Summary
Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.
Abstract
Mitochondriën, die de krachtpatsers van de cel zijn, spelen een belangrijke rol in de bio-energetica, het genereren van vrije radicalen, calciumhomeostase en apoptose. Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole en wordt over het algemeen bestudeerd met behulp van microscopische observatie, maar in vivo mitofagie-assays zijn moeilijk uit te voeren. Het evalueren van mitofagie door levende organellen in beeld te brengen is een alternatieve en noodzakelijke methode voor mitochondriaal onderzoek. Dit protocol beschrijft de procedures voor het gebruik van de celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof MitoTracker Green en de rood-fluorescerende lysosoomkleurstof LysoTracker Red in levende cellen, inclusief het laden van de kleurstoffen, visualisatie van de mitochondriën en het lysosoom, en verwachte resultaten. Gedetailleerde stappen voor de evaluatie van mitofagie in levende cellen, evenals technische opmerkingen over microscoopsoftware-instellingen, worden ook verstrekt. Deze methode kan onderzoekers helpen mitofagie te observeren met behulp van live-cell fluorescerende microscopie. Bovendien kan het worden gebruikt om mitochondriën en lysosomen te kwantificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen.
Introduction
Mitochondriën zijn de krachtpatsers van bijna alle eukaryote cellen 1,2. Naast ATP-productie door oxidatieve fosforylering spelen mitochondriën een vitale rol in andere processen zoals bio-energetica, calciumhomeostase, vrije radicalengeneratie, apoptose en cellulaire homeostase 3,4,5. Omdat mitochondriën reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren uit meerdere complexen in de elektronentransportketen, worden ze voortdurend gestimuleerd door potentiële oxidatieve stress, wat uiteindelijk kan leiden tot structurele schade en disfunctie wanneer het antioxidantafweersysteem instort 6,7. Mitochondriale disfunctie blijkt bij te dragen aan vele ziekten, waaronder metabole stoornissen, neurodegeneratie en hart- en vaatziekten8. Daarom is het cruciaal om gezonde mitochondriale populaties en hun juiste functie te behouden. Mitochondriën zijn zeer plastische en dynamische organellen; hun morfologie en functie worden gecontroleerd door mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen, waaronder posttranslationele modificaties (PTM) van mitochondriale eiwitten, mitochondriale biogenese, fusie, splijting en mitofagie 9,10. Mitochondriale splijting gemedieerd door dynamin-gerelateerd eiwit 1 (DRP1), een GTPase van de dynamin superfamilie van eiwitten, resulteert in kleine en ronde mitochondriën en isoleert de disfunctionele mitochondriën, die kunnen worden opgeruimd en afgebroken door mitofagie11,12.
Mitofagie is een cellulair proces dat selectief mitochondriën afbreekt door autofagie, meestal optredend in beschadigde mitochondriën na letsel, veroudering of stress. Vervolgens worden deze mitochondriën aan lysosomen geleverd voor afbraak10. Mitofagie is dus een katabolisch proces dat helpt de kwantiteit en kwaliteit van mitochondriën in een gezonde toestand te behouden in een breed scala aan celtypen. Het speelt een cruciale rol bij het herstel van cellulaire homeostase onder normale fysiologische en stressomstandigheden13,14. Cellen worden gekenmerkt door een complex mitofagiemechanisme, dat wordt geïnduceerd door verschillende signalen van cellulaire stress en ontwikkelingsveranderingen. Mitofagie regulerende routes worden geclassificeerd als ubiquitine-afhankelijk of receptor-afhankelijk15,16; de ubiquitine-afhankelijke autofagie wordt gemedieerd door het kinase PINK1 en de rekrutering van ubiquitineligase Parkin E3 naar de mitochondriën 17,18, terwijl receptorafhankelijke autofagie de binding van autofagiereceptoren aan de microtubule-geassocieerde eiwitlichtketen LC3 omvat die mitofagie bemiddelt als reactie op mitochondriale schade19.
