Summary
במחקר הנוכחי, דקסטרן פלואורסצאין-איזותיוציאנט-מסומן (FITC) מנוהל לעכברים דרך הפה כדי להעריך את חדירות המעי הן in vivo והן בדגימות פלזמה וצואה. מכיוון שתפקוד מחסום המעי מושפע בתהליכי מחלה רבים, ניתן להשתמש בבדיקה ישירה וכמותית זו בתחומי מחקר מגוונים.
Abstract
שלמות מחסום המעי היא סימן ההיכר של בריאות המעי. בעוד שניתן להעריך את שלמות מחסום המעי באמצעות סמנים עקיפים כגון מדידת סמנים דלקתיים בפלזמה וטרנסלוקציה חיידקית לטחול ולבלוטות הלימפה, תקן הזהב מכמת ישירות את יכולתן של מולקולות נבחרות לחצות את שכבת רירית המעי לכיוון מחזור הדם המערכתי. מאמר זה משתמש בטכניקה לא פולשנית, חסכונית ובעלת נטל נמוך כדי לכמת ולעקוב בזמן אמת אחר חדירות המעי בעכברים באמצעות דקסטרן פלואורסצאין-איזותיוציאנט (FITC-dextran). לפני נטילת תוסף פומי עם FITC-דקסטרן, העכברים עוברים צום. לאחר מכן הם מדוללים במי מלח חוצצי פוספט (PBS). שעה לאחר ההרדמה, העכברים נתונים להרדמה כללית באמצעות איזופלורן, ואת הפלואורסצנטיות in vivo הוא דמיינו בתא הדמיה. טכניקה זו נועדה להעריך פלואורסצנטיות שיורית בחלל הבטן ואת ספיגת הכבד, אשר מרמז על נדידה פורטל של הבדיקה פלואורסצנטית. דגימות דם וצואה נאספות 4 שעות לאחר פליטת פה, והעכברים מוקרבים. דגימות פלזמה וצואה מדוללות ב- PBS מצופות לאחר מכן, והפלואורסצנטיות נרשמת. הריכוז של FITC-dextran מחושב לאחר מכן באמצעות עקומה סטנדרטית. במחקרים קודמים, הדמיית in vivo הראתה כי פלואורסצנטיות מתפשטת במהירות לכבד בעכברים עם מחסום מעיים חלש יותר המושרה על ידי תזונה דלת סיבים, ואילו בעכברים בתוספת סיבים כדי לחזק את מחסום המעי, האות הפלואורסצנטי נשמר בעיקר במערכת העיכול. נוסף על כך, במחקר זה, עכברי ביקורת העלו את הפלואורסצנטיות בפלזמה והפחיתו את הפלואורסצנטיות בצואה, בעוד שלעכברים שקיבלו תוספת אינולין היו רמות גבוהות יותר של אותות פלואורסצנטיים במעיים ורמות נמוכות בפלזמה. לסיכום, פרוטוקול זה מספק מדידות איכותיות וכמותיות של חדירות המעי כסמן לבריאות המעי.
Introduction
מחסום המעי ממלא תפקיד חשוב הן בבריאות והן במחלות. זה דורש איזון מורכב בין מתן אפשרות החומרים המזינים הדרושים לחלחל לתוך מחזור הדם מן לומן המעי ובו זמנית למנוע חדירה של מולקולות פרו דלקתיות, כגון פתוגנים או אנטיגנים1. חדירות מוגברת יכולה להיגרם על ידי הפרעות רבות במערכת העיכול, כגון מחלת כבד או מחלות מעי דלקתיות (IBDs)2,3. לדוגמה, בקוליטיס כיבית (UC), מחלת מעי דלקתית, דלקת כרונית מובילה להתמוטטות של צמתים הדוקים, לשיבוש הבא של מחסום המעי, ולטרנסלוקציה של חיידקים, מה שעלול להנציח דלקת רירית וסיסטמית4.
