Summary
Aqui, apresentamos um pipeline padrão para a obtenção de tumores ATC murinos por modelos espontâneos de camundongos geneticamente modificados. Além disso, apresentamos a dinâmica tumoral e informações patológicas sobre as lesões primárias e metastizadas. Esse modelo ajudará os pesquisadores a entender a tumorigênese e facilitará a descoberta de drogas.
Abstract
O câncer anaplásico de tireoide (ATC) é uma neoplasia maligna rara, mas letal, com prognóstico sombrio. Há uma necessidade urgente de pesquisas mais aprofundadas sobre a carcinogênese e o desenvolvimento de ATC, bem como métodos terapêuticos, uma vez que os tratamentos padrão são essencialmente esgotados em pacientes com ATC. No entanto, a baixa prevalência tem dificultado estudos clínicos aprofundados e a coleta de amostras de tecido, de modo que pouco progresso foi alcançado na criação de tratamentos eficazes. Usamos engenharia genética para criar um modelo murino ATC condicionalmente induzível (mATC) em um fundo C57BL/6. O modelo murino ATC foi genotipado por TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e induzido por injeção intraperitoneal com tamoxifeno. Com o modelo murino, investigamos a dinâmica tumoral (o tamanho do tumor variou de 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 após 4 meses da indução), a sobrevida (o período mediano de sobrevida foi de 130 dias) e as metástases (metástases pulmonares ocorreram em 91,6% dos camundongos) e as características patológicas (caracterizadas pela imuno-histoquímica Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspase-3). Os resultados indicaram que o mATC espontâneo possui dinâmica tumoral e microambiente imunológico altamente semelhantes aos tumores ATC humanos. Em conclusão, com alta similaridade nas características fisiopatológicas e genótipos unificados, o modelo mATC resolveu a escassez de ATC clínica e heterogeneidade da amostra até certo ponto. Portanto, facilitaria o mecanismo e os estudos translacionais da ATC e forneceria uma abordagem para investigar o potencial de tratamento de pequenas drogas moleculares e agentes de imunoterapia para ATC.
Introduction
O câncer de tireoide é uma das neoplasias endócrinas maiscomuns1, originando-se do epitélio tireoidiano. Nos últimos anos, a incidência do câncer de tireoide tem aumentado rapidamente em todo omundo2. O câncer de tireoide pode ser dividido em tipos distintos de acordo com o grau de diferenciação das células tumorais. Com base no comportamento clínico e histológico, os carcinomas de tireoide são divididos em carcinomas bem diferenciados, incluindo carcinoma papilífero de tireoide (CPT) e carcinoma folicular de tireoide (FTC), carcinoma pouco diferenciado (PDTC) e carcinoma indiferenciado ou anaplásico da tireoide (ATC)3. Ao contrário do CPT, que é um tipo comum, com comportamento leve e melhor prognóstico4, o CTA é uma neoplasia maligna rara e altamente agressiva, responsável por 2% a 3% de todos os tumores tireoidianos5. Embora a ATC seja rara, é responsável por aproximadamente 50% das mortes relacionadas ao câncer de tireoide, com sobrevida sombria (6-8 meses)6,7. Mais de 50% dos casos de CTA são diagnosticados como metástasespulmonares8. Além da natureza agressiva da ATC, um tratamento eficaz limitado foi desenvolvido na clínica. Portanto, pacientes com CTA têm um prognóstico sombrio9,10,11. Isso sugere que mais estudos aprofundados são urgentemente necessários sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de ATC e tratamento.
A tumorigênese da ATC é um processo dinâmico desdiferenciado. A dificuldade em coletar amostras de tumores humanos em cada estágio em estudos clínicos tem dificultado a compreensão do mecanismo de desenvolvimento de carcinomas bem diferenciados para indiferenciados. Em contraste, o uso de modelos de ATC murino (mATC) favorece a coleta de amostras de mATC em todo o curso da tumorigênese. Portanto, podemos entender melhor os mecanismos de formação tumoral analisando o processo dinâmico desdiferenciado. Além disso, a heterogeneidade das amostras clínicas de CTA também tem contribuído para a dificuldade de compreensão do mecanismo molecular. No entanto, os camundongos compartilhavam as mesmas origens genéticas e eram mantidos em ambientes de vida semelhantes, garantindo a consistência de cada tumor. Isso facilita a exploração do papel generalizado do desenvolvimento da ATC12,13,14. Além disso, a mATC é um modelo tumoral in situ que pode restaurar a influência da localização anatômica e do microambiente tecido-específico. Como tal, em comparação com camundongos imunodeficientes comumente usados, o mATC é um modelo murino espontâneo com um sistema imunológico intacto e microambiente imunológico.