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is de meest gebruikte methode, en nog steeds een van de beste methoden, om mitofagie te observeren en te detecteren20. De morfologische kenmerken van mitofagie zijn autofagosomen of autolysosomen gevormd door de fusie van autofagosomen met lysosomen, die kunnen worden waargenomen op elektronenmicroscopiebeelden21. De zwakte van elektronenmicroscopie (EM) is echter het onvermogen om de dynamische processen van mitofagie, zoals mitochondriale depolarisatie, mitochondriale splijting en fusie van autofagosomen en lysosomen, in de levende celte volgen 20. Het evalueren van mitofagie door middel van beeldvorming van levende organellen is dus een aantrekkelijke alternatieve methode voor mitochondriaal onderzoek. De hier beschreven live cell imaging-techniek maakt gebruik van twee fluorescerende kleurstoffen om mitochondriën en lysosomen te kleuren. Wanneer mitofagie optreedt, worden beschadigde of overbodige mitochondriën die door autofagosomen worden overspoeld, groen gekleurd door de mitochondriale kleurstof, terwijl de rode kleurstof de lysosomen kleurt. De fusie van deze autofagosomen en lysosomen, aangeduid als autolysosomen, zorgt ervoor dat de groene en rode fluorescentie elkaar overlappen en zich manifesteren als gele stippen, wat wijst op het optreden van mitofagie22. De celpermeante mitochondriakleurstof (MitoTracker Green) bevat een mild thiol-reactieve chloromethylgroep om mitochondriën23 te labelen. Om mitochondriën te labelen, worden cellen eenvoudig geïncubeerd met de kleurstof, die passief over het plasmamembraan diffundeert en zich ophoopt in actieve mitochondriën. Deze mitochondriale kleurstof kan gemakkelijk levende cellen kleuren en is minder effectief in het kleuren van aldehyde-vaste of dode cellen. De lysosoomkleurstof (LysoTracker Red) is een fluorescerende acidotrope sonde die wordt gebruikt voor het labelen en volgen van zure organellen in levende cellen. Deze kleurstof vertoont een hoge selectiviteit voor zure organellen en kan levende cellen effectief labelen in nanomolaire concentraties24.
De procedures voor het gebruik van deze fluorescerende kleurstoffen in levende cellen, inclusief het laden van de kleurstoffen en de visualisatie van mitochondriën en lysosomen, worden hier gepresenteerd. Deze methode kan onderzoekers helpen mitofagie te observeren met behulp van live-cell fluorescerende microscopie. Het kan ook worden gebruikt om mitochondriën en lysosomen te kwantificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celkweek en passaging
OPMERKING: Het protocol wordt beschreven met routinematig gekweekte embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen als voorbeeld.
- Kweek MEF-cellen in celkweekschalen van 10 cm met 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 en controleer de cellen onder een microscoop bij 100x vergroting.
- Voer routinematige celpassaging uit.
- Wanneer de cellen 80% -90% confluency bereiken (elke 3 dagen), wast u de cellen met 2 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Voeg vervolgens 2 ml 0,05% trypsine-EDTA toe gedurende 1 minuut om de cellen te dissociëren, gevolgd door 2 ml DMEM om de werking van trypsine-EDTA te stoppen. Centrifugeer de celsuspensie bij 100 x g gedurende 3 minuten en resuspenseer de celpellet in 1 ml DMEM.
- Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller en celtelkamerdia's (zie Tabel met materialen) en ent vervolgens 1,5 x 106 cellen in een nieuwe celkweekschaal van 10 cm met 10 ml DMEM.
- Bereid voor de mitofagietest een celsuspensie voor zoals in stap 1.2.1. Verdun de celsuspensie tot 1 x 105 cellen/ml in verse DMEM.
- Voeg 2 ml van de verdunde celsuspensie toe aan een confocale schaal van 20 mm (zie Materiaaltabel) en schud de kweekschaal in een "kruis". Incubeer de celkweekschaal in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 24 uur.
2. Mitochondriale kleuring
- Verwijder de aliquots van de groen-fluorescerende mitochondriale kleurstof en rood-fluorescerende lysosoomkleurstof (zie materiaaltabel) uit de vriezer -20 °C.
- Bereid werkoplossingen van de kleurstoffen voor door de voorraadoplossingen 1:1.000 in DMEM te verdunnen en meng goed. Voeg bijvoorbeeld 2 μL elk van 1 mM mitochondriale kleurstof en lysosoomkleurstof toe aan 2 ml DMEM om een werkconcentratie van 1 μM voor beide kleurstoffen te verkrijgen.
- Verwijder het medium uit de confocale kweekschaal (stap 1.4). Voeg 1 ml van de kleuringsoplossing (bereid in stap 2.2) toe om de cellen te bedekken. Plaats de celkweekschaal in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20-30 min.
3. Confocale beeldvorming
- Bereid 1 L Krebs-Henseleit (KH) buffer (138,2 mM NaCl, 3,7 mM KCl, 0,25 mM CaCl2, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4,7H 2O, 15 mM glucose en 21,85 mM HEPES; uiteindelijke pH 7,4) en bewaar bij 4 °C (tot 1 maand).
