Summary
이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.
Abstract
오가노이드는 일차 조직 또는 줄기 세포에서 증식한 후 자기 조직화 특성과 기능 및 구조 유지로 인해 장기 조직을 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 오가노이드 생성 방법은 여러 계대를 통한 단일 세포 분화를 포기하고 대신 차등 원심분리를 사용하여 기계적 및 효소적으로 해리된 조직에서 유방 상피 오가노이드를 분리합니다. 이 프로토콜은 콜라겐 및 기저 세포외 기질에 오가노이드를 포매하는 기술 외에도 마우스와 인간 유방 조직 모두에서 크고 작은 상피 오가노이드를 신속하게 생산하기 위한 간소화된 기술을 제공합니다. 또한, 오가노이드 형태 및 밀도를 시각화하기 위해 겔 내 고정 및 면역형광 염색에 대한 지침이 제공됩니다. 이러한 방법론은 면역 세포와의 공동 배양 및 콜라겐 침습 분석을 통한 생체 외 전이 모델링과 같은 무수한 다운스트림 분석에 적합합니다. 이러한 분석은 세포-세포 거동을 더 잘 설명하고 종양 미세 환경 내의 상호 작용에 대한 보다 완전한 이해를 만드는 데 도움이 됩니다.
Introduction
시험관 내에서 상피 세포를 모델링하는 능력은 생체 내에서 접근할 수 없는 세포 특징을 포착하기 때문에 현대 생물 의학 연구의 기초가 되었습니다. 예를 들어, 2차원 평면에서 상피 세포주를 성장시키면 증식 동안 상피 세포에서 발생하는 분자 변화를 평가할 수 있다1. 또한, 신호전달과 유전자 발현 사이의 동적 조절을 측정하는 것은 생체 내 시스템에서 제한적이다2. 암 연구에서, 암 상피 세포주 모델링은 질병 진행의 분자적 동인과 잠재적인 약물 표적의 식별을 가능하게 했다3. 그러나, 2차원 평면에서 성장하는 암 상피 세포주는 대부분 유전적으로 불멸화되고 변형되며, 종종 본질적으로 클론성이며, 비생리학적 조건에서 성장할 수 있는 능력으로 선택되고, 3차원(3D) 종양 조직 구조에 대한 평가가 제한되며, 현실적인 조직 환경 내에서 미세 환경 상호작용을 적절하게 모델링하지 못하기 때문에 한계가 있다4. 이러한 제약은 전이를 모델링할 때 특히 뚜렷하게 나타나는데, 이는 생체 내에서 먼 장기 부위의 침입, 파종, 순환 및 집락화를 포함한 몇 가지 뚜렷한 생물학적 단계를 포함한다5.
암 상피 오가노이드는 종양의 3D 환경과 거동을 더 잘 요약하기 위해 개발되었습니다 6,7,8. 오가노이드는 단일 LRG5+ 장 섬와(intestinal cryptinal cell)에서 처음 개발되었으며, 시험관 내 소장의 계층적 구조를 유지하는 섬와-융모 단위(orbit-villus unit)의 3D 구조를 나타내기 위해 분화되었다 9. 이 접근 방식은 항상성 및 스트레스 조건에서 자기 조직화 조직 구조의 실시간 시각화 및 특성화를 허용했습니다. 자연적인 확장으로 암 상피 오가노이드는 결장직장암 10, 췌장암 11, 유방암 12, 간 13, 폐암14, 뇌암 15 및 위암 16을 포함한 다양한 암 유형을 모델링하기 위해 개발되었습니다. 암 상피 오가노이드는 암 진화17,18 및 전이성 시공간 행동 19,20을 특성화하고 종양 이질성 21을 조사하고 화학 요법 22를 검사하기 위해 이용되었습니다. 암 상피 오가노이드는 또한 생체 외 항암제 및 방사선 요법에 대한 환자 반응을 예측하기 위해 진행 중인 임상 시험 동안 분리 및 수집되었습니다 8,23,24,25. 또한, 암 상피 오가노이드를 포함하는 시스템은 면역 세포와 같은 다른 비암 세포와 결합하여 종양 미세 환경의 보다 포괄적인 모델을 형성하여 실시간으로 상호 작용을 시각화하고, 암 상피 세포가 자연 살해 세포와 같은 세포독성 이펙터 면역 세포의 근본적인 특성을 어떻게 변화시키는지 밝히고, 잠재적인 면역 요법 및 항체 약물 의존성 세포독성 활성을 테스트할 수 있습니다26. 27,28. 이 기사는 콜라겐 및 기저 세포외 기질(ECM)에 계대 및 포매 없이 상피 오가노이드를 생성하는 방법을 보여줍니다. 또한 분리된 오가노이드의 다운스트림 이미징 기술도 공유됩니다.