Portanto, construímos mATC condicionalmente induzido com a cepa C57BL/6, que é um modelo murino capaz de reproduzir as características patológicas do carcinoma desdiferenciado de tireoide. Com base nesse modelo, apresentamos uma breve visão geral da base molecular, ideias de construção, características patológicas e aplicações do mATC. Além disso, observamos e relatamos crescimento tumoral, tempo de sobrevida, metástase e características patológicas da mATC. Acreditamos que esta será uma visão geral da informática para auxiliar outros pesquisadores a utilizar este modelo com mais facilidade.
Construímos um modelo de mATC induzível condicional, como relatado pela primeira vez por McFadden15; inicialmente, foram construídos camundongos: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt e Trp53flox/wt. Especificamente, camundongos TPO-cre/ERT2 incluíram o promotor da tireoperoxidase humana (TPO) (um promotor específico da tireoide), conduzindo a expressão de um gene de fusão cre-ERT2 (uma cre recombinase fusionada a um domínio de ligação do ligante do receptor de estrogênio humano). O Cre-ERT2 geralmente está confinado ao citoplasma e entra no núcleo apenas quando exposto ao tamoxifeno, que induz o cre a exercer atividade enzimática recombinante. Quando os camundongos são cruzados com camundongos portadores de sequências flanqueadas por loxP, após a indução com tamoxifeno, a recombinação cre-mediada exclui as sequências floxed nas células tireoidianas para atingir o propósito de nocautear ou nocautear genes específicos.
Além disso, camundongos Braf flox/wt são um alelo knock-in de Braf humano baseado no sistema cre-loxP. O transcrito murino de Brafflox/wt é codificado por exons endógenos 1-14 e exons humanos flanqueados com loxP 15-18. Após a excisão cremediada das regiões floxadas, o éxon mutante 15 (modificado com uma substituição de aminoácidos V600E ligada ao BrafV600E constitutivamente ativo em cânceres humanos) e os éxons endógenos 16-18 são usados para gerar os transcritos. Além disso, camundongos Trp53 flox/wt são alelos nocaute de Trp53 humano e possuem sítios loxP flanqueando os éxons 2-10 de Trp53. Quando cruzada com camundongos com uma recombinase cre, a recombinação mediada por cre exclui a sequência floxada para nocautear Trp53. Em seguida, camundongos TPO-cre/ERT2, Braf flox/w e Trp53flox/wt foram cruzados para obtenção de TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) camundongos e TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/mf; Trp53flox/m/m) camundongos, que poderiam ser usados para gerar PTC e ATC. Após aproximadamente 8 semanas, os camundongos foram induzidos por uma administração intraperitoneal (i.p.) de 150 mg/kg de tamoxifeno dissolvido em óleo de milho por duas administrações. O crescimento tumoral pôde ser monitorado por ultrassonografia de alta frequência (o primeiro momento da ultrassonografia foi registrado como Dia 0). A ultrassonografia inicial foi realizada 40 dias após a introdução do tamoxifeno.
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Protocol
Os procedimentos em animais aqui descritos foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China.
1. Indução de camundongos TBP
- Identificar genótipo de camundongos
- Por volta das 3 semanas, separe os camundongos fêmeas dos machos. Ao mesmo tempo, use uma pinça de marca auricular para fixar uma marca auricular. Coloque as marcas auriculares na metade inferior e no terço médio da orelha, certificando-se de evitar a área com maior concentração de capilares.
- Segure suavemente, mas com segurança, os ratos. Segure firmemente na base da cauda do rato. Coloque os ratos em uma superfície que lhes permita agarrar.
