ved hjælp af auxotrofe markører, der supplerer ernæringskravene. Når de to parringstyper er auxotrofe for to forskellige aminosyrer, kan kun den diploide celle dannet ved fusion af de to parringstyper vokse på et medium, der mangler begge aminosyrer. Således er auxotrofe markører nyttige til påvisning af parring både kvalitativt og kvantitativt. En kvalitativ test vil være tilstrækkelig til at identificere parringstypen af en stamme efter meiose16. Kvantitative tests er afgørende, når man er interesseret i at identificere en reduktion i parring, mens man studerer de gener, der er involveret i parringsvejen17,18. Da gær i stigende grad anvendes i specieringsundersøgelser, er det desuden nødvendigt med et praktisk og reproducerbart parringsassay, da kvantificeringen af parringseffektiviteten er et mål for den præzygotiske barriere.
Parringseffektiviteten mellem de to gærparringstyper er tidligere blevet kvantificeret16,19,20. De fleste af de tidligere anvendte metoder er ens i deres design med nogle få variationer 16,21,22,23,24,25. Nogle af dem bruger tidlige logfasekulturer, mens nogle få andre bruger mid-log fasekulturer af haploide stammer. Der er variationer i forholdene, hvor de to parringstyper blandes. Næsten alle protokollerne bruger en nitrocellulosemembran. Suspensioner af begge parringstyper taget fra tidligere dyrkede kulturer blandes og filtreres på en nitrocellulosemembran anbragt på en YPD-plade. I en af variationerne af protokollen lappes den haploide suspension direkte på en YPD-plade21. I forsøg, der beskæftiger sig med de gener, der er involveret i feromonproduktionen af de to parringstyper, tilsættes feromonerne eksternt, mens suspensionerne af de to parringstyperfremstilles 24.
Efter inkubation i et par timer (typisk ca. 5 timer) efter blanding af haploider vaskes cellerne fra membranen, fortyndes og belægges på selektive medier. I en af de tidligere metoder, der blev rapporteret i 1973, blev effektiviteten af zygotdannelse eller parring beregnet ved at tælle antallet af spirende celler, unbudded celler og parringspar under et mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer26. Imidlertid bruger de fleste metoder, der rapporteres senere, auxotrofiske markører til at skelne haploider og diploider. Parringseffektivitet beregnes som procentdelen af diploide celler i forhold til antallet af diploide og haploide celler i den cellulære pulje 16,21,23.
På trods af en række rapporter, der bruger gær som modelorganisme til at studere speciering, er der imidlertid ingen standardiseret protokol rapporteret i litteraturen indtil nu til beregning af effektiviteten af parring. Celler i logfasen er muligvis ikke ideelle til kvantificering af parringseffektivitet. Under parring arresteres cellecyklussen for de to haploider, og cellerne under parring deler sig derfor ikke9. Da cellecyklussen også vides at være arresteret på samme måde i celler i den stationære fase27, kan brug af sådanne celler gøre protokollen mere reproducerbar. Stationære faseceller kan blandes og lægges på YPD-plader (dvs. et ernæringsrigt miljø) til parring. De konventionelle procedurer kræver også en nitrocellulosemembran og vask af cellerne, hvilket gør processen besværlig og udsat for håndteringsfejl. Derudover kvantificerer de hidtil anvendte protokoller parringseffektiviteten i form af en haploid. Ved måling af reproduktiv isolation kvantificeres parringseffektiviteten imidlertid for en bestemt kombination af haploider snarere end en enkelt haploide.
For at løse disse problemer rapporterer vi her en robust metode til kvantificering af parringseffektivitet i gær, der er meget reproducerbar og nem at bruge. Desuden kan denne metode og de gærstammer, der anvendes her, også bruges i undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på udviklingen af parringsbarrierer.