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Protocol
이 원고에 사용된 모든 마우스 조직은 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 규정 및 지침에 따라 윤리적으로 수집되었습니다. 마찬가지로, 모든 환자는 IRB(Institutional Review Board)의 감독 하에 조직 기증 전에 동의했으며 샘플은 비식별화되었습니다.
참고: 이 프로토콜은 일차 조직에서 오가노이드 생성을 설명합니다.
1. 하룻밤 재료 준비
- 기저 세포외 기질(BECM)에 포매하기 위해 BECM 분취액을 4°C에 두어 해동합니다.
2. 콜라게나제 및 소혈청알부민(BSA) 코팅액 준비
- 2.64% BSA/PBS 코팅 용액(BSA 용액) 준비: 50mL/0.2μm 필터 플라스크를 사용하여 멸균 필터 50mL의 인산염 완충 식염수(PBS)와 4.10mL의 30% BSA 용액을 사용합니다. 이 BSA 용액은 여과하여 다시 사용할 수 있습니다.
- 마우스 유방 조직용 콜라게나제 용액 준비: 50mL/0.2μm 필터 플라스크를 사용하여 기저 세포 배지 27mL, 소 태아 혈청(FBS) 1.5mL, 50mg/mL 겐타마이신 30μL, 10mg/mL 인슐린 15μL, 0.1g/mL 콜라게나제 A 600μL, 0.1g/mL 트립신 600μL를 멸균 필터합니다. 조직 질량에 따라 마우스당 10mL에서 30mL의 콜라게나제 용액을 할당합니다.
- 인간 유방 조직용 콜라게나제 용액 준비: 멸균 필터 RPMI-1640 18mL, 100x 페니실린-스트렙토마이신 용액(pen/strep) 200μL, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충액, FBS 1mL 및 0.1g/mL 콜라게나제 A 400μL를 50mL/0.2μm 필터 플라스크를 사용합니다. 조직 질량에 따라 조직 샘플당 10mL에서 20mL 사이를 할당합니다.
3. 미디어 준비
- 오가노이드 배지 준비: 50mL/0.2μm 필터 플라스크를 사용하여 1% pen/strep 및 1% Insulin-Transferrin-Selenium(ITS)이 포함된 멸균 필터 기저 세포 배지. 오가노이드 성장 인자 배지를 만들기 위해 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 최종 농도 2.5nM에 추가합니다.
- 유방 상피 배지 준비: 유방 상피 배지 100mL, 100x 글루타민 보충제 1mL, 펜/스트렙 1mL, 10mM HEPES 완충액(7.3 pH) 1mL가 포함된 멸균 필터 고혈당 일반 기저 배지를 만들기 위해, 30% BSA 스톡 250μL, 1mg/mL 콜레라 독소 스톡 1μL, PBS에 50μg/mL 하이드로코르티손 스톡 1mL, 10mg/mL 인간 인슐린 용액 50μL, 50μg/mL 표피 성장 인자(EGF) 스톡 10μL, 150mL/0.2μm 필터 플라스크를 사용하는 1% FBS. 배지를 4°C에서 보관하고 최대 2주 동안 사용하십시오.
- 암포테리신 세척 준비: 2% 펜/연쇄상 구균 및 2% 암포테리신 B가 포함된 멸균 필터 PBS. 4°C에서 보관하십시오.
4. 조직 수집 및 소화
- 마우스 유방 조직
- 마우스를CO2 챔버에 2-5분 동안 넣어 안락사시킨 다음 자궁경부 탈구를 따릅니다. 복부 쪽이 위를 향하도록 하여 마우스 팔다리를 벌리고 4개의 19G 바늘을 사용하여 흡수 패드로 덮인 보드에 발로 마우스를 고정합니다. 70% 에탄올을 뿌려 털을 매끄럽게 하고 피부를 소독합니다. 거즈 패드나 티슈로 대변을 닦아냅니다.
- 항문 생식기 부위 바로 위에서 시작하여 복막을 뚫지 않도록 주의하면서 수술용 가위를 사용하여 정중선에서 위쪽으로 자릅니다. 턱에 도달하면 양쪽 쇄골과 뒷다리를 옆으로 자르고 마우스의 피부를 팽팽하게 보드에 고정하여 유방 지방 패드를 노출시킵니다.
- 뒷다리 근처에 위치한 사타구니 림프절을 식별하여 야생형 마우스에서 사타구니 유방 지방 패드를 찾습니다. 야생형 마우스의 흉부 유방 지방 패드를 앞다리 아래의 더 두꺼운 혈관 조직으로 찾습니다.
- 집게를 사용하여 유방 지방 패드를 들어 올리십시오. 밑에 있는 근육을 모으지 마십시오. 날카롭고 뭉툭한 가위의 뭉툭한 끝을 사용하여 유방 지방 패드 아래에 피부에서 떨어진 주머니를 만듭니다. 유방 지방 패드를 한 조각으로 잘라냅니다.