לכן, שלמות מחסום המעי היא סמן חשוב לבריאות המעי. עם זאת, שיטות הנוכחיות למדידת חדירות המעי יש מגבלות רבות. לדוגמה, שיטות למדידת סמנים דלקתיים בפלזמה או טרנסלוקציה חיידקית לטחול ולבלוטות הלימפה הן עקיפות 5,6. שיטות אחרות יכולות להיות פולשניות וגוזלות זמן. מאמר זה מתאר בדיקה לא פולשנית וחסכונית המודדת באופן ישיר וכמותי את חדירות המעי. בדיקה זו משתמשת ב- dextran עם תווית פלואורסצאין-איזותיוציאנט (FITC-dextran) כדי לעקוב אחר חדירות המעי בזמן אמת על ידי מדידת פלואורסצנטיות in vivo. נוסף על כך, מדידת רמות FITC-דקסטרן בפלזמה ובצואה מכמתת את חדירות המעי (איור 1).
בדיקת החדירות FITC-dextran שימשה בעבר בהקשרים רבים ושונים, כולל במודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון7, אלח דם8, שבץ איסכמי9 ופציעת כוויות10. נוסף על כך, לאחרונה נעשה שימוש בבדיקה זו כדי לסייע בהבנת האופן שבו מיקרוביום המעי עשוי להיות מעורב בתהליכי מחלה שונים, וכיצד ניתן למקד אותו או להשפיע עליו כטיפול פוטנציאלי. לדוגמה, הוא שימש לחקר מיקרוביום וטיפולים מבוססי מיקרוביום בהזדקנות 11, IBDs12, סרטן המעי הגס13, והפרעת הספקטרום האוטיסטי11. מאחר שתפקוד מחסום המעי מעורב בהיבטים רבים של בריאות ומחלות, נעשה שימוש נרחב בבדיקה זו. הפשטות היחסית שלו ועומס הזמן הנמוך הופכים אותו לאידיאלי לבדיקת תנאי in vivo החשודים כמשנים את שלמות מחסום המעי. התוצאות הכמותיות שלה שימושיות לקביעת היעילות של טיפול פוטנציאלי.
במחקר זה, ההשפעה של תזונה על תפקוד מחסום המעי הוערכה באמצעות בדיקת FITC-dextran. הושוו חדירות המעי של עכברים שקיבלו דיאטת ביקורת וחדירות המעי של עכברים שקיבלו תזונה עם תוספת אינולין. אינולין הוא אוליגוסכריד מועיל שהוכח כמשפר את תפקוד מחסום המעי12,13. עבור מדידות פלואורסצנטיות in vivo (רקע), עכבר אחד נוסף שלא טופל שימש כביקורת שלילית וקיבל PBS במקום FITC-dextran. ניסוי זה מדגים כי בדיקת FITC-dextran היא כלי רב ערך להערכת חדירות מעיים.
Protocol
כל ההליכים בוצעו בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לאחר אישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של CRCHUM. נקבות עכברי BALB/c בנות שמונה שבועות, שהתקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים), שימשו במחקר הנוכחי. בעלי החיים קיבלו תוסף תזונה עם 10% אינולין wt/wt במשך שבועיים. קבוצת ביקורת קיבלה תזונה דומה ללא תוסף אינולין. לעכברים הייתה גישה אד-ליביטום . סקירה כללית של הבדיקה מוצגת באיור 1.
איור 1: סכמטי של בדיקת FITC-dextern. T − 4 - 4 שעות לפני gavage, גישה למזון הוסרה. T0- FITC-dextran ניתן באמצעות gavage אוראלי. T1 - 1 h לאחר gavage, הפלואורסצנטיות in vivo הוערכה. T4- 4 שעות לאחר הפרסום, נאספו דגימות הצואה והפלזמה, ונמדדה הפלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
1. ניהול FITC-dextran
- לפני מתן FITC-dextran, צמו את העכברים במשך 4 שעות תוך שמירה על גישה למים.