- Verwijder op de dag van de confocale beeldvorming de KH-buffer van tevoren uit de koelkast en verwarm deze voor tot kamertemperatuur (20 tot 25 °C).
- Stel de parameters van de confocale microscopiebeeldvormingssoftware in (zie Materiaaltabel): Gebruik voor dubbele excitatiebeelden sequentiële excitatie bij 488 nm en 543 nm en verzamel emissie bij respectievelijk 505-545 nm en >560 nm.
OPMERKING: Stel de beeldinstellingen als volgt in. Scanmodus: frame; Snelheid: 9; Gemiddelde: aantal, 1; Winst: 450 tot 600; Pinhole: 30 tot 200; laser: <10%. Het is het beste om eerst de beeldbewerkingssoftware te starten en vervolgens de 488 nm-laser volledig in te schakelen. De 543 nm laser moet voor gebruik 3-5 min worden ingeschakeld en gestabiliseerd (figuur 1A). - Verwijder het kweekmedium met de kleurstof uit de incubator (stap 2.3) en voeg 1 ml KH-buffer toe aan het gerecht.
- Om mitofagie te induceren, behandelt u de cellen met carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) bij 1 μM (eindconcentratie) in KH-buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gaat u onmiddellijk verder met het in beeld brengen van de cellen met behulp van de confocale microscoop.
- Breng een geschikte hoeveelheid olie aan op de bovenkant van de 63x olielens (zie Materiaaltabel). Plaats het celmonster op het monsterstadium van de confocale microscoop en beweeg het direct boven de objectieflens.
- Gebruik de beeldbewerkingssoftware om het voorbeeld te vinden door op het tabblad Zoeken in de linkerbovenhoek van de software-interface te klikken (figuur 1B). Selecteer een groene filterset voor het experiment.
- Gebruik de grove instelknop om snel scherp te stellen door de objectieflens op en neer te bewegen. Nadat het celmonster duidelijk zichtbaar is door het oculair, zoekt en focust u het gebied van afzonderlijke cellen en verplaatst u het naar het midden van het gezichtsveld.
- Klik op het tabblad Acquisitie in de linkerbovenhoek in de software-interface om afbeeldingen te verkrijgen. Selecteer alleen het kanaal van 488 nm en de frameresolutie 1024 x 1024 voor een voorbeeld.
- Klik op het tabblad Live in de linkerbovenhoek om een live scan te starten. Pas het gezichtsveld aan op het scherpst en pas het laservermogen aan door de schuifregelaar naar links of rechts te bewegen (figuur 1A). Houd de versterkingsinstelling onder de 600 om overbelichting te voorkomen.
- Stel de pinhole-waarde in op 156, de winstwaarde op 545 en de digitale offsetwaarde op 0.
- Selecteer het beste gezichtsveld, controleer de twee kanalen (488 nm en 543 nm) en kies de frameresolutie 1024 x 1024. Klik op Magnetisch om 2D-afbeeldingen te verkrijgen. Sla de verkregen afbeeldingen op.
OPMERKING: De groene mitochondriënkleurstof heeft een excitatiepiek bij 490 nm en een emissiepiek bij 516 nm; het kan worden opgewonden met behulp van een 488 nm laser. De rode lysosoomkleurstof heeft een excitatiepiek bij 576 nm en een emissiepiek bij 590 nm; het kan worden opgewonden met behulp van een 543 nm laser.
4. Beeldanalyse
- Open de opgeslagen afbeelding met ImageJ en importeer de samengevoegde afbeelding erin.
- Tel handmatig het aantal gele stippen in elke cel, die aangeven dat het lysosoom mitochondriën overspoelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MitoTracker Green is een groen-fluorescerende mitochondriale vlek die in staat is om nauwkeurig te lokaliseren naar mitochondriën. De kleurstof kan gemakkelijk levende cellen kleuren en is minder effectief in het kleuren van aldehyde-gefixeerde of dode cellen (figuur 2). De rood-fluorescerende lysosoomkleurstof LysoTracker Red is in staat om zure lysosomale organellen te labelen en te volgen en kan alleen levende cellen kleuren (figuur 2). Confocale microscoop beeldvorming maakt de visualisatie van mitochondriën en lysosomen gekleurd met de juiste kleurstoffen mogelijk (figuur 1 en figuur 2).
