Summary
In questo lavoro, viene descritto un metodo robusto per la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento nel lievito Saccharomyces cerevisiae . Questo metodo è particolarmente utile per la quantificazione delle barriere prezigotiche negli studi di speciazione.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae è un organismo modello ampiamente utilizzato in genetica, evoluzione e biologia molecolare. Negli ultimi anni, è diventato anche un organismo modello popolare per studiare i problemi legati alla speciazione. Il ciclo di vita del lievito coinvolge sia le fasi riproduttive asessuate che sessuali. La facilità di eseguire esperimenti di evoluzione e il breve tempo di generazione dell'organismo consentono lo studio dell'evoluzione delle barriere riproduttive. L'efficienza con cui i due tipi di accoppiamento (a e α) si accoppiano per formare il diploide a/α è indicata come efficienza di accoppiamento. Qualsiasi diminuzione dell'efficienza di accoppiamento tra aploidi indica una barriera pre-zigotica. Pertanto, per quantificare l'entità dell'isolamento riproduttivo tra due aploidi, è necessario un metodo robusto per quantificare l'efficienza di accoppiamento. A tal fine, viene presentato qui un protocollo semplice e altamente riproducibile. Il protocollo prevede quattro fasi principali, che includono la rattoppo degli aploidi su una piastra YPD, la miscelazione degli aploidi in numero uguale, la diluizione e la placcatura per singole colonie e, infine, il calcolo dell'efficienza in base al numero di colonie su una piastra drop-out. I marcatori auxotrofi sono impiegati per fare chiaramente la distinzione tra aploidi e diploidi.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae, comunemente chiamato lievito in erba, è un eucariota unicellulare. Ha due tipi di accoppiamento, uno e α, e presenta cicli riproduttivi sia asessuati che sessuali. I tipi di accoppiamento a e α sono aploidi e possono dividersi mitoticamente in assenza dell'altro tipo di accoppiamento nell'ambiente circostante, che rappresenta il ciclo asessuato del lievito. Quando i due tipi di accoppiamento sono nelle immediate vicinanze, smettono di dividersi mitoticamente e si fondono per formare una cellula diploide. Il lievito diploide può dividersi mitoticamente quando sono presenti sostanze nutritive o subire meiosi in condizioni di carenza di azoto in presenza di una fonte di carbonio povera che non è fermentabile, come l'acetato1. Ciò si traduce nella formazione di spore, che rimangono dormienti fino a quando non ci sono condizioni di crescita favorevoli. Il ciclo vitale è completato quando queste spore germinano e i due tipi aploidi vengono rilasciati nel pool aploide 2,3 (Figura 1).
L'accoppiamento delle cellule di lievito comprende diverse fasi, come l'agglutinazione, la formazione di una proiezione di accoppiamento o "shmoo", seguita dalla fusione cellulare e nucleare 4,5. I due tipi di accoppiamento a e α producono rispettivamente un fattore a e un fattore α per avviare l'accoppiamento. Questi fattori sono feromoni polipeptidici che si legano ai recettori (Ste2 e Ste3) presenti sulla superficie cellulare dell'accoppiamento opposto di tipo5. Il legame dei feromoni ai recettori avvia la via di risposta ai feromoni, la via di trasduzione del segnale della proteina chinasi attivata da mitogeni (MAPK) 6,7,8. Ciò si traduce nell'arresto del ciclo cellulare nella fase G1, portando a una fase stazionaria metabolicamente attiva9. Le cellule quindi smettono di dividersi mitoticamente e le proteine necessarie per l'accoppiamento vengono sintetizzate. Poiché le cellule aploidi non possono muoversi l'una verso l'altra, una proiezione di accoppiamento o "shmoo" è diretta verso il partner di accoppiamento. Quando le cellule entrano in contatto, la parete cellulare viene degradata e il contenuto citoplasmatico si fonde, con conseguente accoppiamento per formare una cellula diploide10,11. L'efficienza di accoppiamento tra aploidi è stata utilizzata come misura della speciazione in ceppi evoluti in laboratorio, così come tra specie esistenti12.