הערה: רצוי להתחיל את הצום בתחילת מחזור האור (בבוקר). ניתן להעביר את העכברים לכלוב חדש ללא מצעים במהלך הצום כדי להגביל את הקופרופגיה. - הכן 200 μL של 80 מ"ג·מ"ל−1 4 kDa FITC-dextran (ראה טבלת חומרים) מדולל במי מלח סטריליים 1x פוספט חוצץ (PBS) (לכל עכבר). הכינו את הדגימות מיד לפני מתן התרופה, ושמרו עליהן מוגנות מפני אור.
- יש לתת 200 μL של מתלה FITC-dextran באמצעות gavage אוראלי לכל עכבר באמצעות מחט gavage מעוקלת 38 מ"מ 22 G מעוקלת עם קצה בצורת כדור או אגס (ראה טבלת חומרים). הפעל טיימר לאחר ה- gavage הראשון, והמתן 5-10 דקות לפני שתפעיל את העכבר הבא כדי לאפשר מדידות in vivo (שלב 2), תוך שמירה תמיד על שעה אחת לאחר ה- gavage. שמור על מתלי FITC-dextran הנותרים עבור העקומה הסטנדרטית.
הערה: מיד לאחר ההדבקה, מזון עשוי להיות מוחלף כדי להבטיח היווצרות של צואה.
2. מדידת פלואורסצנטיות In vivo
- מרדימים את העכברים שעה לאחר ההרדמה באמצעות איזופלורן 2.5% או חומר הרדמה חלופי. ודא כי בעל החיים מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן או הזנב ולוודא כי בעל החיים אינו מגיב.
- יש להסיר את הפרווה מאזור הבטן באמצעות מכונת גילוח חשמלית, ולמרוח בנדיבות משחת סיכה אופתלמית על העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, הניחו את העכברים בנפרד בתא ההדמיה בשכיבה גבית.
הערה: יש לכלול עכבר בקרה אחד שמקבל PBS או מלוחים במקום FITC-dextran כדי לקחת בחשבון את הרקע במהלך הדמיה in vivo .
- יש להסיר את הפרווה מאזור הבטן באמצעות מכונת גילוח חשמלית, ולמרוח בנדיבות משחת סיכה אופתלמית על העיניים כדי למנוע התייבשות. לאחר מכן, הניחו את העכברים בנפרד בתא ההדמיה בשכיבה גבית.
- דמיינו את העכברים באמצעות תא הדמיה פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים). לרכוש תמונות של אזור הבטן, הגדרת אורך הלייזר ב 470 ננומטר ואת הרזולוציה ב 2.0 מ"מ.
- הפעל את המחשב והתוכנה על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן התחל . אפשרו למערכת להתחמם.
הערה: ייתכן שהמערכת תזדקק ל-20 דקות או יותר כדי להתחמם, ולכן יש להפעיל את המכשיר מוקדם כדי לא להפריע להדמיה של העכברים בשעה אחת לאחר ההתחממות. - לחץ על מצב התקן וודא שכל המכשירים המוגדרים מציגים "אישור" לפני שתמשיך.
- במידת הצורך, חממו את הלייזר המתאים על ידי לחיצה על בקרת לייזר ולאחר מכן לחיצה על כפתור שם הלייזר של הלייזר הרצוי.
- התחל מחקר חדש על ידי לחיצה על מחקר חדש. שמור תחת הקובץ המתאים בשם הרצוי.
- לחץ על אפשרויות מחקר, ואז הזן את מזהה הדגימה, ובחר את הלייזר והניסוי הנכון.
- פתח את תא ההדמיה והנח את בעל החיים באופן דורסלי על צלחת הסריקה. אבטחו את הגפיים והזנב בעזרת נייר דבק, וודאו שהאף והפה משתלבים היטב בצינור ההרדמה, תוך שמירה על איזופלורן של 2.5%.
- כוונן את גובה לוח הסריקה כך שאזור הסריקה יהיה מעט גחוני מקו האמצע של החיה. כוונן את הלוח על-ידי סיבוב ידית הכוונון בתוך תא ההדמיה. סגור ונעל את דלת תא ההדמיה.