- 유방 지방 패드가 제거되면 멸균 조직 배양 접시에 넣기 전에 PBS로 헹굽니다. 조직 배양 후드로 빠르게 옮깁니다.
참고: 유방 종양의 경우 PBS를 적신 면봉을 사용하여 종양을 피부에서 부드럽게 굴립니다. 어두운 변색은 건강한 오가노이드를 생성하지 않는 괴사를 나타내므로 어둡거나 부드러운 부분을 피하십시오. - #10 또는 #11 메스로 유방 종양을 다져 페이스트와 같은 농도가 될 때까지 조직을 느슨하게 합니다. 메스를 사용하여 다진 조직을 10-30 mL의 콜라게나제 용액이 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 조직이 수집되도록 하기 위해 콜라게나제 용액 1mL를 조직 배양 플레이트에 피펫하고 다시 원뿔형 튜브에 넣습니다.
참고: 더 큰 오가노이드를 생산하려면 기계적 분해를 최소화하고 눈에 보이는 작은 조직 조각을 그대로 두어야 합니다. 대안적으로, 조직은 생존력의 손실을 최소화하면서 추후 오가노이드 제조를 위해 냉동 보관할 수 있습니다. 이렇게하려면 PBS 또는 기저 세포 배지 + 1 % FBS 용액으로 조직을 씻은 다음 표면적을 늘리기 위해 굵게 다진 것입니다 (조직을 하나 또는 두 개의 단단한 조각으로 유지). 조직을 냉동 매체(90% FBS + 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO))가 있는 극저온 바이알로 옮깁니다. 액체 질소 저장소로 이동하기 전에 제어된 속도의 냉동 용기에서 바이알을 밤새 동결합니다. - 조직이 뻣뻣해지고 콜라게나제 용액이 흐려질 때까지 180RPM에서 37°C 벤치탑 진탕 인큐베이터에 원뿔형 튜브를 놓습니다. 예를 들어, 종양에서 큰 조직 덩어리 (약 500-800mg)는 30-60 분이 걸립니다. 야생형 유방 지방 패드의 더 작은 조직 덩어리(약 100-300mg)는 약 20-30분이 걸립니다. 확실하지 않은 경우 5분 간격으로 확인하십시오.
- 인큐베이션 후, 원뿔형 튜브를 실온(RT)에서 550 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.
- 원뿔형 튜브에서 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
참고: 앞으로 모든 피펫 팁, 혈청학적 피펫 및 원뿔형 튜브를 BSA 용액으로 미리 코팅하여 플라스틱에 대한 접착으로 인한 오가노이드 손실을 방지하십시오. - 8mL의 기저 세포 배지와 80μL의 DNase 용액[2U/μL]을 튜브에 추가합니다. 1-3분 동안 부드럽게 뒤집습니다.
- 12mL의 기본 세포 배지를 튜브에 넣고 피펫팅으로 조심스럽게 혼합하거나 튜브를 부드럽게 15회 돌려 혼합합니다.
- RT에서 550 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
- 상층액을 흡인 한 다음 펠릿을 12mL의 기저 세포 배지에 재현탁합니다.
- 가장 무거운 조직 조각이 바닥에 가라 앉도록하십시오. 혈청학적 피펫으로 상층액을 수집하고 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 이 현탁액에는 상피 오가노이드와 기질/면역 세포가 포함되어 있습니다.
- 인간의 유방 조직
- 오가노이드에 대한 인간 유방 조직 샘플을 처리하거나 수집 후 24시간 이내에 보관하십시오. 샘플을 4°C에서 1% 100x 항생제-항진균제가 함유된CO2-Independent media에 보관한다.
- 조직을 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 기울이고 과잉 저장 매체를 흡인한 다음 암포테리신 B 세척액 5mL로 조직을 헹굽니다. 암포테리신 B 세척액을 즉시 제거하십시오.
- #10 또는 #11 메스로 조직 샘플을 다져 페이스트와 같은 농도가 될 때까지 조직을 느슨하게 합니다. 메스를 사용하여 다진 조직을 10-30 mL의 콜라게나제 용액이 들어있는 원추형 튜브로 옮깁니다. 모든 조직이 수집되도록 하기 위해 콜라게나제 용액 1mL를 조직 배양 플레이트에 피펫팅하고 원뿔형 튜브로 돌아갑니다.
참고: 더 큰 오가노이드를 생산하려면 기계적 분해를 최소화하고 눈에 보이는 작은 조직 조각을 그대로 두어야 합니다. 이 프로토콜의 시작 조직 질량은 100-250mg 범위였습니다. 대안적으로, 조직은 위와 같이 90% FBS + 10% DMSO 중 4.2.2 단계 후 생존력의 손실을 최소화하면서 추후 오가노이드 제조를 위해 냉동 보관할 수 있다. - 조직이 작아지고 콜라게나아제가 흐려질 때까지 180RPM에서 37°C 벤치탑 진탕 인큐베이터에 원뿔형 튜브를 놓습니다. 5분 간격으로 티슈를 확인합니다. 인간 샘플의 콜라게나제 해리는 약 5-20분이 소요됩니다.