- Coloque suavemente, mas com firmeza, a mão livre sobre os ombros e, em seguida, segure rapidamente o pescoço entre o polegar e o indicador. Segure o rabo com o dedo mínimo.
- Esfregue a cauda com álcool. Use uma tesoura estéril para cortar a amostra de pele <5 mm e colocá-la em um recipiente de amostra limpo com um rótulo. Não é necessário remover a pele dos ratos. Comprimir a cauda com esponjas estéreis para hemostasia.
- Em seguida, lisar a cauda murina e realizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) para identificar o genótipo.
NOTA: Depois de cortar uma cauda murina, a superfície da tesoura deve ser limpa com algodão alcoólico para evitar a contaminação mútua de genes entre caudas murinas. Depois de colocá-los em sua gaiola, os ratos devem ser observados por 5 minutos para procurar quaisquer sinais de sangramento no local da ferida. Consulte a Tabela 1 para obter a lista de primers e as configurações de PCR usadas neste estudo.
- Camundongos TBP induzidos por tamoxifeno
- Pesar 0,3 g de tamoxifeno e dissolvê-lo em 15 mL de óleo de milho por ultrassom (potência = 20%, duração = 20 min, temperatura = 4 °C), na concentração de 20 mg/mL. Conservar a 4 °C.
NOTA: O tamoxifeno é sensível à luz e precisa ser colocado em um recipiente marrom. - Em torno de 8 semanas, pesar os ratos com balanças eletrônicas e dar-lhes uma injeção i.p. de tamoxifeno em uma dose de 150 mg/kg, administrada duas vezes com um intervalo de 1 semana.
- Pesar 0,3 g de tamoxifeno e dissolvê-lo em 15 mL de óleo de milho por ultrassom (potência = 20%, duração = 20 min, temperatura = 4 °C), na concentração de 20 mg/mL. Conservar a 4 °C.
2. Dissecção e imagem de tumores de tireoide de camundongos e tumores metastáticos
- Preparação
- Prepare as ferramentas de dissecção: tesoura e pinça estéreis, lâmina estéril, frasco de spray de álcool 75%, borda reta de 20 cm, paquímetro vernier, papel toalha e algodão alcoólico.
- Solução de fixação de tecido de ratinho: preparar solução de fixação de tecido paraformaldeído a 4%.
- Limpe uma placa de 10 cm preenchida com cerca de 10 mL de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para armazenamento temporário do tecido e lave o sangue na superfície do tecido.
- Extração de tireoide
- Eutanasiar os camundongos com dióxido de carbono a uma vazão de 2,0 L/min por 5 min. Remova os ratos da gaiola e realize o deslocamento cervical.
- Coloque o mouse sobre a placa de dissecação com o lado ventral voltado para cima e a cabeça afastada do experimentador e fixe os membros na placa de dissecação com agulhas de seringa estéreis. Para uma remoção mais conveniente do tecido tireoidiano, use outra agulha de seringa estéril para fixar a cabeça.
- Desinfetar o pescoço com três rodadas alternadas de uma esfoliação com clorexidina ou iodopovidona, seguidas de álcool a 75%. Em seguida, faça uma pequena incisão acima do centro da clavícula com tesoura e pinça estéreis.
- Continue a linha média da incisão até a boca. Encontre a glândula submandibular e remova-a para expor a localização anatômica da tireoide, que é colocada perto da cartilagem tireoide e traqueia.
- Encontre a tireoide, disseque cuidadosamente a tireoide do resto da região do pescoço com tesoura estéril e, em seguida, coloque a tireoide removida em uma placa de 10 cm preenchida com 10 mL de PBS estéril.
NOTA: Durante a remoção da glândula tireoide, seja suave e lento e evite cortar os vasos sanguíneos do pescoço. Se os vasos do pescoço forem cortados, o pescoço será imediatamente preenchido com sangue, e o sangue deve ser prontamente removido com esponjas de álcool para expor a localização anatômica da tireoide. Antes de remover o tecido tireoidiano, observe cuidadosamente as características dos lobos esquerdo e direito da tireoide (tamanho, forma, etc.) para evitar ser incapaz de distinguir entre os lobos esquerdo e direito da tireoide após a remoção. - Em PBS estéril, remova o sangue da superfície do tecido tireoidiano com tesoura estéril e corte cuidadosamente a traqueia. Em seguida, coloque o tecido tireoidiano em um pano estéril e meça o tamanho dos lobos esquerdo e direito da glândula tireoide com paquímetro de Vernier.