- בחרו באזור לסריקה בעזרת הכלי ציור . כלול את כל רוחב הבטן ממש מעל הכבד ועד פי הטבעת. לחץ על הכלי שינוי כדי להתאים את האזור לאחר הציור.
- הגדר את רזולוציית הסריקה ל- 2.0 מ"מ ולאחר מכן לחץ על הבא. לאחר השלמת אוטומציית צריכת החשמל, ודא שההגדרות נכונות ובצע את כל ההתאמות הדרושות. לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה.
- לאחר השלמת הסריקה, הוציאו את בעל החיים מתא ההדמיה, והניחו אותו באינקובטור כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן ההתאוששות מההרדמה.
- לחץ על המשך המחקר כדי לשמור על ההגדרות ולאחר מכן חזור על שלבים 2.2.5-2.2.10 עד שכל העכברים ייסרקו.
- לחץ על לחצן ההפעלה והחזק אותו למשך 3 שניות כדי לכבות את תא ההדמיה.
- הפעל את המחשב והתוכנה על-ידי לחיצה ממושכת על לחצן התחל . אפשרו למערכת להתחמם.
- הערך את הפלואורסצנטיות על-ידי השוואת פלואורסצנטיות הבטן של כל בעל חיים ועכבר הבקרה בתמונות בקנה מידה אחיד באמצעות תוכנה המשויכת למערכת ההדמיה שבה נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים).
- פתח את קבצי התמונה על ידי מציאתם תחת שם הקובץ שנבחר. פתח את כל הקבצים בעלי הגדרות מסונכרנות בו-זמנית.
- באמצעות סרגל הכלים של הגדרות התמונה, השתמש בלחצנים סנכרן תמונה וסנכרן קנה מידה כדי לסנכרן את ההגדרות עבור התמונות, ולאפשר השוואה מדויקת.
- שמרו את התמונות עם קנה המידה המותאם שלהן.
3. מדידת פלואורסצנטיות בדגימות צואה ובפלזמה
- לאסוף כדור צואה מכל עכבר בצינור סטרילי 4 שעות לאחר gavage. שמור את הצינורות בחושך על קרח.
- הרדימו את העכברים באמצעות הזרקה תוך-צפקית של 240 מ"ג/מ"ל נתרן פנטוברביטל (דילול, 1:100; ראו טבלת חומרים). יש לתת במינון של 0.03 מ"ל/גרם משקל גוף.
- יש לאסוף דגימות דם של לפחות 700 μL בצינור המיועד לאיסוף פלזמה המכיל הפרין או EDTA למניעת קרישיות (ראה טבלת חומרים) על ידי החדרת צינור נימי זכוכית למקלעת רטרו-אורביטלית14.
הערה: שיטות חלופיות לאיסוף דם כוללות ניקוב לב או נסיגה מווריד הזנב. מכיוון שמדובר בהליך סופני, יש להרדים את העכברים באמצעות פריקת צוואר הרחם או שיטה הומנית חלופית. עקוב אחר המלצות ועדת האתיקה המקומית של בעלי חיים להמתת חסד.
- יש לאסוף דגימות דם של לפחות 700 μL בצינור המיועד לאיסוף פלזמה המכיל הפרין או EDTA למניעת קרישיות (ראה טבלת חומרים) על ידי החדרת צינור נימי זכוכית למקלעת רטרו-אורביטלית14.
- צנטריפוגה את דגימות הדם ב 9,390 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. העבירו את הפלזמה לצינור סטרילי חדש, ושמרו אותה בחושך על קרח.
- לדלל 50 מ"ג של דגימות צואה ב 200 μL של 1x PBS ולדלל את הפלזמה 1: 2 עם 1x PBS. ניתן לשנות את יחס הדילול בהתבסס על עוצמת האות הפלואורסצנטי.
