Summary
Здесь мы описываем простой метод имплантации мышам коммерческого непрерывного монитора глюкозы, предназначенного для пациентов, и предоставляем сценарии для анализа результатов.
Abstract
Мыши являются распространенным модельным организмом, используемым для изучения метаболических заболеваний, таких как сахарный диабет. Уровни глюкозы обычно измеряются с помощью кровотечения из хвоста, которое требует обращения с мышами, вызывает стресс и не дает данных о свободно ведущих себя мышах во время темного цикла. Современное непрерывное измерение уровня глюкозы у мышей требует введения зонда в дугу аорты мыши, а также специализированной системы телеметрии. Этот сложный и дорогостоящий метод не был принят большинством лабораторий. Здесь мы представляем простой протокол, включающий использование коммерчески доступных непрерывных мониторов глюкозы, используемых миллионами пациентов для непрерывного измерения глюкозы у мышей в рамках фундаментальных исследований. Зонд, чувствительный к глюкозе, вводится в подкожное пространство в задней части мыши через небольшой разрез на коже и плотно удерживается на месте с помощью пары швов. Устройство пришивается к коже мыши, чтобы оно оставалось на месте. Устройство может измерять уровень глюкозы в течение 2 недель и отправляет данные на ближайший приемник без необходимости обращаться с мышами. Приведены сценарии для анализа основных данных зарегистрированных уровней глюкозы. Этот метод, от хирургии до вычислительного анализа, является экономически эффективным и потенциально очень полезным в метаболических исследованиях.
Introduction
Сахарный диабет (СД) – разрушительное заболевание, характеризующееся высоким уровнем глюкозы в крови. СД 1 типа может быть результатом аутоиммунной атаки на инсулин-продуцирующие бета-клетки поджелудочной железы. СД 2 типа и гестационный СД, с другой стороны, характеризуются неспособностью бета-клеток секретировать достаточное количество инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы1. Мышь является распространенным модельным организмом, используемым для изучения СД, поскольку она имеет схожую физиологию, а ее нормальный уровень глюкозы близок к человеческому. Кроме того, у конкретных линий мышей может развиться СД из-за мутаций в ключевых сигнальных путях или после воздействия определенных диет, что позволяет моделировать заболевание 2,3,4.
Уровень глюкозы в крови обычно измеряется у мышей с помощью глюкометров, предназначенных для пациентов, путем извлечения небольшой капли крови (1-2 мкл) из кончика хвоста мыши. Этот метод вызывает стресс и требует обращения с мышью, что влияет на уровень глюкозы и запрещает измерение уровня глюкозы в крови у свободно ведущих себя мышей или когда исследователь не находится рядом на5. Кровотечение у мышей может вызвать стресс у ближайших мышей, особенно у мышей в той же клетке, гликемия которых еще не измерена, что влияет на результаты. Мыши реагируют по-разному в зависимости от обработчика, и человек, измеряющий глюкозу, может влиять на уровень глюкозы у мышей. Эти подводные камни требуют тщательного планирования экспериментов и лежат в основе некоторых несоответствий между экспериментами.
Можно измерить уровень глюкозы у свободно движущихся мышей без кровотечения путем имплантации датчиков глюкозы в дугу аорты мышей с использованием современной телеметрии6. Полученные измерения очень хороши и могут поддерживаться в течение длительного периода, но имплантировать эти датчики сложно, а система телеметрии стоит дорого, что приводит к умеренному принятию этой методологии и отсутствию ее принятия в неспециализированных лабораториях. В последние годы были разработаны подкожные или другие датчики глюкозы, адаптированные к размерам мышей и их физиологии, но они снова требуют высококвалифицированных специалистов и в некоторых случаях являются дорогостоящими 6,7,8,9,10.
Коммерческие непрерывные мониторы глюкозы (CGM), которые первоначально были разработаны для мониторинга уровня глюкозы у пациентов с СД, предлагают еще один вариант измерения глюкозы у свободно движущихся мышей с более низкой стоимостью и техническими требованиями, чем имплантированные зонды. Такие зонды использовались в фундаментальных исследованиях несколькими лабораториями 5,11,12,13,14,15, включая наших коллег, которые использовали этот протокол 16. Эти устройства обычно включают датчик, монтажное устройство, приемник и программное обеспечение. Датчик имеет канюлю, направляющую ферментативный глюкосенсор, клейкую ленту, источник энергии, кратковременную память и модуль беспроводной связи, который хранит и отправляет данные на приемник. Приемник может показывать текущие уровни глюкозы и отправляет данные на сервер; Этот приемник может быть мобильным телефоном. Программное приложение предоставляет данные для пациента и медицинской бригады о гликемии пациента. У пациентов датчик легко крепится с помощью крепежного устройства. Канюля вводится подкожно, прижимая крепежное устройство к коже, а датчик остается на месте с помощью клейкой ленты.