Essendo un semplice organismo eucariotico, il lievito è il modello di scelta per un gran numero di domande di ricerca associate a organismi eucarioti complessi. Una di queste domande è associata alla speciazione e all'evoluzione delle barriere riproduttive13,14. Per gli organismi che si riproducono sessualmente, una specie è definita dal concetto di specie biologica (BSC) proposto da Ernst Mayr15. Secondo questo concetto, due individui di una popolazione appartengono a due specie diverse se non possono incrociarsi e sono isolati in modo riproduttivo. La rottura del ciclo riproduttivo sessuale (che comporta la fusione dei gameti per formare uno zigote, lo sviluppo dello zigote in una progenie e il raggiungimento della maturità sessuale nella progenie) porta all'isolamento riproduttivo. Come mostrato nella figura 1, il ciclo vitale di S. cerevisiae è paragonabile al ciclo riproduttivo sessuale: a) la fusione dei due tipi di accoppiamento a e α è simile alla fusione dei gameti negli organismi che si riproducono sessualmente; b) la capacità del diploide di subire una divisione mitotica è equivalente allo zigote che si sviluppa in progenie; e c) la sporulazione diploide è paragonabile al processo di gametogenesi14.
L'isolamento prezigotico si verifica quando si osserva l'accoppiamento assortitivo. Data un'uguale opportunità di accoppiarsi con due tipi geneticamente diversi, un tipo α si accoppia preferenzialmente con uno rispetto all'altro o viceversa14. Nel caso di esperimenti di evoluzione in cui gli aploidi si sono evoluti in ambienti diversi, la presenza di una barriera pre-accoppiamento può essere determinata eseguendo un test di accoppiamento. Una diminuzione dell'efficienza di accoppiamento rispetto all'antenato indica l'evoluzione di una barriera pre-accoppiamento. L'isolamento post-zigotico potrebbe insorgere a causa dell'incapacità del diploide di subire un'efficace divisione mitotica e/o sporulazione per formare spore aploidi14. Questi possono essere quantificati misurando rispettivamente il tasso di crescita dei diploidi e calcolando l'efficienza di sporulazione. Quindi, per studiare l'evoluzione delle barriere riproduttive, sono necessari metodi robusti per quantificare (a) l'efficienza di accoppiamento, (b) la crescita mitotica del diploide e (c) l'efficienza di sporulazione del diploide. In questo lavoro, viene riportato un metodo robusto per quantificare l'efficienza di accoppiamento dei ceppi di lievito.
Negli esperimenti di laboratorio, uno dei modi in cui è possibile rilevare il verificarsi dell'accoppiamento è utilizzando marcatori auxotrofi che completano le esigenze nutrizionali. Quando i due tipi di accoppiamento sono auxotrofi per due diversi amminoacidi, solo la cellula diploide formata dalla fusione dei due tipi di accoppiamento può crescere su un terreno carente di entrambi gli amminoacidi. Pertanto, i marcatori auxotrofi sono utili per rilevare l'accoppiamento sia qualitativamente che quantitativamente. Un test qualitativo sarà sufficiente per identificare il tipo di accoppiamento di un ceppo dopo la meiosi16. I test quantitativi sono essenziali quando si è interessati a identificare una riduzione dell'accoppiamento mentre si studiano i geni coinvolti nel percorso di accoppiamento17,18. Inoltre, con il lievito sempre più utilizzato negli studi di speciazione, è necessario un saggio di accoppiamento conveniente e riproducibile, poiché la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento è una misura della barriera prezigotica.
L'efficienza di accoppiamento tra i due tipi di accoppiamento del lievito è stata quantificata in precedenza16,19,20. La maggior parte dei metodi precedentemente utilizzati sono simili nel loro design con alcune varianti 16,21,22,23,24,25. Alcuni di loro usano colture di fase logaritmica precoce, mentre alcuni altri usano colture di ceppi aploidi in fase intermedia. Ci sono variazioni nei rapporti in cui i due tipi di accoppiamento sono mescolati. Quasi tutti i protocolli utilizzano una membrana di nitrocellulosa. Le sospensioni di entrambi i tipi di accoppiamento prelevate da colture precedentemente coltivate vengono miscelate e filtrate su una membrana di nitrocellulosa posta su una piastra YPD. In una delle varianti del protocollo, la sospensione aploide viene applicata direttamente su una piastra YPD21. Negli esperimenti che si occupano dei geni coinvolti nella produzione di feromoni dei due tipi di accoppiamento, i feromoni vengono aggiunti esternamente mentre si effettuano le sospensioni dei due tipi di accoppiamento24.