- צור עקומה סטנדרטית באמצעות דילולים סדרתיים של FITC-dextran ב- 1x PBS. החל מהריכוז הגבוה ביותר של 20 מ"ג·מ"ל−1 FITC דקסטרן, יש לדלל פי 1:1 באופן סדרתי 7-10 פעמים.
הערה: הריכוזים, אם כן, חייבים לקרוא 20 מ"ג·מ"ל−1, 10 מ"ג·מ"ל−1, 5 מ"ג·מ"ל−1, 2.5 מ"ג·מ"ל−1, 1.25 מ"ג·מ"ל−1, 0.625 מ"ג·מ"ל−1, 0.3125 מ"ג·מ"ל−1 וכו'. - צלחת 100 μL דוגמאות ותקנים בצלחת שחורה אטומה 96 בארות. כלול PBS ריק. קרא את הפלואורסצנטיות בקורא לוחות פלואורסצנטיים (ראה טבלת חומרים) עם ספיגה ב 530 ננומטר ועירור ב 485 ננומטר.
הערה: ניתן לצפות את הדגימות והתקנים בצורה כפולה או משולשת, ולאחר מכן ערכי הפלואורסצנטיות שלהם ממוצעים. - קבע את הריכוז של FITC-דקסטרן לדגימה על ידי השוואת הפלואורסצנטיות לריכוזים הידועים של העקומה הסטנדרטית. בדגימות, מכפילים את הריכוז בגורם הדילול (שלב 3.5).
Representative Results
ניתוח הפלואורסצנטיות in vivo הראה שלעכברים שקיבלו רק את דיאטת הביקורת הייתה צריכה גבוהה יותר בכבד של FITC-דקסטרן ורמות גבוהות יותר של פלואורסצנטיות שיורית בחלל הבטן בהשוואה לעכברים שקיבלו את התזונה עם תוספת אינולין (איור 2A). פלואורסצנטיות מסוימת נראתה בקקום של העכברים שקיבלו את דיאטת האינולין, אך הייתה צריכת כבד מועטה, אם בכלל, מה שמצביע על כך שדיאטות אלה הגנו מפני חדירות מעיים מוגברת.
רמות הפלואורסצנטיות בדגימות פלזמה וצואה פועלות כדי לחזק ולכמת את מקבילותיהן in vivo . לעכברים שקיבלו תזונה עם תוספת אינולין היו רמות נמוכות משמעותית של FITC-דקסטרן בפלזמה שלהם בהשוואה לעכברים שקיבלו רק את דיאטת הביקורת (איור 2B). זה מצביע על כך שהם שיפרו את תפקוד מחסום המעי כי פחות FITC-דקסטרן יכול לחדור את מחסום המעי לתוך מחזור הדם. בהתאמה, לעכברים שקיבלו את דיאטת האינולין היו רמות גבוהות יותר באופן משמעותי של FITC-דקסטרן בצואה שלהם מאשר לעכברים שקיבלו רק את דיאטת הביקורת (איור 2C). זה מחזק את העובדה שהיה להם תפקוד תקין של מחסום המעי, שכן ה-FITC-דקסטרן נשאר במעי הגס עד להפרשה, כפי שנחשב נורמלי. הרמות הנמוכות יותר של FITC-דקסטרן בצואה של עכברי הביקורת מצביעות על כך שהוא חלחל דרך מחסום המעי למחזור הדם ולא הופרש כראוי. הרמות הגבוהות של FITC-דקסטרן בפלזמה מחזקות ממצא זה.