- 배양 후 RT에서 550 x g 에서 10분 동안 원뿔형 튜브를 회전시킵니다.
- 원뿔형 튜브에서 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
참고: 앞으로 모든 피펫 팁, 혈청학적 피펫 및 원뿔형 튜브를 BSA 용액으로 미리 코팅하여 플라스틱에 대한 접착으로 인한 오가노이드 손실을 방지합니다. - 4mL의 기본 세포 배지와 40μL의 DNase 용액[2U/μL]을 원뿔형 튜브에 추가합니다. 3분 동안 부드럽게 뒤집습니다.
- 6mL의 기저 세포 배지를 튜브에 넣고 피펫팅으로 조심스럽게 혼합하거나 원뿔형 튜브를 부드럽게 15회 돌려 혼합합니다.
- RT에서 550 x g 에서 10분 동안 원심분리기.
- 상층액을 흡인 한 다음 펠렛을 10mL의 기저 세포 배지에 재현탁합니다.
- 가장 무거운 조직 조각이 바닥에 가라 앉도록하십시오. 상층액을 모아 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 이 현탁액에는 상피 오가노이드와 기질/면역 세포가 포함되어 있습니다.
5. 차동 원심 분리
- RT에서 3-4초 동안 550 x g 로 펄스하고, 상층액을 흡인하고, 펠릿을 10mL의 기저 세포 배지에 재현탁합니다. 이 단계를 세 번 더 반복합니다(총 4회 회전).
- 각 원심분리 후, 펠릿이 점점 불투명해지는지 확인하십시오. 이 나머지 펠릿은 상피 오가노이드가 될 것입니다.
6. 작은 오가노이드 수집
- RT에서 3초 동안 80-100 x g로 펄스합니다. 상층액을 신선한 BSA 코팅 튜브에 모은 다음 RT에서 3초 동안 550 x g 로 펄스하여 작은 오가노이드를 펠릿화합니다.
7. BECM에 오가노이드 삽입
- 웰당 BECM의 양에 대한 오가노이드 밀도에 따라 미세원심분리 튜브에 오가노이드의 적절한 현탁액을 분취합니다(표 1). 예를 들어, 96웰 플레이트의 한 웰에서 BECM 20μL에 대해 50-100 오가노이드를 사용합니다.
참고: 오가노이드 밀도는 다음 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다: ((평균 오가노이드 수)/50μL) x 희석 계수. - 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오. 해동된 BECM을 조직 배양 후드의 얼음 위에 놓습니다. 후드를 준비하는 동안 모든 피펫 팁을 얼음 위에 올려 식힙니다.
- RT에서 300 x g 에서 10분 동안 미세 원심분리기 튜브를 원심분리하고 튜브에서 상층액을 버립니다. 오가노이드 펠릿이 있는 튜브를 얼음으로 옮기고 각 미세 원심분리기 튜브에 적절한 양의 BECM을 추가합니다(표 1).
알림: BECM은 점성이 있으므로 피펫 팁의 손실을 설명하기 위해 BECM의 추가 부피(돔 부피의 약 10%-20% 추가)를 추가하십시오. - 기포가 생성되지 않도록 주의하면서 BECM에서 오가노이드를 다시 현탁하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫을 합니다.
- BECM 부유 오가노이드를 도금 표면에 천천히 조심스럽게 피펫팅합니다. 피펫팅하는 동안 피펫을 천천히 올려 돔을 만듭니다. 습도를 유지하기 위해 모든 빈 우물을 PBS로 채 웁니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 BECM이 고형화되도록 한 다음 적절한 부피의 배지로 덮습니다(표 1).
8. 콜라겐에 오가노이드 함유
- 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오. 15mL 원뿔형 튜브에 375μL의 10x DMEM, 100μL의 1N 수산화나트륨(NaOH) 및 3mL의 쥐꼬리 콜라겐 I 용액을 순차적으로 조합하여 콜라겐 용액을 준비합니다. 거품이 생기지 않도록주의하면서 피펫 믹스. 필요에 따라 소량의 NaOH 또는 10x DMEM을 사용하여 용액을 7.2-7.4의 pH로 적정합니다.
- 우물 바닥을 완전히 덮는 데 필요한 최소한의 콜라겐으로 우물 바닥을 코팅하십시오. 한 가지 방법은 소량의 콜라겐을 넣고 접시를 좌우로 흔들어 코팅하는 것입니다. 콜라겐 언더레이를 37°C에서 30분-2시간 동안 설정합니다.