Mitofagie is een katabolisch cellulair proces dat selectief mitochondriën afbreekt door autofagie, die meestal optreedt in beschadigde mitochondriën na letsel, veroudering of stress20. Vervolgens worden deze mitochondriën aan lysosomen geleverd voor afbraak. Mitofagie helpt de kwantiteit en kwaliteit van mitochondriën in een gezonde staat te houden in een breed scala van celtypen. In gezonde zoogdiercellen komt mitofagie niet vaak voor en daarom zijn andere stimuli nodig om dit proces te induceren25. Carbonylcyanide-4 (trifluoromethoxy) fenylhydrazon (FCCP), een mitochondriale ontkoppelaar, is een niet-specifieke ionofoor die binnen enkele minuten een ernstig verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal, verandering van intracellulaire pH en daaropvolgende mitofagieveroorzaakt 26,27. In deze studie werd FCCP gebruikt om mitofagie in MEF-cellen te activeren voor confocale beeldvorming. Wanneer beschadigde groengekleurde mitochondriën worden overspoeld door roodgekleurde lysosomen, overlappen de groene en rode fluorescentie elkaar om gele co-gelokaliseerde mitochondria-lysosomen te onthullen (figuur 3). De gele stippen in figuur 3D en figuur 4B komen overeen met deze co-gelokaliseerde mitochondriale lysosomen, die voortdurende mitofagie vertegenwoordigen, en kunnen dus worden geteld om de omvang van mitofagie te evalueren (figuur 4).
Figuur 1: Beeldparameters van de confocale microscopie beeldvormingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische illustratie van de confocale beeldvorming van levende cellen. De levende cellen worden samen gekleurd met de groen-fluorescerende mitochondriale kleurstof en rood-fluorescerende lysosomale kleurstof, en vervolgens worden de levende cellen in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie. Beeldverwerking en data-analyse werd uitgevoerd met behulp van de microscoop-geassocieerde beeldvormingssoftware of Image J. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Confocale beeldvorming van levende cellen. (A) Representatieve beelden van cellen gekleurd met de groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof tonen de mitochondriën. (B) Representatieve beelden van cellen gekleurd met de rood-fluorescerende lysosoomkleurstof die het lysosoom laat zien. (C) Samengevoegd beeld van beide fluorescerende kleurstoffen. (D) Uitgebreid gebied met mitofagie. De witte pijl geeft groene mitochondriën aan die worden overspoeld door rode lysosomen. Afkorting: Ex = excitatiegolflengte. De groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof wordt geëxciteerd bij 488 nm met emissie verzameld bij 505-545 nm. De rood-fluorescerende lysosoomkleurstof wordt geëxciteerd bij 543 nm met emissie verzameld bij >560 nm. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Mitofagie veroorzaakt door FCCP-stimulatie. (A) Representatieve beelden van cellen die samen met de groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en de rood-fluorescerende lysosoomkleurstof zijn gekleurd. (B) Representatieve beelden van cellen behandeld met 1 μM FCCP gedurende 10 min. De witte pijl geeft groene mitochondriën aan die worden overspoeld door rode lysosomen. (C) Kwantitatieve gegevens van mitofagie aangegeven door lysosomale mitochondriën overlay. Gegevens zijn gemiddeld ± SEM, n = 8 cellen. *p < 0,05 versus controle. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol biedt een methode voor het evalueren en monitoren van het dynamische proces van mitofagie in levende cellen, waarbij autofagosomen, lysosomen en mitochondriale splijting betrokken zijn, door co-kleuring met celpermeant mitochondriën en lysosoomkleurstoffen. De methode kan ook worden gebruikt om mitochondriën te identificeren en mitochondriale morfologie te beoordelen. Beide kleurstoffen die in dit onderzoek worden gebruikt, moeten worden beschermd tegen licht, meerdere vries-dooicycli moeten worden vermeden en de kleurstoffen moeten zoveel mogelijk worden opgeslagen in aliquots voor eenmalig gebruik. Het wordt aanbevolen om werkoplossingen van de kleurstoffen te bereiden om te voorkomen dat ze rechtstreeks aan het celkweekmedium worden toegevoegd, wat kan leiden tot hoge lokale concentraties en onvoldoende menging van de kleurstoffen. Om kleuring van andere cellulaire structuren te voorkomen, moeten de MEF-cellen gedurende 30 minuten worden gekleurd voordat ze worden afgebeeld met de confocale microscoop. Het wordt aanbevolen om de kleuringsprocedure onmiddellijk vóór de beeldvorming uit te voeren. In MEF-cellen zijn zowel mitochondriën als lysosoomkleurstoffen bij 1 μM goed gelokaliseerd in respectievelijk mitochondriën en lysosomen, met hogere kleurstofconcentraties die resulteren in cytotoxiciteit en niet-specifieke