- Divida os lobos esquerdo e direito da glândula tireoide em duas partes com uma lâmina estéril. Colocar uma parte em 2 mL de solução de paraformaldeído a 4% para fixação e colocar a outra parte em nitrogênio líquido para preservação.
- Extração de pulmão e fígado
- Desinfetar o abdome com três rodadas alternadas de uma esfoliação de clorexidina ou iodopovidona e álcool a 75%. Em seguida, aperte logo acima do pênis do rato e faça uma pequena incisão, corte ao longo da linha média do abdômen até o osso subclávio e exponha a cavidade abdominal.
- Encontre o fígado na parte superior do abdômen e remova-o cuidadosamente. Coloque o fígado em PBS estéril.
- Corte cuidadosamente o diafragma ao longo das costelas para expor a cavidade torácica. Em seguida, segure o esterno e puxe para cima para ampliar ainda mais o espaço. Encontre o pulmão e remova-o. Coloque o pulmão removido em PBS estéril.
- Observar grosseiramente se há metástases no pulmão e no fígado. Conte o número de metástases e faça um registro digital. Depois disso, use uma lâmina estéril para dividir os tecidos pulmonar e hepático em duas partes. Colocar uma parte em 3 mL de solução de paraformaldeído a 4% para fixação e outra parte em nitrogênio líquido para preservação.
- Desidratação tecidual
- Coloque os tecidos na caixa de desidratação. Coloque a caixa de desidratação no cesto na desidratação com álcool degradê da seguinte forma: álcool 70% por 1 h; álcool a 80% por 1 h; álcool 95% por 30 min; álcool 95% por 30 min; etanol anidro I por 30 min; etanol anidro II por 30 min; xileno I por 20 min; xileno II por 20 min; cera de parafina I por 30 min; cera de parafina II por 1 h; cera de parafina III por 30 min.
- Incorpore os tecidos impregnados com cera na máquina de incorporação.
- Coloque a cera derretida na estrutura de incorporação primeiro. Antes que a cera se solidifique, remova o tecido da caixa de desidratação e coloque-o na estrutura de incorporação e, em seguida, prenda a etiqueta.
- Deixe a cera arrefecer a -20 °C na mesa de congelação. Depois que a cera se solidificar, remova o bloco de cera da estrutura de incorporação e corte-o.
- Coloque o bloco de cera aparado sobre um cortador de parafina, fixado a uma espessura de 5 μm e um tamanho de 2 cm x 2 cm. Após a secção, deixe as secções flutuarem num espalhador com água morna a 45 °C para achatar o tecido. Pegue o lenço de papel com uma lâmina e leve ao forno a 65 °C por 2 h.
- Após a água secar e a cera derreter, retirar a lâmina com o tecido e utilizá-la para coloração de hematoxilina e eosina (HE) e imunohistoquímica (IHQ)16. Certifique-se de que as seções estão aderidas às lâminas para coloração.
3. Coloração HE do tumor primário e pulmão
- Desparafinação
- Coloque as lâminas com as seções em xileno por 10 min.
- Passe para álcool anidro (100%) (duas garrafas) por cerca de 3 min cada.
- Passe para o álcool a 95% (duas garrafas) por cerca de 3 min cada.
- Passe para o álcool a 80% durante cerca de 3 minutos.
- Passe para o álcool a 50% por cerca de 3 min.
- Passe para a água da torneira e lave o álcool por cerca de 1 min.
- Mancha
- Mover as lâminas para a hematoxilina por 8 min.
- Mova as lâminas para a água por 1 min para lavar a hematoxilina; O tecido muda de azul para vermelho.
- Mova as lâminas em álcool de ácido clorídrico a 1% por cerca de 30 s.
- Mova as lâminas para a água, lavando por 5 min.