- 오가노이드의 적절한 현탁액을 웰당 콜라겐의 양에 대한 오가노이드 밀도에 따라 미세원심분리 튜브에 분취합니다(표 1). 37°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 콜라겐 용액을 4°C에서 보관하고 10분마다 현미경으로 섬유 형성을 확인하여 중합을 모니터링합니다. 콜라겐은 30분-2시간 사이에 적절한 중합에 도달합니다.
참고: 적절한 중합은 매트릭스 전체에 걸쳐 분기되는 섬유의 존재에 의해 결정될 수 있습니다. 시야에서 몇 개의 섬유가 관찰되면 즉시 8.5단계로 진행합니다. - 미세 원심분리기 튜브를 300 x g 에서 RT에서 10분 동안 원심분리합니다. 오가노이드 펠릿을 얼음으로 옮기고 각 미세 원심분리기 튜브에 적절한 부피의 콜라겐을 추가합니다(표 1).
알림: 콜라겐은 점성이 있으므로 피펫 팁의 손실을 설명하기 위해 콜라겐의 추가 부피(돔 부피의 약 10%-20% 추가)를 추가하십시오. - 위아래로 부드럽게 피펫을 넣어 콜라겐의 오가노이드를 재현탁하고 거품이 생기지 않도록 주의합니다.
- 콜라겐 현탁 오가노이드를 도금 표면에 천천히 조심스럽게 피펫팅합니다. 피펫팅하는 동안 피펫을 천천히 올려 돔을 만듭니다. 습도를 유지하기 위해 모든 빈 우물을 PBS로 채 웁니다.
- 플레이트를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 콜라겐이 굳을 수 있도록 한 다음 적절한 부피의 배지로 덮습니다(표 1).
- 참고 : 오가노이드는 최대 7일 동안 3D 매트릭스에서 생존력을 유지합니다. 이미징을 분석에 사용하는 경우 9단계와 10단계로 진행합니다.
9. 내장된 오가노이드 고정
- 피펫을 사용하여 ECM 돔과 접촉하지 않고 웰에서 모든 매체를 제거합니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)/PBS 용액으로 5분 동안 고정합니다.
- PBS를 천천히 움직이는 셰이커에 놓은 후 웰에 적용하여 2-3 번 씻으십시오. 세척 후 신선한 PBS를 돔에 바르고 플레이트를 4°C에서 보관합니다.
10. 포매된 오가노이드의 면역형광 염색
- 면역형광염색을 위한 용액 준비
- 투과화 완충액: 10% Triton X-100이 함유된 PBS 용액을 준비한다.
- 블로킹 버퍼: 10% FBS 및 0.2% 트리톤 X-100을 함유한 PBS 용액을 준비한다.
- 항체 희석 완충액: 2% FBS 및 0.2% Triton X-100으로 PBS 용액을 준비합니다.
- 투과화 및 차단
- ECM 돔을 덮을 수 있는 충분한 투과화 버퍼를 피펫팅합니다. 천천히 움직이는 셰이커에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
- 피펫으로 투과화 완충액을 제거하고 동일한 부피의 차단 완충액을 3시간 동안 도포합니다.
- 1차 항체 배양
- 피펫으로 블로킹 완충액을 제거하고 제조업체가 지정한 농도로 1차 항체가 포함된 항체 희석 완충액을 적용합니다. 천천히 움직이는 셰이커에서 4°C에서 12-16시간 동안 샘플을 배양합니다.
- 1차 항체 용액을 제거하고, 천천히 움직이는 진탕기 상에서 RT에서 PBS로 10분 동안 샘플을 3회 세척한다.
- 2차 항체 배양 및 핵 염색
- 남은 PBS 세척을 흡인하고 제조업체가 지정한 농도의 2차 항체가 포함된 항체 희석 완충액을 적용합니다. 또한 DAPI 또는 Hoechst(핵 라벨링) 또는 phalloidin(액틴 라벨링)을 1:250 비율로 버퍼에 추가합니다. 천천히 움직이는 셰이커에서 RT에서 2-4 시간 동안 배양하십시오.
- 2차 항체 용액을 제거하고 샘플을 진탕기 상에서 RT에서 PBS로 10분 동안 3회 세척한다. 이미징될 때까지 샘플을 4°C에서 PBS에 보관합니다.