To forskellige stammer af S. cerevisiae blev anvendt i denne undersøgelse. En af stammerne stammer fra SK1-baggrunden; dette blev ændret i vores laboratorium ved at tilføje de auxotrofiske markører nær MAT-locus. De resulterende genotyper af haploider er angivet i tabel 128,29,30. I SK1-stammen havde a-haploiden TRP1-genet indsat nær MAT-locus, og den α haploid havde LEU2-genet indsat nær MAT-locus. I ScAM-stammen blev TRP1- og URA3-generne indsat i henholdsvis a- og α-haploider. Placeringen af indsættelsen var i ARS-regionen af kromosom III (Chr III: 197378..197609). For den protokol, der er rapporteret her, ville auxotrofe markører overalt på genomet være tilstrækkelige. At have de auxotrofe markører nær MAT-locus betyder imidlertid, at disse stammer også kan bruges til undersøgelser, der undersøger effekten af genflow på speciering31,32. Markørerne blev tilføjet tæt på MAT-locus for at forhindre omrokering af markørerne på grund af rekombination. Derfor kan denne protokol bruges til at kvantificere parringseffektivitet i undersøgelser, der involverer speciering, og også til at identificere ændringen af parringseffektivitet, når man studerer proteinerne involveret i parringsvejen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen involverer stort set følgende trin: (1) lapning af haploider i parringseffektivitetsgitterene på en YPD-plade, (2) blanding af haploider i lige stort antal efter 24 timers inkubation og give de blandede haploider et par timer til at parre sig (7 timer i denne undersøgelse), (3) plettering af de blandede celler på YPD til isolering af enkeltkolonier efter 7 timer ved 30 °C, og endelig (4) bestemmelse af antallet af diploider dannet ved anvendelse af de auxotrofe markører. Disse trin diskuteres detaljeret nedenfor (se også figur 2).
1. Patching af haploider i parringseffektivitetsgitterene
- Genopliv haploider a og α fra fryselagre ved at stribe på en YPD-agarplade (2% agar, 2% dextrose, 1% pepton, 0,5% gærekstrakt), og lad dem vokse i 48 timer ved 30 °C for at opnå isolerede enkeltkolonier.
- Pod enkelte kolonier fra YPD-pladen i 5 ml YPD-medium (2% dextrose, 1% pepton, 0,5% gærekstrakt) og inkuber ved 30 °C i 48 timer med 250 rpm omrystning. Cellerne er i den stationære vækstfase efter denne inkubationsperiode.
- Tegn et parringseffektivitetsgitter på en frisk YPD-plade. Tegn gitteret som et rektangel på 1 cm x 1,5 cm, der er opdelt i tre kasser, således at hver har en dimension på 1 cm x 0,5 cm, som vist i figur 2A.
- Patch 5 μL af YPD-kulturen af de to parringstyper på rektanglerne længst til venstre og yderst til højre (figur 2B). Dette volumen svarer til ca. 5 x 105 haploide celler lagt ud i hver sektion. Pladerne inkuberes i 24 timer ved 30 °C.
BEMÆRK: Formålet med gitteret er at gøre de eksperimentelle målinger præcise (såsom antallet af celler i eksperimentet). Gitterstørrelsen er lille nok til, at den er eksperimentelt medgørlig, men stor nok til, at den let kan manipuleres (som at løfte celler fra et gitter) og ikke modtagelig for drift eller tilfældige begivenheder.
2. Blanding af haploider og parring
BEMÆRK: Efter 24 timer (figur 2C) skrabes et lige antal celler af de to haploide typer af de to gitter, blandes og lægges i midterrektanglet (figur 2D).
- For at blande et lige antal celler fjernes ca. 1/3 af plasteret, der blev lagt i de ydre kasser ved hjælp af en steril tandstikker, og resuspenderes i 20 μL vand i et sterilt 1,5 ml hætteglas for hver af haploider.
- 5 μL af denne suspension fortyndes i 2 ml vand. OD for denne fortyndede suspension måles ved hjælp af et spektrofotometer ved 600 nm. Bland et lige antal celler fra de to stammer baseret på OD-værdien og antallet af celler / ml i 1 OD for den pågældende stamme. Det volumen, der skal blandes, beregnes, og det suges ud af de resterende 15 μL af den individuelle haploide suspension.