- Mova as lâminas para eosina por 90 s e, em seguida, lave-as com água por 5 min.
- Mova as lâminas em álcool 50%, álcool 80%, álcool 95% (duas garrafas) e álcool anidro (100%) (duas garrafas), por 1 min cada.
- Mova as lâminas para xileno por 5 min.
- Depois que as lâminas estiverem secas, sela-as com resina neutra.
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Representative Results
Induzimos o mATC para investigar o crescimento tumoral, o tempo de sobrevivência em camundongos e as características patológicas. Após a indução, os camundongos foram imediatamente sacrificados e amostras (tireoide, pulmão e fígado) foram coletadas uma vez que uma das seguintes condições foi encontrada: 1) desconforto respiratório causado pela compressão tumoral; 2) diminuição do apetite e vocalização anormal; 3) letargia incomum; e 4) perda de peso corporal superior a 20%. Durante o processo de amostragem, verificamos que todos os camundongos (12/12) formaram tumores com sucesso após a indução. Registramos o tempo de sobrevida dos camundongos, características/tamanho do tumor e lesões metastizadas.
Macroscopicamente, observamos o seguinte: 1) os tumores eram dolorosos, e o tamanho dos tumores dos lados esquerdo e direito eram inconsistentes; 2) a maioria dos camundongos (11/12) apresentou metástases pulmonares, mas nenhum apresentou metástases hepáticas. Especificamente, o tamanho do tumor foi monitorado por sistemas de ultrassom de alta frequência e imagem fotoacústica (Vevo®3100) durante todo oprocesso17. Com base nos dados ultrassonográficos, a curva de crescimento tumoral (Figura 1A) foi traçada para observar a alteração dinâmica do tamanho tumoral. Além disso, os tumores cresceram lentamente no estágio inicial (o tamanho médio do tumor variou de 9,47 mm 2 a 11,75 mm 2 do Dia 0 ao Dia 60), e tornaram-se dramaticamente mais rápidos no estágio tardio (o tamanho médio do tumor variou de 11,75 mm 2 a 23,95 mm 2 (do Dia 60 ao Dia 100). A maioria dos camundongos foi sacrificada no estágio tardio. Em suma, o mATC com um certo período de latência do tumor precisa ser monitorado de perto após 60 dias para evitar morte relacionada à asfixia.
Por outro lado, o tempo de sobrevivência dos camundongos foi registrado, e uma curva de sobrevivência (Figura 1B) foi construída. A sobrevida mediana da ATAm foi de 130 dias, variando de 56-166 dias. Além disso, metástases pulmonares foram encontradas na maioria dos mATC (aproximadamente 92%) (Figura 1C). Observamos que apenas um camundongo nesta coorte não apresentou metástases pulmonares no exame macroscópico, e seis camundongos apresentaram mais de uma lesão metastática pulmonar. Não foram encontradas metástases hepáticas. Em resumo, esses resultados foram consistentes com o comportamento biológico dos ATC, que são propensos a metástases pulmonares em clínicas.
Além disso, para melhor observar o processo dinâmico do mATC, sacrificamos os camundongos em dois momentos (1 mês e 2 meses após a indução). Realizamos a coloração HE nos tumores primários e nos tecidos pulmonares metastáticos da mATC (Figura 1D). Em 1 mês de tecido induzível, observamos características solidificadas incompletas e a coexistência de estruturas foliculares e células malignas. As estruturas foliculares tireoidianas desapareceram e o tumor se solidificou completamente após 2 meses de indução. A coloração HE do tumor primário revelou que as células tumorais eram morfologicamente diversas, com células gigantes pleomórficas (indicadas por seta vermelha) e fusiformes (indicadas por seta amarela). Também mostrou uma grande variedade no tamanho nuclear, e muitas células continham múltiplos núcleos. Focos metastáticos claros (indicados por um círculo) foram vistos no pulmão. A coloração HE de tecidos pulmonares metastáticos mostrou que o tecido pulmonar normal era uma estrutura reticular com estruturas alveolares claras e espaços aéreos. No entanto, as metástases pulmonares mostraram perda da estrutura reticular normal, espessamento da cavidade aérea e parênquima pulmonar.