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Representative Results
그림 1에 표시된 이미지는 인간 및 마우스 조직에서 채취한 야생형 및 종양성 유방 상피 오가노이드의 예를 제공합니다. 차등 원심분리를 통해 상피 오가노이드를 분리하는 방법에 대한 한 눈에 볼 수 있는 그림은 그림 1A의 카툰 워크플로우에 제공되어 명시야 이미지에 표시된 대로 상피 조직을 생성하면서 서로 다른 종의 1차 조직을 거의 동일한 방식으로 처리할 수 있음을 보여줍니다(그림 1B ). 또한, 이러한 종간 조직 구성 유사성은 도 2A-D에 표시된 기저 세포외 기질 또는 콜라겐에 포매된 오가노이드의 면역형광 이미지에서 볼 수 있다. 오가노이드 구조는 액틴의 멤브레인 토마토(mTomato) 라벨링 또는 팔로이딘 염색을 통해 시각화할 수 있습니다. 이 수치는 또한 이 방법을 사용하여 예상되는 오가노이드 조성과 크기를 보여줍니다. 콜라겐 매트릭스에 내장된 오가노이드는 침습 분석에 사용할 수 있으며 그림 2C에서 볼 수 있듯이 오가노이드 자체에서 분기되는 덩굴손의 확장을 추적하여 분석할 수 있습니다. 마지막으로, 파라핀이 포매된 오가노이드의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색은 오가노이드가 유방암과 동일한 조직학을 유지한다는 것을 보여줍니다(그림 2E).
그림 1: 오가노이드의 예를 사용한 상피 오가노이드 생성을 위한 워크플로우. (A) 계대배양 없이 마우스 또는 인간 조직에서 오가노이드 생성을 위한 워크플로 스키마. (B) 분리 후 배지에서 마우스 WT 유선, 마우스 유방 종양 및 인간 유방 종양에서 분리된 상피 오가노이드의 대표 이미지. 각 이미지는 향상된 시각화를 위해 밝기와 대비에 대해 개별적으로 조정되었습니다. 이미지는 10x 배율의 도립 epi-fluorescent 현미경에서 명시야로 촬영되었습니다. 스케일 바는 20μm를 나타냅니다. 유방 종양은 MMTV-PyMT 마우스로부터 분리되었고; 정상 유방 조직은 FVB 마우스로부터 분리하였다. 마우스는29세의 8-14주 범위였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포외 기질의 오가노이드 이미징. 각 이미지는 이 컬렉션의 향상된 시각화를 위해 밝기와 대비에 대해 개별적으로 조정되었습니다. 이미징 전에 샘플을 4% 파라포름알데히드로 고정했습니다. 야생형 샘플을 phalloidin 568로 염색하여 세포막을 시각화하고 모든 샘플을 Hoechst로 염색하여 핵을 시각화하여 오가노이드 형태와 밀도를 보여주었습니다. 이미지는 컨포칼 현미경에서 10배 배율로 촬영되었으며 3.003의 스캐닝 줌으로 더욱 확대되었습니다. DAPI를 검출하는 데 사용된 레이저 파장은 5의 전력으로 405nm였고 팔로이딘을 검출하는 데 사용된 레이저 파장은 0.5의 전력으로 채널 3에 대해 561.0nm였습니다. 공초점 핀홀 크기는 모든 이미지에 대해 19.16으로 유지되었습니다. (A) 0일째 BECM에 내장된 마우스 유방 WT 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지. (A') 1:250 Hoechst 표지 핵 및 (A'') 1:250 팔로이딘 표지 액틴 면역형광 이미지 A. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. 정상 유방 조직은 FVB 마우스로부터 분리하였다. 마우스는 8-12주령의 범위였다. (B) 0일째 BECM에 내장된 마우스 유방 종양 오가노이드의 대표 명시야 이미지. (B') 1:250 Hoechst 표지 핵 및 (B'') mTomato-표지된 B. 스케일 바의 면역형광 이미지는 20 μm를 나타낸다. 유방 종양은 MMTV-PyMT 마우스로부터 분리되었다. 마우스는 12-14주령의 범위였습니다. (C) 3일째 콜라겐 I에 내장된 마우스 유방 종양 오가노이드의 대표 명시야 이미지. 이미지는 "침습적" 특성을 나타내는 오가노이드를 나타냅니다. (C') 1:250 Hoechst 표지 핵 및 (C') c. Scale bar의 mTomato-표지된 면역형광 이미지는 20 μm를 나타낸다. 유방 종양은 MMTV-PyMT 마우스로부터 분리되었다. 마우스는 12-14주령의 범위였습니다. (D) 0일째 BECM에 내장된 인간 유방 종양 오가노이드의 대표 명시야 이미지. (디') Hoechst 표지 핵 및 (D'') 1:250 액틴-표적 팔로이딘-표지된 면역형광 이미지 D. 스케일 바는 20 μm를 나타낸다. (E) BECM에 포매되고 20x 배율로 촬영된 H&E로 염색된 오가노이드의 절편 이미지. 스케일 바는 20 μm를 나타내고, H&E 염색은 University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource30에 의해 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배양 접시 | ECM 돔 볼륨 | 권장 오가노이드 수 | 미디어 볼륨 |
| 6웰 플레이트 | 200 μL | 300 | 3 밀리리터 |
| 12웰 플레이트 | 150 μL | 225 | 2 밀리리터 |
| 24웰 플레이트 | 100 μL | 150 | 1 mL |
| 48웰 플레이트 | 40 마이크로리터 | 60 | 300 μL |
| 96웰 플레이트 | 20 마이크로리터 | 30 | 150 μL |
표 1: 돔에 권장되는 ECM 성분의 부피, 오가노이드의 밀도 및 다양한 배양 플레이트에서 웰당 필요한 배지의 부피.