Dopo l'incubazione per alcune ore (in genere circa 5 ore) dopo aver miscelato gli aploidi, le cellule vengono lavate via dalla membrana, diluite e placcate su terreni selettivi. In uno dei primi metodi riportati nel 1973, l'efficienza della formazione o dell'accoppiamento dello zigote è stata calcolata contando il numero di cellule gemmate, cellule non gemmate e coppie di accoppiamento al microscopio utilizzando un emocitometro26. Tuttavia, la maggior parte dei metodi riportati in seguito utilizza marcatori auxotrofi per distinguere aploidi e diploidi. L'efficienza di accoppiamento è calcolata come la percentuale di cellule diploidi rispetto al numero di cellule diploidi e aploidi nel pool cellulare 16,21,23.
Tuttavia, nonostante un certo numero di rapporti che utilizzano il lievito come organismo modello per studiare la speciazione, non esiste un protocollo standardizzato riportato in letteratura fino ad ora per calcolare l'efficienza dell'accoppiamento. Le celle nella fase logaritmica potrebbero non essere ideali per la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento. Durante l'accoppiamento, il ciclo cellulare dei due aploidi viene arrestato e, quindi, le cellule durante l'accoppiamento non si dividono9. Poiché il ciclo cellulare è anche noto per essere arrestato in modo simile nelle cellule nella fase stazionaria27, l'uso di tali cellule può rendere il protocollo più riproducibile. Le cellule di fase stazionarie possono essere miscelate e disposte su piastre YPD (cioè un ambiente nutrizionalmente ricco) per l'accoppiamento. Le procedure convenzionali richiedono anche una membrana di nitrocellulosa e il lavaggio delle cellule, rendendo il processo ingombrante e soggetto a errori di gestione. Inoltre, i protocolli utilizzati fino ad oggi quantificano l'efficienza di accoppiamento in termini di un aploide. Tuttavia, quando si misura l'isolamento riproduttivo, l'efficienza di accoppiamento viene quantificata per una particolare combinazione di aploidi piuttosto che per un singolo aploide.
Per affrontare questi problemi, qui riportiamo un metodo robusto per la quantificazione dell'efficienza di accoppiamento nel lievito che è altamente riproducibile e facile da usare. Inoltre, questo metodo e i ceppi di lievito qui impiegati possono essere utilizzati anche in studi che esaminano l'effetto del flusso genico sull'evoluzione delle barriere di accoppiamento.
In questo studio sono stati utilizzati due diversi ceppi di S. cerevisiae. Uno dei ceppi deriva dal fondo SK1; questo è stato modificato nel nostro laboratorio aggiungendo i marcatori auxotrofi vicino al locus MAT. I genotipi risultanti degli aploidi sono riportati nella Tabella 128,29,30. Nel ceppo SK1, l'aploide a aveva il gene TRP1 inserito vicino al locus MAT, e l'aploide α aveva il gene LEU2 inserito vicino al locus MAT. Nel ceppo ScAM, i geni TRP1 e URA3 sono stati inseriti rispettivamente negli aploidi a e α. La posizione di inserimento era nella regione ARS del cromosoma III (Chr III: 197378..197609). Per il protocollo qui riportato, sarebbero sufficienti marcatori auxotrofi in qualsiasi punto del genoma. Tuttavia, avere i marcatori auxotrofi vicino al locus MAT significa che questi ceppi possono essere utilizzati anche per studi che esaminano l'effetto del flusso genico sulla speciazione31,32. I marcatori sono stati aggiunti vicino al locus MAT per impedire il rimescolamento dei marcatori a causa della ricombinazione. Quindi, questo protocollo può essere utilizzato per quantificare l'efficienza di accoppiamento negli studi che coinvolgono la speciazione e anche per identificare l'alterazione dell'efficienza di accoppiamento quando si studiano le proteine coinvolte nel percorso di accoppiamento.