BEMÆRK: Antallet af celler, der er lappet i det midterste rektangel, er sådan, at cellerne danner et monolag. I betragtning af at gærcellen er en kugle med en radius på 2,58 μm33, ville en rektangulær kasse på 1 cm x 0,5 cm have brug for ca. 1,7 x 106 celler for at danne et monolag. Der bør udvises forsigtighed for at sikre, at der ikke er nogen fysisk berøring mellem cellerne, der er plastret til parring, og de to haploide cellegitter. Da lige mange af hver type haploide celler skal blandes, tilsættes 8,5 x 105 celler fra hver stamme. Celletallet beregnes ud fra OD-målinger, idet 1 OD ved 600 nm anses for at svare omtrent til 1 x 107 celler34. For eksempel, hvis OD600 af en haploid suspension er 0,17, og den α haploide er 0,11, kan antallet af celler i 5 μL af hver haploide suspension beregnes. For at sikre 8,5 x 105 celler af hver haploide type blandes 1,25 μL af a haploid og 1,93 μL af de α haploide suspensioner. - Tilsæt de nødvendige mængder af begge haploider i et frisk og sterilt 1,5 ml hætteglas, og bland godt med en pipette. Det endelige volumen af denne suspension er generelt omkring 6-8 μL. Patch denne suspension i midtergitteret. Pladen inkuberes ved 30 °C i 7 timer, så haploiderne får tilstrækkelig tid til at parre sig (figur 2E).
3. Plating af blandede celler på YPD agar
- Efter inkubationsperioden på 7 timer skrabes cellerne fra midterrektanglet ved hjælp af et tandstikker eller en pipettespids og fortyndes i 2 ml sterilt vand. Spred derefter cellesuspensionen på YPD-agar for at opnå enkeltkolonier. For at bestemme den fortyndingsfaktor, der er nødvendig for at opnå enkeltkolonier, måles OD for det første rør, hvori de skrabede celler tilsættes. Der skal bestemmes specifikke fortyndingsfaktorer for hver celletype/stamme, der anvendes.
BEMÆRK: For eksempel svarer en OD600 på 0,15 til 3 x 106 celler i en 2 ml suspension (overvejer 1 OD = 1 x 107 celler / ml). For at opnå et par hundrede kolonier på YPD-pladen fortyndes cellesuspensionen serielt ved 1:20 to gange, og derefter anvendes 100 μL af den endelige fortynding til spredning. - Efter plettering inkuberes YPD-pladerne ved 30 °C i 36-48 timer, indtil der er enkelte kolonier. Sørg for, at der opnås et par hundrede individuelle kolonier fra hvert parringsforsøg til screening for at sikre, at statistisk signifikans kan påvises i dataene (figur 2F).
4. Screening for diploider ved hjælp af auxotrofiske markører
- Bestem, hvilken brøkdel af de opnåede kolonier der er diploide. For at identificere de diploide kolonier på pladen overføres de enkelte kolonier ved at stribe dem individuelt på en dobbelt drop-out plade (2% glucose, 0,66% nitrogenbase, 0,05% dobbelt drop-out aminosyreblanding og 2% agar), der mangler aminosyrerne, som stammerne er auxotrofe for, som vist i figur 2G. Pladerne inkuberes ved 30 °C i 48 timer.
BEMÆRK: Kolonierne kan også overføres til den dobbelte drop-out plade ved hjælp af replika plettering. I denne undersøgelse blev tryptofan og leucin (trp-leu−) drop-out-medium anvendt til kvantificering af SK1AM-stammernes parringseffektivitet, og tryptofan og uracil (trp-ura−) drop-out-medium blev brugt til ScAM-stammerne. Kun de diploide kolonier vokser på den dobbelte drop-out plade, da de har både de auxotrofe markører: TRP1 og LEU2 gener i SK1AM stammerne og TRP1 og URA3 gener i ScAM stammerne. - Derudover skal du stryge eller replika plade kolonierne på enkelte drop-out medier (trp - eller leu - eller ura - ) for at kvantificere frekvensen af hver af de to slags haploide i befolkningen.