| 문제 | 잠재적 원인 | 용액 | |||
| ECM 돔이 무너졌습니다. | 플레이트가 흔들리거나, ECM 부피가 너무 커서 돔 모양을 유지할 수 없거나, 돔이 우물 가장자리에 닿아 달라붙어 떨어졌습니다. | 돔이 굳기 전에 플레이트를 너무 세게 움직이지 말고, 오가노이드의 재현탁에 사용되는 ECM의 부피를 줄이거나, 플레이트 중앙에 돔을 피펫팅하는 데 매우 주의하십시오. | |||
| 오가노이드처럼 보이지 않는 조직이 있습니다. | 근육 조직 또는 신경은 유방 지방 패드를 채취하는 과정에서 수집되었을 수 있습니다. | 분명히 유방 지방 패드인 것만 잘라내십시오. 피부에 단단히 붙어있는 조직을 제거하지 마십시오. | |||
| 죽은 오가노이드가 많이 있습니다. | 괴사성 종양 조직을 적출하였다. | 괴사성, 낭포성, 지나치게 부드럽거나 색이 어두운 종양에서 조직을 수집하지 마십시오. 종양 조직은 단단해야합니다. | |||
| 오가노이드보다 단세포가 더 많습니다. | 조직이 너무 잘게 다듬어졌거나 콜라게나제 분해가 너무 오래 실행되었습니다. | 조직을 과도하게 다듬거나 콜라게나제 배양 시간을 줄이지 마십시오. | |||
| ECM에는 거품이 있습니다. | 피펫팅에 의한 재현탁은 너무 강렬했고, 돔을 피펫팅하는 동안 배출이 너무 빨랐습니다. | ECM의 오가노이드를 천천히 재현탁하고 천천히 돔에 피펫팅합니다. 문제가 지속되면 피펫팅하는 동안 두 번째 정류장으로 가지 마십시오. | |||
| 콜라겐 내에는 오가노이드의 침입이 없습니다. | 콜라겐이 제대로 중합되지 않았거나 과중합되었습니다. | 적절하게 중합될 때까지 오가노이드를 콜라겐에 재현탁하지 마십시오. 30분마다 확인하십시오. 중합이 보이지 않으면 2시간 표시에서 다시 현탁하고 즉시 플레이트합니다. | |||
| 중합을 지켜보는 동안 콜라겐 섬유가 보이지 않습니다. | 현미경 설정은 좋지 않았습니다. | 최대 어둠을 위해 위상차를 조정한 다음 현미경의 밝기를 완전히 높입니다. 또한 배율을 높이면 시청률이 향상될 수 있습니다. | |||
| ECM 돔이 해체되었습니다. | 고정 시간이 너무 길거나 PFA가 ECM 내장 샘플에서 완전히 제거되지 않았습니다. | ECM 돔 고정 시간을 5분 미만으로 유지하고 회전하는 셰이커에서 각각 5분 동안 5회 세척합니다. | |||
표 2: 잠재적인 문제, 원인 및 해결 방법 표.
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Discussion
종양 오가노이드를 생성하기 위한 상이한 방법이 문헌에 기재되어 있다. 이 프로토콜은 계대시지 없이 종양으로부터 직접 종양 오가노이드를 생성하는 방법을 강조합니다. 이 방법을 사용하면 종양 오가노이드가 시술 시작 후 몇 시간 내에 생성될 수 있으며 문헌31에 보고된 70%에 비해 100%에 가까운 생존 가능한 오가노이드를 생성합니다. 이에 비해 다른 방법은 몇 주에 걸쳐 세포를 오가노이드로 연속적으로 계대배양해야 합니다. 따라서 장기 배양의 영향 없이 동일한 숙주에서 일치하는 오가노이드 및 면역 샘플과의 면역 세포 상호 작용을 결정하고 시각화하는 것과 같은 다운스트림 응용 프로그램이 더 실현 가능해집니다. 또한, 도 2C에서 강조된 바와 같이, 상이한 세포외 매트릭스에 종양 오가노이드를 매립시키면 원발성 종양으로부터의 침범과 같은 전이성 캐스케이드 전반에 걸쳐 주요 표현형을 식별할 수 있다. 다른 다운스트림 응용은 다양한 상피 세포 거동을 평가하기 위한 분지 형태 형성(branching morphogenesis)32, 침습, 파종 및 집락 형성(colony formation)33 의 표현형 분석(phenotypic assay)을 포함한다. 면역 상호작용은 또한 이러한 오가노이드 기반 분석을 통해 기능적으로나 시각적으로 캡처할 수 있습니다. 또한, 겔을 용해시켜 표준 생화학 및 유동 기반 분석을 사용하여 유전 및 단백질 함량의 다운스트림 분석을 위해 포매된 세포를 분리할 수 있습니다. 마지막으로, 종양 조직에서 대량의 오가노이드를 빠르게 생성할 수 있기 때문에 이러한 분석은 약물 스크리닝 응용 분야 및 임상 시험 워크플로에 통합하기 위해 확장될 수 있습니다.