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Protocol
NOTA: Il protocollo prevede in generale le seguenti fasi: (1) rattoppare gli aploidi nelle griglie di efficienza di accoppiamento su una piastra YPD, (2) mescolare gli aploidi in numero uguale dopo 24 ore di incubazione e dare agli aploidi misti alcune ore per accoppiarsi (7 ore in questo studio), (3) placcare le cellule miste su YPD per isolare singole colonie dopo 7 ore a 30 °C, e infine, (4) determinare il numero di diploidi formati utilizzando i marcatori auxotrofi. Questi passaggi sono discussi in dettaglio di seguito (vedere anche la Figura 2).
1. Rattoppo degli aploidi nelle griglie di efficienza di accoppiamento
- Ravvivare gli aploidi a e α dalle scorte congelatrici strisciando su una piastra di agar YPD (2% agar, 2% destrosio, 1% peptone, 0,5% estratto di lievito) e lasciarli crescere per 48 ore a 30 °C per ottenere colonie singole isolate.
- Inoculare singole colonie dalla piastra YPD in 5 mL di terreno YPD (destrosio 2%, peptone 1%, estratto di lievito 0,5%) e incubare a 30 °C per 48 ore agitando 250 giri/min. Le cellule sono nella fase stazionaria di crescita dopo questo periodo di incubazione.
- Disegna una griglia di efficienza di accoppiamento su una piastra YPD fresca. Disegnare la griglia come un rettangolo di 1 cm x 1,5 cm diviso in tre caselle in modo che ciascuna abbia una dimensione di 1 cm x 0,5 cm, come mostrato nella Figura 2A.
- Patch 5 μL della coltura YPD dei due tipi di accoppiamento sui rettangoli più a sinistra e più a destra (Figura 2B). Questo volume corrisponde a circa 5 x 105 cellule aploidi disposte in ciascuna sezione. Incubare le piastre per 24 ore a 30 °C.
NOTA: Lo scopo della griglia è quello di rendere precise le misure sperimentali (come il numero di celle nell'esperimento). La dimensione della griglia è abbastanza piccola da essere trattabile sperimentalmente ma abbastanza grande da poter essere facilmente manipolata (come sollevare celle da una griglia) e non suscettibile di derive o eventi casuali.
2. Miscelazione di aploidi e accoppiamento
NOTA: Dopo 24 ore (Figura 2C), un numero uguale di celle dei due tipi aploidi viene raschiato dalle due griglie, mescolato e posto nel rettangolo centrale (Figura 2D).
- Per mescolare un numero uguale di cellule, rimuovere circa 1/3 del cerotto che è stato posato nelle scatole esterne usando uno stuzzicadenti sterile e risospendere in 20 μL di acqua in un flaconcino sterile da 1,5 ml per ciascuno degli aploidi.
- Diluire 5 μL di questa sospensione in 2 mL di acqua. Misurare l'OD di questa sospensione diluita utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm. Mescolare un numero uguale di cellule dei due ceppi, in base al valore OD e al numero di cellule / mL in 1 OD per quel particolare ceppo. Calcolare il volume richiesto da miscelare e aspirarlo dai restanti 15 μL della singola sospensione aploide.
Nota : il numero di celle patchate nel rettangolo centrale è tale che le celle formano un monostrato. Considerando la cellula di lievito come una sfera con un raggio di 2,58 μm33, una scatola rettangolare di 1 cm x 0,5 cm avrebbe bisogno di circa 1,7 x 106 cellule per formare un monostrato. Si deve prestare attenzione per assicurarsi che non vi sia alcun contatto fisico tra le cellule patchate per l'accoppiamento e le due griglie cellulari aploidi. Poiché un numero uguale di ciascun tipo di cellule aploidi deve essere mescolato, 8,5 x 105 cellule vengono aggiunte da ciascun ceppo. Il numero di celle è calcolato sulla base di misurazioni OD, considerando 1 OD a 600 nm approssimativamente equivalente a 1 x 107 celle34. Ad esempio, se l'OD600 della sospensione aploide è 0,17 e quello dell'aploide α è 0,11, è possibile calcolare il numero di cellule in 5 μL di ciascuna sospensione aploide. Per garantire 8,5 x 105 cellule di ciascun tipo aploide, vengono miscelati 1,25 μL dell'aploide e 1,93 μL delle sospensioni aploidi α. - Aggiungere i volumi richiesti di entrambi gli aploidi in un flaconcino fresco e sterile da 1,5 mL e mescolare bene con una pipetta. Il volume finale di questa sospensione è generalmente di circa 6-8 μL. Applicare questa sospensione nella griglia centrale. Incubare la piastra a 30 °C per 7 ore, lasciando agli aploidi il tempo sufficiente per accoppiarsi (Figura 2E).