- Beregn parringseffektiviteten, η, som følger:
Eq (1)
hvor antallet af parrede haploider simpelthen er lig med det dobbelte af antallet af diploider, der er identificeret på den dobbelte drop-out-plade (da hver diploide var resultatet af parring af to haploider). Det samlede antal haploider er lig med summen af antallet af haploider stribet plus det dobbelte af antallet af diploider stribet.
BEMÆRK: For eksempel, hvis kun 60 kolonier vokser efter striber / replika plettering 100 kolonier på et dobbelt drop-out medie, kan parringseffektiviteten kvantificeres som 75% (da 60 x 2 haploider parrede sig for at danne de 60 diploider, og 40 haploider ikke parrede sig).
Eq (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantificering af parringseffektiviteten af de to parringstyper
Protokollen beskrevet her blev brugt til at kvantificere parringseffektiviteten mellem to gærstammer - mellem SK1AM a og SK1AM α og mellem ScAMa og ScAMα (figur 3A). I disse eksperimenter blev parringen mellem de to haploider gentaget mindst 12 gange. I hver af gentagelserne af eksperimentet blev mindst 100 kolonier stribet på dobbelt drop-out medier. Protokollens robusthed muliggjorde let differentiering af parringseffektiviteten mellem de to stammer, SK1AM og ScAM. Mens SK1-stammerne parrede sig med en meget høj effektivitet, parrede ScAM-stammerne sig med en relativt lavere effektivitet (figur 3A). Dette er måske ikke overraskende, da ScAM-stammerne stammer fra hybrid parring mellem S. cerevisiae og S. carlsbergensis stammer35.
Ud over at skelne parringseffektiviteten mellem stammerne kan denne metode også bruges til at kvantificere forskellene i stammernes parringseffektivitet på tværs af forskellige miljøer. Som vist i figur 3B faldt SCAM-stammernes parringseffektivitet betydeligt, når miljøet ikke indeholdt glukose som primær kulstofkilde. Parring er en energisk dyr proces, og vækst på alternative kulstofkilder reducerer kvalitativt effektiviteten af parring.
Dynamik af parringseffektivitet
Metodens høje repeterbarhed giver også mulighed for at spore dynamikken i parringseffektiviteten. Når man fik lov til at parre sig i forskellige tidsperioder (figur 3C), blev der ikke observeret parring i de første 4-5 timer; De første diploider optrådte først efter denne varighed. Formentlig er dette den tid, der er nødvendig for, at parringsprocessen kan afsluttes i det givne miljø. Derefter steg parringseffektiviteten hurtigt. Men ud over 7 timer påvirkes parringseffektivitetsberegninger af, at mitotisk vækst begynder at ske på pladen. Identifikation og udvælgelse af tidlige eller sene diploider på denne måde kan muliggøre design af eksperimenter, der sigter mod at udvikle hurtig eller forsinket parring mellem haploider. Det præcise tidspunkt, hvor parringseffektiviteten topper, varierer for hver stamme. For eksempel fastslog vi eksperimentelt ved hjælp af vækstkinetik, at ScAM-stammen udviser en væksthastighed, der er lavere end for andre S. cerevisiae-stammer (som SK1), og dette påvirker sandsynligvis også parringsdynamikken.