איור 2: תוספי תזונה עם אינולין מפחיתים את הטרנסלוקציה של FITC-דקסטרן דרך מחסום המעי . (A) שאריות הפלואורסצנטיות והספיגה בכבד של FITC-דקסטרן. אדום = העוצמה הגבוהה ביותר; סגול כהה = העוצמה הנמוכה ביותר. פלואורסצנטיות מקסימלית של 2.15 x 103, פלואורסצנטיות מינימלית של 0.378. (B) הריכוז הפלזמטי של FITC-דקסטרן. P = 0.010. (C) ריכוז הצואה של FITC-דקסטרן. P = 0.00003. N = 4 לכל קבוצה. הנתונים מיוצגים כממוצע ±- SEM. כל נקודה מייצגת עכבר אחד. מבחן t של סטודנט לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
תפקוד מחסום המעי הוא חלק בלתי נפרד מתהליכי מחלה רבים ושונים. לפיכך, הערכת חדירות המעי באופן לא פולשני, חסכוני וניתן לכימות חיונית לייצוג מדויק של מחלות אלה במודלים של בעלי חיים. בדיקת FITC-dextran מספקת את האפשרות לייצוג זה. עם זאת, פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים שיש להשלים במדויק כדי להשיג תוצאות אמינות. ראשית, הבטחת השימוש ב- FITC-dextran בגודל מתאים היא חיונית. לבחינת חדירות in vivo , 4 kDa FITC-dextran הוא המשקל המולקולרי האופטימלי, וככל שהמשקל המולקולרי עולה, החדירות פוחתת15. לכן, שימוש ב- FITC-dextran בעל משקל מולקולרי שונה עלול לספק תוצאות מבלבלות או לא אמינות. בנוסף, חשוב לציין את הזמן של כל gavage ולהתאים את נקודות הזמן לאיסוף נתוני in vivo ואיסוף פלזמה וצואה בהתאם. לדוגמה, אם שני עכברים נמצאים במרחק של 10 דקות זה מזה, קריאות הפלואורסצנטיות in vivo ואיסוף הצואה והפלזמה חייבים להתרחש גם הם במרחק של 10 דקות זה מזה. השוואת הפלואורסצנטיות באותן נקודות זמן מאפשרת ייצוג מדויק יותר של ההבדלים בחדירות. יתר על כן, יש לשנות לסירוגין את סדר הבדיקות של בעלי החיים מקבוצות שונות כדי למנוע אפקט התקבצות עקב העיתוי. במקום לבדוק תחילה את כל בעלי החיים בקבוצה A, ולאחר מכן את כל בעלי החיים בקבוצה B שנייה (AAABBB), מומלץ להחליף את הקבוצה לאחר כל חיה (ABABAB).
ניתן לשנות בדיקה זו כך שתכלול רק הערכה של דגימות פלזמה וצואה אם יש חוסר גישה למכונת הדמיה. למרות שהדמיית פלואורסצנטיות ישירה in vivo מאפשרת הדמיה של צריכת הכבד ופלואורסצנטיות שיורית בטן, הערכת פלואורסצנטיות בדגימות הפלזמה והצואה עדיין מספקת מדידה כמותית של חדירות המעי. יתר על כן, כפי שהודגם בניסוי המתואר, רמות הפלואורסצנטיות בפלזמה ובצואה תואמות היטב עם הדמיה in vivo . בנוסף, ניתן לשנות בדיקה זו כך שתכלול רק את ההדמיה in vivo . זה מאפשר לחיות להישאר בחיים כדי להמשיך לבדוק פרמטרים אחרים או לפקח על איך חדירות המעי משתנה לאורך זמן. היכולת לשנות בדיקה זו, אם כן, הופכת אותה לנגישה, אך עדיין כמותית. לבסוף, המינון של 200 μL של 80 mg·mL−1 FITC-dextran שניתן לכל עכבר שימש בעבר והוכח כיעיל בעכברים עם הבדלים קטנים במשקל הגוף16. יתר על כן, חשוב לציין כי כל העכברים ששימשו בסעיף התוצאות המייצגות שקלו כ -20 גרם, מה שמאפשר שימוש באותו מינון עבור כל עכבר. כדי להסביר את ההבדלים במשקל הגוף, עם זאת, FITC-dextran יכול להינתן במינון של 0.6-0.8 מ"ג / גרם משקל גוף, למשל17. באופן מכריע, ללא קשר למינון שבו משתמשים, חשוב להגביל את הכמות לכל עכבר לפחות מ-10 מ"ל ק"ג−1 כדי למנוע סיבוכים או אי נוחות18.