3. Placcatura di cellule miste su agar YPD
- Dopo il periodo di incubazione di 7 ore, raschiare le cellule dal rettangolo centrale usando uno stuzzicadenti o una punta di pipetta e diluire in 2 ml di acqua sterile. Quindi, distribuire la sospensione cellulare su agar YPD per ottenere singole colonie. Per determinare il fattore di diluizione necessario per ottenere singole colonie, misurare l'OD della prima provetta in cui vengono aggiunte le cellule raschiate. Devono essere determinati fattori di diluizione specifici per ciascun tipo di cellula/ceppo utilizzato.
NOTA: Ad esempio, un OD600 di 0,15 corrisponde a 3 x 106 cellule in una sospensione di 2 mL (considerando 1 OD = 1 x 107 cellule/ml). Per ottenere alcune centinaia di colonie sulla piastra YPD, la sospensione cellulare viene diluita in serie a 1:20 due volte, quindi vengono utilizzati 100 μL della diluizione finale per la diffusione. - Dopo la placcatura, incubare le piastre YPD a 30 °C per 36-48 ore fino a quando non ci sono colonie singole. Assicurarsi che alcune centinaia di singole colonie siano ottenute da ogni esperimento di accoppiamento per lo screening in modo da garantire che la significatività statistica possa essere rilevata nei dati (Figura 2F).
4. Screening dei diploidi mediante marcatori auxotrofici
- Determina quale frazione delle colonie ottenute sono diploidi. Per identificare le colonie diploidi sulla piastra, trasferire le singole colonie striandole singolarmente su una piastra a doppio drop-out (2% di glucosio, 0,66% di azoto base, 0,05% di miscela di aminoacidi a doppio drop-out e 2% di agar) priva degli amminoacidi per cui i ceppi sono auxotrofi, come mostrato in Figura 2G. Incubare le piastre a 30 °C per 48 h.
NOTA: Le colonie possono anche essere trasferite sulla doppia piastra drop-out utilizzando la placcatura replica. In questo studio, il mezzo drop-out di triptofano e leucina (trp− leu−) è stato utilizzato per quantificare l'efficienza di accoppiamento dei ceppi SK1AM e il mezzo drop-out di triptofano e uracile (trp− ura−) è stato utilizzato per i ceppi ScAM. Solo le colonie diploidi crescono sulla piastra a doppio drop-out in quanto hanno entrambi i marcatori auxotrofi: i geni TRP1 e LEU2 nei ceppi SK1AM e i geni TRP1 e URA3 nei ceppi ScAM. - Inoltre, striare o replicare le colonie su singoli terreni drop-out (trp− o leu− o ura−) per quantificare la frequenza di ciascuno dei due tipi di aploidi nella popolazione.
- Calcola l'efficienza di accoppiamento, η, come segue:
Eq (1)
dove il numero di aploidi accoppiati è semplicemente uguale al doppio del numero di diploidi identificati sulla doppia piastra drop-out (poiché ogni diploide risultava dall'accoppiamento di due aploidi). Il numero totale di aploidi è uguale alla somma del numero di aploidi striati più il doppio del numero di diploidi striati.
NOTA: Ad esempio, se solo 60 colonie crescono dopo aver striato / placcato 100 colonie su un doppio mezzo drop-out, l'efficienza di accoppiamento può essere quantificata come 75% (poiché 60 x 2 aploidi si sono accoppiati per formare i 60 diploidi e 40 aploidi non si sono accoppiati).