Enquanto isso, a coloração IHQ foi realizada para caracterizar ainda mais (Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspase-3) tumores mATC para quantificar a proliferação celular e apoptose, e investigar a infiltração de linfócitos, células T-regulares (Treg) e células mieloides (Figura 2A-D). A coloração anti-Ki-67 foi altamente positiva, variando de 86,9% a 95,07%, demonstrando alto grau de proliferação celular. O anticorpo anti-caspase-3 ativado foi utilizado para testar a taxa de apoptose, variando de 5,2% a 51,9%. Especificamente, a mATC apresentou evidente infiltração de linfócitos T CD8+, cuja razão variou de 0,47% a 10,55% (média: 5,93%). Isso indicou que o mATC não era um tumor imunodesértico, o que era consistente com amostras de ATC. Além disso, a coloração Foxp3 definiu células Treg, que variaram de 0,45% a 25,8%. Além dos linfócitos, F4/80 e Cd206 foram usados para definir macrófagos e macrófagos M2, respectivamente. Observamos que as células mieloides infiltraram extensivamente os tumores (taxa de células positivas para F4/80 de 86,6% para 94,6%; Cd206 positivo para 40,4% para 67,7%, o que foi consistente com a literaturaanterior16. Em resumo, encontramos células tumorais altamente proliferativas, infiltração linfocitária e extensa infiltração de células mieloides na mATC, o que foi consistente com amostras clínicas.
Em conclusão, as amostras de mATC mostraram homogeneidade na dinâmica tumoral, metástases e características patológicas, consistentes com as amostras clínicas. Considerando a taxa de formação tumoral, o mATC foi um modelo murino confiável.
Figura 1: Dinâmica tumoral e características patológicas. (A) Curva de crescimento tumoral de camundongos (n = 5). Cada linha representa um rato: o estágio inicial varia do Dia 0 ao Dia 60, e o estágio tardio varia do Dia 60 ao Dia 100. (B) Curvas de sobrevida de camundongos (n = 12). A sobrevida mediana da ATAm foi de 130 dias, variando de 56 dias a 166 dias. (C) Curvas de metástases pulmonares de camundongos (n = 12). Imagens representativas de dissecção de metástases tireoidianas e pulmonares. A seta vermelha indica o tumor de tireoide e o círculo branco indica metástase no pulmão. (D) Coloração HE do tumor primário (1 mês e 2 meses após a indução) e metástase pulmonar. A seta vermelha indica a célula gigante pleomórfica, a seta amarela indica a célula fusiforme e a área circundada indica uma metástase no pulmão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Breve descrição da infiltração de células imunes no mATC. (A) Coloração imuno-histoquímica de tumores primários murinos ATC com anticorpos (Cd8, Foxp3). A seta vermelha indica uma célula positiva para CD8, a seta amarela indica uma célula positiva para Foxp3. (B) Coloração imunoistoquímica de tumores primários murinos ATC com anticorpos (Ki67, Caspase-3). (C) Coloração imuno-histoquímica de tumores primários murinos ATC com anticorpos (F4/80, Cd206). (D) A quantificação da IHC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Lista dos primers e configurações de PCR utilizadas neste estudo. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Etapas críticas dentro do protocolo de dissecção de tumor de tireoide
Durante a dissecção, a localização anatômica da glândula tireoide precisa ser corretamente compreendida. A glândula tireoide é uma glândula em forma de borboleta localizada no lado dorsal da glândula submandibular perto da cartilagem tireoide e da traqueia. Durante o procedimento, o corte das artérias sanguíneas de ambos os lados do pescoço foi cuidadosamente evitado.
Modificação e solução de problemas da raça mATC
ATC é uma neoplasia maligna rara e altamente agressiva. As características clínicas dos pacientes com mATC e ATC têm certas semelhanças. Especificamente, a principal causa de morte no ATTm é a asfixia, que é consistente com pacientes com ATC. Portanto, durante o experimento, deve-se observar o seguinte: 1) segure suavemente os camundongos e preste atenção à sua respiração durante a operação; 2) monitorar de perto durante a fase tardia para evitar morte súbita e falha na obtenção de amostras a tempo; 3) os tecidos da tireoide e do pulmão são facilmente afetados pelo sangue na superfície dos tecidos para observação e fotografia, de modo que o volume sanguíneo de camundongos pode ser reduzido pela enucleação do globo ocular.