למרות שבדיקת FITC-dextran מספקת שיטה יעילה להערכת תפקוד מחסום המעי, עדיין יש לה כמה מגבלות. מגבלה אחת של מודל זה היא שהוא דורש צום של העכברים במשך מספר שעות, כלומר לא אמין להשוות את התוצאות הללו לאלה של עכברים שלא צמו. בנוסף, צום עשוי להשפיע על התוצאות במודלים מסוימים הדורשים לוחות זמנים קפדניים להאכלה, כגון בעת מדידת גלוקוז בדם במודלים של בעלי חיים לסוכרת.
למרות מגבלות אלה, בדיקת FITC-dextran נותרה שיטה יעילה לניתוח חדירות המעי מכיוון שהיא כמותית, רב-תכליתית, חסכונית ופחות פולשנית משיטות קלאסיות רבות. לדוגמה, בדיקות נפוצות המשמשות למדידת חדירות המעי הן בדיקות סכריד קטנות או Cr-EDTA, שיש להן כמה יתרונות19. עם זאת, לחלק מבדיקות הסכריד יש רק חדירות ספציפית לאזור. מכיוון שהם עוברים הידרוליזה בחלק הדיסטלי של המעי הדק, הם אינם מספקים תובנה לגבי חדירות המעי הגס19. מצד שני, Cr-EDTA יכול לספק מידע על חדירות המעי הגס אך דורש מדידות במשך 24 שעות, מה שהופך את נטל הזמן של שיטה זו להרבה יותר גבוה מזה של בדיקת FITC-dextran20. יתר על כן, אף אחת מהשיטות הללו אינה מספקת את ההדמיה הישירה in vivo של בדיקה זו. לכן, בדיקת FITC-dextran מספקת אפשרות פשוטה, ישירה ויעילה יחסית בהשוואה לשיטות חלופיות למדידת חדירות מעיים.
לבסוף, בתהליכי מחלה כגון IBDs4, מחלת אלצהיימר21 ומחלת כבד2, חדירות המעי היא פרמטר חשוב שניתן למדוד באמצעות בדיקת FITC-dextran כדי לשפר את המחקרים. לדוגמה, בפיתוח טיפולים חדשניים, כגון אימונותרפיה למחלות מעי דלקתיות, ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לבחון את יעילות הטיפול לשמירה על שלמות מחסום המעי. בהתחשב בכך שתפקוד לקוי של מחסום המעי עשוי להיות מעורב בהנצחת הדלקת הכרונית ב-UC, למשל, חשוב לבחון עד כמה טיפול מגן מפני חדירות מוגברת4. זוהי רק דוגמה אחת, אך בדיקת FITC-dextran היא דרך נגישה וניתנת לכימות למדידת חדירות מעיים בתחומים והיבטים רבים ושונים של מחקר.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם גילויים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק RGPIN-2018-06442 ל-MMS). אנו מודים למתקן בעלי החיים ב- CRCHUM ולד"ר ג'ונג'נג פנג מפלטפורמת הפנוטיפינג הקרדיווסקולרית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 ppm Fe Diet (10% Inulin) | Envigo Teklad | TD.190651 | Representative Results |
| 50 ppm Fe Diet (FeSO4) | Envigo Teklad | TD.190723 | Representative Results |
| BALB/c Mice 49-55 Days, Female | Charles River | 028BALB/C | Representative Results |
| BD 1 mL Syringe Tuberculin Slip Tip | Becton, Dickinson and Company | 309659 | For gavage |
| BD Microtainer Tubes - With LH (Lithium Heparin) | Becton, Dickinson and Company | 365965 | For plasma collection |
| Centrifuge 5420 | Eppendorf | S420KN605698 | |
| Curved Gavage Needle (Gavage Cannula) 7.7.0 38 mm x 22 G | Harvard Apparatus Canada | 34-024 | No longer available - A potential alternative is available at Instech Labs (FTP-22-38) |
| Euthanyl (Pentobarbital Sodium) 240 mg/mL | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 141704 | 1/100 dilution; Administered via intraperitoneal injection at 0.03 mL/g body weight |
| FITC-dextran 4 | TdB Labs | 20550 | |
| Heparinized Capillary Tubes | Kimble Chase Life Science and Research | 2501 | For retro-orbital blood collection |
| Microplate, PS, 96-well, Flat-bottom (Chimney Well), Black, Flutrac, Med. Binding | Greiner Bio-one | 655076 | |
| MiniARCO Clipper Kit | Kent Scientific | CL8787-KIT | For hair removal |
| Optix MX2 and Optix Optiview | Advanced Research Technologies | 2.02.00.6 | Fluorescence imaging machine and software |
| Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Wisent Inc | 311-010-LL | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | 12920060 | Ophthalmic ointement to prevent eye damage during anesthesia |
| Spark Multiplate Reader | Tecan | 30086376 |
References
- König, J., et al. Human intestinal barrier function in health and disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196 (2016).