Figur 1: Livscyklus for Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae har to parringstyper, a og α, og udviser både aseksuelle og seksuelle reproduktive faser. De to parringstyper, i mangel af den anden, deler sig mitotisk. Men når de er til stede i nærheden af hinanden, holder de op med at dele mitotisk, og det cellulære og nukleare indhold smelter sammen for at danne en diploide. Den diploide celle kan yderligere opdele mitotisk. Men i nærvær af ugunstige forhold (sult) gennemgår den meiose for at producere sporer indeholdende fire haploider. Disse sporer spirer under gunstige betingelser for at frigive to haploider af hver art og dermed fuldføre livscyklussen. Den effektivitet, hvormed de to haploider a og α parrer sig, kaldes parringseffektiviteten. Ethvert fald i denne parringseffektivitet indikerer en præ-zygotisk barriere for parring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin involveret i parringseffektivitetsassayet . (A) Et parringseffektivitetsgitter på 1 cm x 1,5 cm, som yderligere er opdelt i kasser på 1 cm x 0,5 cm hver, tegnes på en YPD-plade. (B) Haploide celler lappes på de ekstreme kasser. C) Vækst af haploide celler efter 24 timer ved 30 °C. (D) En tredjedel af de haploide plastre fjernes ved hjælp af en tandstikker, blandes i lige store celletal (baseret på OD600) og lappes i midtergitteret. E) Væksten af cellerne lappet i midtergitteret efter 7 timer ved 30 °C. Dette indeholder de nye diploider dannet og de haploider, der ikke har parret sig. (F) Isolerede enkeltkolonier opnået på en YPD-plade efter fortynding og plettering af cellerne skrabet fra midtergitteret. Denne plade blev inkuberet ved 30 °C i 36-48 timer. (G) For at identificere antallet af diploider, der er til stede på YPD-pladen, overføres kolonierne til en dobbelt drop-out-plade, der mangler tryptofan og leucin. Kun diploider kan vokse på denne plade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gærstammernes parringseffektivitet . (A) Parringseffektiviteten af de to haploider a og α af SK1- og ScAM-stammerne på en YPD-plade. (B) Parringseffektiviteten af de to haploider a og α af ScAM-stammen på YP-plader indeholdende 2% galactose og på glycerol/lactatplader. c) Dynamikken i parring i ScAM-stammen i et glukosemiljø. Resultaterne vises som gennemsnit ± SD fra 12 uafhængige gentagelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stammer | Genotype | Kommentar | Henvisning |
| SK1AMa | ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denne stamme har TRP1 gen og kan derfor vokse i fravær af tryptofan i medierne. | |
| SK1AMα | ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Denne stamme har LEU2-genet og kan derfor vokse i fravær af leucin i medierne. | |
| ScAMa | ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 | Denne stamme har TRP1 gen og kan derfor vokse i fravær af tryptofan i medierne. | Afledt af ScPJB644a i reference 28 |
| ScAMα | ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 | Denne stamme har URA3-genet og kan derfor vokse i fravær af uracil i medierne. | Afledt af ScPJB644α i reference 28 |
Tabel 1: Genotyper af S. cerevisiae-stammerne anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantificeringen af parringseffektiviteten i S. cerevisiae er afgørende for at udføre undersøgelser relateret til de gener, der er involveret i parringsveje eller studere det ydre miljøs indflydelse på parringsadfærd. I de sidste to årtier er S. cerevisiae også blevet en populær model til at løse spørgsmål relateret til speciering 14,36,37,38. Tilstedeværelsen af to parringstyper og den lette genetiske manipulation og vedligeholdelse i laboratoriemiljøer har gjort det til en passende organisme til at studere udviklingen af reproduktive barrierer i realtid. Kvantificeringen af parringseffektivitet er afgørende, da den giver et mål for den præzygotiske reproduktive barriere. Derfor kræves en bekvem protokol med høj reproducerbarhed.