Eq (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quantificazione dell'efficienza di accoppiamento dei due tipi di accoppiamento
Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per quantificare l'efficienza di accoppiamento tra due ceppi di lievito: tra SK1AM a e SK1AM α e tra ScAMa e ScAMα (Figura 3A). In questi esperimenti, l'accoppiamento tra i due aploidi è stato ripetuto almeno 12 volte. In ciascuna delle ripetizioni dell'esperimento, almeno 100 colonie sono state striate su supporti a doppio drop-out. La robustezza del protocollo ha permesso una facile differenziazione dell'efficienza di accoppiamento tra i due ceppi, SK1AM e ScAM. Mentre i ceppi SK1 si accoppiavano con un'efficienza molto elevata, i ceppi ScAM si accoppiavano con un'efficienza relativamente inferiore (Figura 3A). Questo forse non è sorprendente, poiché i ceppi di ScAM hanno avuto origine dall'accoppiamento ibrido tra i ceppi S. cerevisiae e S. carlsbergensis 35.
Oltre a distinguere l'efficienza di accoppiamento tra i ceppi, questo metodo può anche essere utilizzato per quantificare le differenze nell'efficienza di accoppiamento dei ceppi in ambienti diversi. Come mostrato nella Figura 3B, l'efficienza di accoppiamento dei ceppi ScAM è diminuita significativamente quando l'ambiente non conteneva glucosio come fonte primaria di carbonio. L'accoppiamento è un processo energeticamente costoso e la crescita su fonti di carbonio alternative riduce qualitativamente l'efficienza dell'accoppiamento.
Dinamica dell'efficienza di accoppiamento
L'elevata ripetibilità del metodo consente inoltre di tracciare le dinamiche dell'efficienza di accoppiamento. Quando è stato permesso di accoppiarsi per periodi di tempo diversi (Figura 3C), non è stato osservato alcun accoppiamento per le prime 4-5 ore; I primi diploidi apparvero solo dopo questa durata. Presumibilmente, questo è il tempo necessario affinché il processo di accoppiamento sia completato nell'ambiente dato. Successivamente, l'efficienza di accoppiamento aumentò rapidamente. Tuttavia, oltre le 7 ore, i calcoli dell'efficienza di accoppiamento sono influenzati dal fatto che la crescita mitotica inizia ad avvenire sulla piastra. L'identificazione e la selezione di diploidi precoci o tardivi in questo modo può consentire la progettazione di esperimenti che mirano a sviluppare l'accoppiamento rapido o ritardato tra aploidi. Il momento preciso in cui l'efficienza di accoppiamento raggiunge il picco è variabile per ogni ceppo. Ad esempio, utilizzando la cinetica di crescita, abbiamo determinato sperimentalmente che il ceppo ScAM mostra un tasso di crescita inferiore a quello di altri ceppi di S. cerevisiae (come SK1), e questo probabilmente influenza anche la dinamica dell'accoppiamento.