이 프로토콜에 중요한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 콜라게나제 소화에 필요한 시간은 조직 조성 및 소화되는 조직의 양에 따라 달라진다. 예를 들어, 인간 유방 종양 수술 샘플 (평균 100-250 mg)과 같은 작은 조직 조각으로 작업 할 때 더 짧은 소화 시간이 필요합니다. 그러나 마우스에서 채취한 유방 종양은 크기가 훨씬 크며(500-800mg) 30-60분의 효소 소화가 필요할 수 있습니다. 둘째, 상피 오가노이드의 최대 수율을 보장하기 위해 모든 피펫 팁과 혈청학적 피펫을 BSA로 코팅하여 세포 부착으로 인한 플라스틱으로의 손실을 방지하는 것도 중요합니다. 셋째, 짧은 차등 원심분리 시간은 비상피 조직 구성 요소를 제거하는 데 중요합니다. 이 접근법은 더 무거운 상피 오가노이드가 펠릿화되는 동안 더 가벼운 기질 및 면역 구획이 상층액에 남아 있도록 합니다. 콜라겐에 오가노이드를 매립하여 침습 분석을 생성하려면 오가노이드를 포매하기 전에 콜라겐의 적절한 중합을 허용하는 것이 중요합니다. 이 단계는 광학 현미경으로 콜라겐 섬유 형성을 확인하여 육안으로 확인해야 합니다. 마지막으로, 최상의 이미징 결과를 얻으려면 ECM 및 도금에서 오가노이드를 재현탁할 때 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 기포는 젤 내의 오가노이드를 가리고 이미지를 왜곡합니다. 표 2 에는 직면한 잠재적인 문제와 이러한 문제를 극복하기 위한 솔루션이 나열되어 있습니다.
프로토콜의 특정 단계에서는 생성된 오가노이드의 크기를 사용자 지정하거나 프로토콜을 실행하는 데 필요한 시간을 줄이기 위한 수정을 허용합니다. 예를 들어, 기계적 분해 시간의 지속 시간을 늘리면 콜라게나제 분해 시간이 짧아지고, 오가노이드가 작아지고, 개별 세포가 더 많아질 수 있습니다. 콜라게나제 분해 후 원심분리는 다량의 종양 조직으로 작업하는 경우 5분으로 단축될 수 있습니다. 오가노이드 배양 및 성장에 사용되는 배지는 오가노이드 생성 단계 동안 시간을 절약하기 위해 하루 전에 준비할 수 있습니다. 유사하게, 종양 조직은 오가노이드 준비 전에 적절한 배지에 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다. 시간이 극히 제한된 경우 이 프로토콜에는 수집 당일 종양 조직을 동결하여 단계를 일시 중지하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 이러한 냉동 조직을 사용하여 나중에 생존 가능한 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 냉동 조직에서 유래한 오가노이드의 약 90%가 생존 가능했으며, 광학 현미경과 트리판 블루 용액으로 육안으로 확인했습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 접근법은 생존 가능한 오가노이드를 빠르게 생성하지만 생성되는 오가노이드의 양은 종양 조직의 양에 의해 제한됩니다. 이러한 제한은 종양 조직의 양이 적거나 때로는 몇 개의 세포로 제한되는 임상 샘플로 작업할 때 특히 분명해집니다. 출발 물질로 몇 개의 세포만 회수할 수 있는 극단적인 경우에는 계대배양이 더 나은 선택일 수 있습니다. 또 다른 한계는 이 방법의 환원주의적 접근이다. 섬유아세포 또는 내피 세포와 같은 기질 구획의 제거는 상피 오가노이드 생성을 풍부하게 합니다. 그러나 이러한 세포 집단은 종양의 기능에 중요합니다. 따라서 이들의 제거는 상피 오가노이드 모델에서만 파생된 종양 생물학의 해석을 제한합니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 다운스트림 이미징, 기능적(면역 상호작용 포함) 및 약물 스크리닝 응용 분야에서 즉시 사용할 수 있는 상피 오가노이드의 빠른 생성을 위한 접근 방식을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation 및 NCI/UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543에서 제공한 자금의 지원을 받았습니다. 우리는 수상 번호 P30 CA142543에 따라 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에서 부분적으로 지원하는 Simmons Comprehensive Cancer Center의 공유 리소스인 University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource의 도움을 인정합니다. Chan Lab의 모든 구성원에게 특별한 감사를드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
References
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