Ved hjælp af ovenstående protokol blev parringseffektiviteten af to forskellige stammer, der viser helt forskellig parringsadfærd, kvantificeret. Derfor kan protokollen anvendes på enhver stamme, da de fleste laboratoriegærstammer bærer auxotrophier, der kan bruges til udvælgelse39. Der er dog et par vigtige overvejelser, mens du bruger denne protokol. Den tid, der kræves for at de indledende YPD-kulturer når den stationære fase, er belastningsafhængig. En langsomt voksende stamme kan kræve mere end 48 timers inkubation ved 30 °C. Mængden af haploider, der skal blandes, beregnes ud fra OD-målinger i et spektrofotometer. Den værdi, der er rapporteret i litteraturen, er i størrelsesordenen 107 celler/ml for 1 OD34; Det er dog bedre at karakterisere denne værdi for en bestemt stamme ved hjælp af et plot af OD versus antallet af celler. Det volumen, der kræves for at sikre blanding af lige mange celler, kan beregnes ud fra OD-værdien og antallet af celler / ml i 1 OD, som opnås ved karakterisering af stammen. Man bør sikre, at cellerne, der lappes i midtergitteret efter blanding af haploider, groft danner et monolag, der ikke er meget tykt. Man skal også sørge for, at volumenet, der blandes, er ca. 6-8 μL. Et højere volumen kan føre til overlapning med de haploide pletter, der er på hver side af midtergitteret.
Denne metode kan også bruges til at studere præzygotiske reproduktive barrierer mellem økologiske isolater af gær. I sådanne tilfælde skal HO-endonukleasegenet dog først fjernes fra organismens genom, da stammer, der bærer HO-endonuklease, automatisk danner diploider på grund af dets parringstype koblingsaktivitet40. De haploider, der er isoleret fra den sporulerede diploide, kan identificeres som en eller α ved at identificere sekvensen til stede ved MAT-locus ved hjælp af de specifikke primere, der er nævnt tidligere41. HO-markøren kan erstattes med to forskellige antibiotikaresistensgener som markører for at skelne mellem de to haploide parringstyper. Denne detalje afhænger af den belastningskonstruktion, der anvendes i den pågældende undersøgelse.
En af begrænsningerne ved denne metode er, at brugen af auxotrofe markører kræver overførsel af kolonierne fra YPD-pladen til drop-out-pladerne. Brug af fluorescensmarkører til at skelne mellem haploide og diploide celler kan hjælpe med at reducere forsøgstiden. Imidlertid kan brugen af fluorescensmarkører påvirke cellernes vækstdynamik, da der er en ekstra omkostning involveret i at producere fluorescerende proteiner, som således kan ændre en celles metaboliske og fysiologiske tilstand42. Alternativt kan de auxotrofe markører til identifikation af de to haploider erstattes af antibiotikamarkører.
Nogle af de tidligere metoder, der anvendes til karakterisering af parringseffektivitet, rapporterer brugen af et overskud af en af parringstyperne i forholdet 10: 1 16,21,24. Fra erfaring resulterer brugen af et forudindtaget forhold mellem de to haploider i mitotisk vækst af haploiden i overskud. Derfor bruger den nuværende metode en 1: 1 blanding af de to haploider.
Da de auxotrofe markører i stammerne, der anvendes i denne undersøgelse, indsættes tæt på MAT-locus , bryder rekombination under meiose ikke sammenhængen mellem den auxotrofe markør og parringstypen. Som følge heraf ændres auxotrofi og parringstypen af en bestemt haploid ikke, selvom stammerne får lov til at gennemgå meiose. Dette giver mulighed for at besvare spørgsmål relateret til virkningen af genflow som variabel på tilpasning og speciering43. Samlet set præsenterer denne protokol således en enkel og robust metode til at kvantificere parringseffektiviteten mellem forskellige gærstammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser i dette arbejde. Forfatterne deler gerne de SK1-afledte stammer til al non-profit brug.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskud (IA / S / 19/2 / 504632) til SS PN er en forsker støttet af et DBT / Wellcome Trust (India Alliance) tilskud (IA / S / 19 / 2 / 504632). AM støttes af Rådet for Videnskabelig og Industriel Forskning (CSIR), Indiens regering, som seniorforsker (09/087 (0873) / 2017-EMR-I). Forfatterne takker Paike Jayadeva Bhat for diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D.
- Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
- Sprague, G. F.
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D.
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S.
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G.
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