kleuring van andere cellulaire structuren. Deze concentratie is ook optimaal voor het kleuren van mitochondriën en lysosomen in H9C2-cellen. Voor andere cellijnen moeten de kleurstofconcentratie en kleuringstijd waarmee de kleurstof goed kan worden gelokaliseerd in de organellen worden geoptimaliseerd. Om duidelijke beelden van mitochondriën en lysosomen te verkrijgen, moeten de parameters voor het verzamelen van afbeeldingen (zie de opmerking in stap 3.3) consciëntieus worden aangepast. Celconfluentie bij 50% -60% is cruciaal om individuele levende celbeelden te verkrijgen, en daarom moeten cellen worden geteld voordat ze worden gezaaid. Als het lab geen confocale gerechten heeft, kunnen cirkelvormige coverslips als alternatief worden gebruikt. In sommige dierstudies, vooral in klinische onderzoeken, is het moeilijk om mitofagie te detecteren in dierlijke levende weefselmonsters vanwege het gebrek aan betrouwbare en handige kwantitatieve experimenten om mitofagie te bestuderen. Niettemin kan mitofagie in cellen geïsoleerd uit dierlijk weefsel worden beoordeeld met behulp van het hier beschreven protocol. Een beperking van deze methode is dat hoewel beide kleurstoffen gemakkelijk levende cellen kunnen kleuren, ze minder effectief zijn in het kleuren van dode of aldehyde-gefixeerde cellen.
Naast de kleurstoffen die in deze studie worden gebruikt, zijn andere mitochondriën en lysosoomtracers, zoals respectievelijk MitoMM1 / 2 en LysoKK, momenteel beschikbaar voor onderzoekers voor het evalueren van mitofagie 28,29. Hoewel MitoMM1/2 mitochondriën kan kleuren in paraformaldehyde-vaste cellen of weefsels, kan het mitofagie niet direct beoordelen en vereist het dubbele kleuring met een specifiek antilichaam, zoals anti-LC3B, om mitofagie te detecteren. Aangezien LysoKK alleen levende cellen kan kleuren, kan de combinatie van deze kleurstoffen ook alleen mitochondriale autofagie detecteren in levende cellen28,29. Niettemin is MitoMM1/2 gemakkelijk te gebruiken en maakt het gebruik van tritc-filter mogelijk (omdat het geen excitatie vertoont bij gebruik van een blauwe laser en geen groene emissie produceert). LysoKK kan organellen binnen 5 minuten kleuren, waardoor de snelle monitoring en beoordeling van talrijke stimuliwordt vergemakkelijkt 28,29.
Mitofagie treedt op in cellen via een complex mechanisme, dat wordt geïnduceerd door verschillende cellulaire stresssignalen en ontwikkelingsveranderingen. FCCP, een krachtige ontkoppelaar van mitochondriale oxidatieve fosforylering, is een niet-specifieke ionofoor26 die in deze studie werd gebruikt om mitofagie te induceren. FCCP (1 μM) interfereert met de protongradiënt door protonen over het binnenste mitochondriale membraan te transporteren, een proces dat een verandering in intracellulaire pH veroorzaakt. FCCP kan dus binnen enkele minuten een ernstig verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal veroorzaken en vervolgens mitochondriale autofagie induceren door Parkin en microtubule-geassocieerde eiwitlichtketen 3 (LC3) naar de mitochondriën 26,27,30 te rekruteren. Mitofagie regulerende routes worden geclassificeerd als ubiquitine-afhankelijk (PINK1-parkine-gemedieerd) of receptor-afhankelijk (gemedieerd door LC3 en andere receptoren)15,16. Mitofagie is bestudeerd met behulp van specifieke antilichamen die binden aan belangrijke moleculen in de receptorafhankelijke autofagische route, zoals LC3B, gevolgd door co-kleuring met rode fluorescerende lysosoomkleurstof31,32. Hoewel het moeilijk is om onderscheid te maken tussen deze twee paden met behulp van de kleurstoffen die in dit protocol worden gebruikt, bieden ze een eenvoudige methode om de mate van mitofagie in levende cellen te evalueren en mitochondriale morfologie te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), de National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044) en het Program for Professor of Special Appointment aan Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automated cell counter | Countstar | IC1000 | |
| Cell counting chamber slides | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Glass bottom cell culture dish (confocal dish) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs–Henseleit(KHB) buffer | Self-prepared | ||
| LysoTracker Red | Invitrogen | 1818430 | 100 µmol/L, red-fluorescent lysosome dye |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µmol/L stock, green-fluorescent mitochondria dye |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Self-prepared | ||
| Objective (63x oil lens) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (confocal microscope imaging software) | ZEISS | ZEN 2.1 |
References
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W.