Limitações do uso do mATC
A ocorrência e o desenvolvimento do ATC humano são complexos e mutáveis, mas o background genético do mATC é relativamente simples, que só pode simular uma parte do ATC humano. Por exemplo, alguns tecidos ATC abrigavam mutações TERT e BRAF, a variante18 do número de cópias NOTCH2NL, em vez das mutações P53, que podem ter diferentes mecanismos de tumorigênese e características clínico-patológicas7,19,20. Além disso, a ATC geralmente tem um longo curso de tempo antes do diagnóstico, mas a mATC obtém um diagnóstico após uma indução de 2 meses. Portanto, há distinções inerentes entre mATC e câncer de tireoide humano, modelos animais não podem imitar totalmente todas as características do câncer de tireoide humano, e muitas terapias que são restritas a humanos não podem ser avaliadas em mATC. Além disso, embora o mATC possa ser usado para pesquisar os efeitos terapêuticos de vários medicamentos de moléculas pequenas, vários produtos biológicos (por exemplo, drogas relacionadas a anticorpos ou anticorpos) devem ser projetados especificamente para camundongos. Além disso, todo o processo de construção de camundongos knockout condicionais e, em seguida, a obtenção do genótipo alvo de camundongos por cruzamento leva muito tempo e requer certas condições de cultura de camundongos e custos21,22.
Significado do uso de mATC na pesquisa do câncer de tireoide
A heterogeneidade da população humana e a raridade da ATC humana dificultam a exploração de potenciais mecanismos e opções terapêuticas para a ATC. Como um modelo de camundongo confiável, o mATC facilita a coleta de tecidos ATC e enriquece o pool de amostras de tecido ATC. O mATC também pode ser usado para estudar os efeitos de funções gênicas específicas sobre o ATC, estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento do ATC, entender os mecanismos de progressão do tumor tireoidiano e resistência a drogas e, finalmente, melhorar o prognóstico de pacientes com ATC16.
Aplicações futuras do mATC
O mATC pode ser usado para pesquisas sobre vários aspectos da radioterapia, quimioterapia, terapia gênica, imunoterapia e terapia-alvo. A mATC também pode ser usada para explorar os efeitos terapêuticos e adversos de esquemas, como combinações entre diferentes drogas ou com radioterapia. Posteriormente, utilizamos o mATC para investigar os efeitos terapêuticos da radioterapia combinada com imunoterapia e drogas inibidoras de pequenas moléculas sobre a ATC. Além disso, o mATC pode ser usado para investigar os efeitos de várias modalidades ou rotas de entrega sobre os efeitos antitumorais de medicamentos para desenvolver sistemas de liberação de fármacos com atividade antitumoral aprimorada. Em futuras aplicações clínicas, esperamos minimizar a taxa de recorrência e mortalidade de pacientes com câncer de tireoide e, assim, melhorar a taxa de sobrevida dos pacientes.
Esperamos que mais modelos murinos de ATC sejam desenvolvidos no futuro, bem como análises mais aprofundadas de ATC em diferentes origens genéticas, como PTEN e P13K23. Estes revelarão de forma mais abrangente o mecanismo molecular da tumorigênese e progressão do ATC, predizem o resultado do tratamento com ATC e poderão fornecer aos pacientes potenciais alvos terapêuticos24,25,26,27,28. Esperamos que, através de uma exploração mais experimental, possamos melhorar o método de modelagem do modelo de camundongos e encurtar o tempo de modelagem para fazer mais contribuições à pesquisa básica.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Desenvolvimento de Pesquisa Chave da China (2021YFA1301203); a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); o Projeto de Incubação de Pesquisa Clínica, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); o Projeto de Cooperação Internacional da Secretaria Municipal de Ciência e Tecnologia de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fundação de Ciências Naturais de Sichuan, 2022NSFSC1314; o "projeto 1.3.5 para disciplinas de excelência, West China Hospital, Sichuan University" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); e Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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