- Lorenzo-Zuniga, V., et al. Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats. Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).
- Schwarz, B. T., et al. LIGHT signals directly to intestinal epithelia to cause barrier dysfunction via cytoskeletal and endocytic mechanisms. Gastroenterology. 132 (7), 2383-2394 (2007).
- Schmitz, H., et al. Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis. Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).
- Fouts, D. E., Torralba, M., Nelson, K. E., Brenner, D. A., Schnabl, B. Bacterial translocation and changes in the intestinal microbiome in mouse models of liver disease. Journal of Hepatology. 56 (6), 1283-1292 (2012).
- Galipeau, H. J., Verdu, E. F. The complex task of measuring intestinal permeability in basic and clinical science. Neurogastroenterology and Motility. 28 (7), 957-965 (2016).
- Bordoni, L., et al. Positive effect of an electrolyzed reduced water on gut permeability, fecal microbiota and liver in an animal model of Parkinson's disease. PLoS One. 14 (10), 0223238 (2019).
- Wang, Q., Fang, C. H., Hasselgren, P. -O. Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (3), 1013-1023 (2001).
- Crapser, J., et al. Ischemic stroke induces gut permeability and enhances bacterial translocation leading to sepsis in aged mice. Aging. 8 (5), 1049-1063 (2016).
- Mal Earley, Z., et al. Burn injury alters the intestinal microbiome and increases gut permeability and bacterial translocation. PLoS One. 10 (7), 0129996 (2015).
- Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
- Schroeder, B. O., et al. Bifidobacteria or fiber protects against diet-induced microbiota-mediated colonic mucus deterioration. Cell Host & Microbe. 23 (1), 27-40 (2018).
- Hajjar, R., et al. Improvement of colonic healing and surgical recovery with perioperative supplementation of inulin and galacto-oligosaccharides. Clinical Nutrition. 40 (6), 3842-3851 (2021).
- JoVE. Lab Animal Research. Blood Withdrawal I. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Costantini, T. W., et al. Quantitative assessment of intestinal injury using a novel in vivo, near-infrared imaging technique. Molecular Imaging. 9 (1), 30-39 (2010).
- Thevaranjan, N., et al. Age-associated microbial dysbiosis promotes intestinal permeability, systemic inflammation, and macrophage dysfunction. Cell Host & Microbe. 21 (4), 455-466 (2017).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104, 1-14 (2014).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Arrieta, M. C., Bistritz, L., Meddings, J. B.
- von Martels, J. Z. H., Bourgonje, A. R., Harmsen, H. J. M., Faber, K. N., Dijkstra, G. Assessing intestinal permeability in Crohn's disease patients using orally administered 52Cr-EDTA. PLoS One. 14 (2), 0211973 (2019).
- Gonzalez-Escamilla, G., Atienza, M., Garcia-Solis, D., Cantero, J. L. Cerebral and blood correlates of reduced functional connectivity in mild cognitive impairment. Brain Structure and Function. 221 (1), 631-645 (2016).