- Kiriyama, Y., Nochi, H. Intra- and intercellular quality control mechanisms of mitochondria. Cells. 7 (1), (2017).
- Rossmann, M. P., Dubois, S. M., Agarwal, S., Zon, L. I. Mitochondrial function in development and disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (6), 048912 (2021).
- Suliman, H. B., Piantadosi, C. A. Mitochondrial quality control as a therapeutic target. Pharmacological Reviews. 68 (1), 20-48 (2016).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
- Zhao, R. Z., Jiang, S., Zhang, L., Yu, Z. B. Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). International Journal of Molecular Medicine. 44 (1), 3-15 (2019).
- Murphy, M. P., Hartley, R. C. Mitochondria as a therapeutic target for common pathologies. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (12), 865-886 (2018).
- Fan, H., et al. Mitochondrial quality control in cardiomyocytes: a critical role in the progression of cardiovascular diseases. Frontiers in Physiology. 11, 252 (2020).
- Ma, K., et al. Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467 (2020).
- Kraus, F., Roy, K., Pucadyil, T. J., Ryan, M. T. Function and regulation of the divisome for mitochondrial fission. Nature. 590 (7844), 57-66 (2021).
- Ren, L., et al. Mitochondrial dynamics: fission and fusion in fate determination of mesenchymal stem cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 580070 (2020).
- Onishi, M., Yamano, K., Sato, M., Matsuda, N., Okamoto, K. Molecular mechanisms and physiological functions of mitophagy. The EMBO Journal. 40 (3), 104705 (2021).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Mechanisms of mitophagy in cellular homeostasis, physiology and pathology. Nature Cell Biology. 20 (9), 1013-1022 (2018).
- Khaminets, A., Behl, C., Dikic, I. Ubiquitin-dependent and independent signals in selective autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (1), 6-16 (2016).
- Fritsch, L. E., Moore, M. E., Sarraf, S. A., Pickrell, A. M. Ubiquitin and receptor-dependent mitophagy pathways and their implication in neurodegeneration. Journal of Molecular Biology. 432 (8), 2510-2524 (2020).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).
- Lazarou, M., Jin, S. M., Kane, L. A., Youle, R. J. Role of PINK1 binding to the TOM complex and alternate intracellular membranes in recruitment and activation of the E3 ligase Parkin. Developmental Cell. 22 (2), 320-333 (2012).
- Chen, M., et al. Mitophagy receptor FUNDC1 regulates mitochondrial dynamics and mitophagy. Autophagy. 12 (4), 689-702 (2016).
- Ding, W. X., Yin, X. M. Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis. Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).
- Parzych, K. R., Klionsky, D. J. An overview of autophagy: morphology, mechanism, and regulation. Antioxidants and Redox Signaling. 20 (3), 460-473 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Autophagosome-lysosome fusion in neurons requires INPP5E, a protein associated with Joubert syndrome. The EMBO Journal. 35 (17), 1853-1867 (2016).
- Presley, A. D., Fuller, K. M., Arriaga, E. A. MitoTracker Green labeling of mitochondrial proteins and their subsequent analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B. Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 793 (1), 141-150 (2003).
- Chazotte, B. Labeling lysosomes in live cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Pickles, S., Vigie, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Takemori, H., et al. Visualization of mitophagy using LysoKK, a 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole-(arylpropyl)benzylamine derivative. Mitochondrion. 62, 176-180 (2022).
- Maeda, M., et al. The new live imagers MitoMM1/2 for mitochondrial visualization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 562, 50-54 (2021).
- Feng, X. R., Yin, W., Wang, J. L., Feng, L., Kang, Y. J. Mitophagy promotes the stemness of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Experimental Biology and Medicine. 246 (1), 97-105 (2021).
- Chu, C. T., et al. Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells. Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).
- Sentelle, R. D., et al. Ceramide targets autophagosomes to mitochondria and induces lethal mitophagy. Nature Chemical Biology. 8 (10), 831-838 (2012).