Figura 1: Ciclo di vita di Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae ha due tipi di accoppiamento, a e α, e presenta sia fasi riproduttive asessuate che sessuali. I due tipi di accoppiamento, in assenza dell'altro, si dividono mitoticamente. Tuttavia, quando sono presenti in prossimità l'uno dell'altro, smettono di dividersi mitoticamente e il contenuto cellulare e nucleare si fondono per formare un diploide. La cellula diploide può dividersi ulteriormente mitoticamente. Tuttavia, in presenza di condizioni sfavorevoli (fame), subisce meiosi per produrre spore contenenti quattro aploidi. Queste spore germinano in condizioni favorevoli per rilasciare due aploidi di ogni tipo, completando così il ciclo vitale. L'efficacia con cui i due aploidi a e α si accoppiano è indicata come efficienza di accoppiamento. Qualsiasi diminuzione di questa efficienza di accoppiamento indica una barriera pre-zigotica all'accoppiamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Fasi coinvolte nel saggio dell'efficienza di accoppiamento. (A) Una griglia di efficienza di accoppiamento di 1 cm x 1,5 cm, che è ulteriormente suddivisa in scatole di 1 cm x 0,5 cm ciascuna, è disegnata su una piastra YPD. (B) Le cellule aploidi sono rattoppate sulle scatole estreme. (C) La crescita delle cellule aploidi dopo 24 ore a 30 °C. (D) Un terzo dei cerotti aploidi viene rimosso usando uno stuzzicadenti, mescolato in numero di celle uguali (basato su OD600) e rattoppato nella griglia centrale. (E) La crescita delle cellule rattoppate nella griglia centrale dopo 7 ore a 30 °C. Questo contiene i nuovi diploidi formati e gli aploidi che non si sono accoppiati. (F) Colonie singole isolate ottenute su una piastra YPD dopo la diluizione e la placcatura delle cellule raschiate dalla griglia centrale. Questa piastra è stata incubata a 30 °C per 36-48 ore. (G) Per identificare il numero di diploidi presenti sulla piastra YPD, le colonie vengono trasferite in una doppia piastra drop-out priva di triptofano e leucina. Solo i diploidi possono crescere su questo piatto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Efficienza di accoppiamento dei ceppi di lievito. (A) L'efficienza di accoppiamento dei due aploidi a e α dei ceppi SK1 e ScAM su una piastra YPD. (B) L'efficienza di accoppiamento dei due aploidi a e α del ceppo ScAM su piastre YP contenenti galattosio al 2% e su piastre di glicerolo/lattato. (C) La dinamica dell'accoppiamento nel ceppo ScAM in un ambiente di glucosio. I risultati sono mostrati come media ± SD da 12 ripetizioni indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Ceppi | Genotipo | Commento | Riferimento |
| SK1AMa | ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Questo ceppo ha il gene TRP1 e può quindi crescere in assenza di triptofano nei media. | |
| SK1AMα | ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG | Questo ceppo ha il gene LEU2 e può quindi crescere in assenza di leucina nei media. | |
| ScAMa | ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 | Questo ceppo ha il gene TRP1 e può quindi crescere in assenza di triptofano nei media. | Derivato da ScPJB644a nel riferimento 28 |
| ScAMα | ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 | Questo ceppo ha il gene URA3 e può quindi crescere in assenza di uracile nei media. | Derivato da ScPJB644α nel riferimento 28 |
Tabella 1: Genotipi dei ceppi di S. cerevisiae utilizzati in questo studio.
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Discussion
La quantificazione dell'efficienza di accoppiamento in S. cerevisiae è essenziale per effettuare studi relativi ai geni coinvolti nelle vie di accoppiamento o studiare l'influenza dell'ambiente esterno sul comportamento di accoppiamento. Negli ultimi due decenni, S. cerevisiae è diventato anche un modello popolare per affrontare le questioni relative alla speciazione14,36,37,38. La presenza di due tipi di accoppiamento e la facilità di manipolazione genetica e manutenzione in ambienti di laboratorio lo ha reso un organismo adatto per studiare l'evoluzione delle barriere riproduttive in tempo reale. La quantificazione dell'efficienza di accoppiamento è essenziale in quanto fornisce una misura della barriera riproduttiva prezigotica. Quindi, è necessario un protocollo conveniente con alta riproducibilità.
Utilizzando il protocollo di cui sopra, è stata quantificata l'efficienza di accoppiamento di due diversi ceppi che mostrano un comportamento di accoppiamento completamente diverso. Quindi, il protocollo può essere applicato a qualsiasi ceppo, poiché la maggior parte dei ceppi di lievito di laboratorio trasporta auxotrofi che possono essere utilizzati per la selezione39. Tuttavia, ci sono alcune considerazioni importanti durante l'utilizzo di questo protocollo. La durata del tempo necessario affinché le colture YPD iniziali raggiungano la fase stazionaria dipende dalla tensione. Un ceppo a crescita lenta può richiedere più di 48 ore di incubazione a 30 °C. Il volume degli aploidi da miscelare viene calcolato sulla base delle misurazioni OD in uno spettrofotometro. Il valore riportato in letteratura è dell'ordine di 107 cellule/mL per 1 OD34; tuttavia, è meglio caratterizzare questo valore per un particolare ceppo usando un grafico di OD rispetto al numero di celle. Il volume necessario per garantire la miscelazione di un numero uguale di cellule può essere calcolato in base al valore OD e al numero di cellule/ml in 1 OD, che si ottengono dalla caratterizzazione del ceppo. Si dovrebbe assicurarsi che le cellule che vengono rattoppate nella griglia centrale dopo aver mescolato gli aploidi formino approssimativamente un monostrato che non è molto spesso. È inoltre necessario assicurarsi che il volume da miscelare sia di circa 6-8 μL. Un volume più elevato può portare alla sovrapposizione con le macchie aploidi che si trovano su entrambi i lati della griglia centrale.
Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le barriere riproduttive pre-zigotiche tra isolati ecologici di lievito. Tuttavia, per tali casi, il gene dell'endonucleasi HO deve prima essere rimosso dal genoma dell'organismo, poiché i ceppi portatori di endonucleasi HO formano diploidi automaticamente a causa della sua attività di commutazione di tipo accoppiamento40. Gli aploidi isolati dal diploide sporulato possono essere identificati come a o α identificando la sequenza presente nel locus MAT utilizzando i primer specifici menzionati in precedenza41. Il marcatore HO può essere sostituito con due diversi geni di resistenza agli antibiotici come marcatori per distinguere tra i due tipi di accoppiamento aploidi. Questo dettaglio dipende dalla costruzione del ceppo utilizzata nello studio particolare.
Uno dei limiti di questo metodo è che l'uso di marcatori auxotrofi richiede il trasferimento delle colonie dalla piastra YPD alle piastre drop-out. L'uso di marcatori di fluorescenza per distinguere tra cellule aploidi e diploidi può aiutare a ridurre il tempo sperimentale. Tuttavia, l'uso di marcatori di fluorescenza può influenzare la dinamica di crescita delle cellule in quanto vi è un costo aggiuntivo coinvolto nella produzione delle proteine fluorescenti, che, quindi, possono alterare lo stato metabolico e fisiologico di una cellula42. In alternativa, i marcatori auxotrofi per identificare i due aploidi possono essere sostituiti da marcatori antibiotici.
Alcuni dei precedenti metodi utilizzati per la caratterizzazione dell'efficienza dell'accoppiamento riportano l'uso di un eccesso di uno dei tipi di accoppiamento con un rapporto di 10:1 16,21,24. Dall'esperienza, l'uso di un rapporto distorto dei due aploidi provoca una crescita mitotica dell'aploide in eccesso. Pertanto, il metodo corrente utilizza una combinazione 1:1 dei due aploidi.
Poiché i marcatori auxotrofi nei ceppi utilizzati in questo studio sono inseriti vicino al locus MAT , la ricombinazione durante la meiosi non interrompe l'associazione tra il marcatore auxotrofico e il tipo di accoppiamento. Di conseguenza, l'auxotrofia e il tipo di accoppiamento di un particolare aploide non cambiano anche se i ceppi possono subire la meiosi. Ciò consente di rispondere a domande relative all'impatto del flusso genico come variabile sull'adattamento e sulla speciazione43. Pertanto, nel complesso, questo protocollo presenta un metodo semplice e robusto per quantificare le efficienze di accoppiamento tra diversi ceppi di lievito.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti in questo lavoro. Gli autori sono felici di condividere i ceppi derivati da SK1 per tutti gli usi senza scopo di lucro.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione DBT / Wellcome Trust (India Alliance) (IA / S / 19/2 / 504632) a S.S. P.N. è un ricercatore supportato da una sovvenzione DBT / Wellcome Trust (India Alliance) (IA / S / 19/2 / 504632). A.M. è supportato dal Council of Scientific and Industrial Research (CSIR), Government of India, come Senior Research Fellow (09/087(0873)/2017-EMR-I). Gli autori ringraziano Paike Jayadeva Bhat per le discussioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
References
- Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
- Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
- Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
- Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
- Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
- Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
- Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
- Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
- Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
- Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
- Greig, D.
- Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
- Sprague, G. F.
- McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
- Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
- Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
- Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
- Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
- Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
- Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
- Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D.
- McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S.
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
- Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
- Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
- Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
- Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
- White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
- Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
- Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
- Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G.
- Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
- Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
- Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
- Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
- Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
- Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).