Это подробный протокол адаптации коммерческого устройства CGM для измерения уровня глюкозы у мышей. Этот протокол описывает, как хирургическим путем вставить датчик глюкозы и прикрепить его к мыши. Предусмотрены скрипты для базового анализа и визуализации данных. Приведены возможные подводные камни, устранение неполадок и примеры стандартных результатов. Приведенный ниже протокол специфичен для определенного CGM, но может быть легко адаптирован к другим типам коммерческих CGM по мере их появления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Еврейского университета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты должны быть стерилизованы, а обращение с канюлей должно выполняться с использованием стерильной техники. Приведенный ниже протокол точно настроен для конкретного CGM. Протокол может быть адаптирован к другим CGM.
1. Введение анальгетика перед процедурой
- Вводят 5% декстрозу и 0,45% физиологический раствор с мелоксикамом в дозе 5 мг / кг массы тела подкожно.
2. Введение анестезии
- Поместите мышь в индукционную камеру, плотно закрыв крышку. Установите индукцию анестезии в индукционной камере на 3% изофлурана при скорости потока 500 мл/мин.
- Как только мышь перестанет отвечать, извлеките мышь из камеры и прикрепите носовой конус к мыши. Подтвердите уровень анестезии межпальцевым щипцом. Установите концентрацию 1%-1,5% изофлурана и скорость потока 100 мл/мин у мыши весом 30 г.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
3. Подготовка датчика
- Установите датчик на устройство крепления датчика, чтобы обнажить ленту датчика и сторону канюли (рис. 1A). Будьте осторожны, так как игла вставляется в канюлю и обнажается.
- Наложите два конических шва 5-0 на ленту с обеих сторон канюли (рис. 1А).
4. Эпиляция и дезинфекция
- Побрейте область примерно 4 см х 4 см по средней линии спины мыши.
- Нанесите крем для депиляции на выбритую область, чтобы обеспечить полное удаление волос.
- Протрите кожу и продезинфицируйте ее с помощью антисептического раствора, содержащего 2% хлоргексидина глюконата и 70% изопропилового спирта.
5. Подготовка спинной кожи
- Сделайте разрез 2 мм в центре выбритого участка над позвоночником с помощью острых ножниц (рис. 1B).
- Вкратце, вставьте небольшие щипцы с тупым краем под кожу, чтобы сформировать небольшой подкожный карман, чтобы канюлю можно было легко вставить в подкожный карман (рис. 1B).
- Проведите шов, начиная с шага 3.2, через кожу с каждой стороны разреза (рис. 1C).
6. Вставка датчика
- Полностью извлеките датчик из устройства крепления датчика (канюля пуста от иглы) и удерживайте датчик щипцами, чтобы окружающая лента не прилипала к себе.
- Аккуратно вставьте канюлю в подкожный карман.
- Натяните швы с каждой стороны, затяните и завяжите их, чтобы надежно закрепить датчик на месте, тем самым предотвращая выскальзывание канюли из подкожного кармана после того, как клейкая лента со временем ослабнет.
7. Крепление и наложение швов на датчик
- Плотно прикрепите датчик к задней части, завязав внутренние швы и используя клейкую ленту, окружающую датчик.
- Наложите восемь прерывистых швов вокруг датчика, прикрепив границу ленты датчика к коже (рис. 1D).
8. Активация считывателя
- После того, как датчик будет вставлен, активируйте считыватель, включив считыватель, нажав « Начать новый датчик» и проведя пальцем по датчику в соответствии с инструкциями производителя.
- Первое чтение можно сделать только через несколько минут после установки CGM. В случае этого CGM первое чтение может быть снято через 60 минут.
9. Результаты считывания
- Поместите считыватель близко к мыши (прикасаться к нему не нужно). Все данные, хранящиеся в датчике, передаются на считыватель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные устройства CGM могут отличаться по периоду исторической емкости сохранения данных. В случае этого CGM между двумя показаниями может храниться не более 8 часов.
10. Снятие датчика
- Обезболить мышь (см. раздел 2).
- Разрежьте швы, соединяющие датчик с задней частью мыши, с помощью острых ножниц.
- Снимите и разрежьте швы на разрезе, аккуратно извлекли датчик.
- При необходимости используйте один шов, чтобы закрыть разрез в задней части мыши.
11. Анализ данных
- Загрузка данных: Загрузите данные в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем CGM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый CGM имеет свой формат, который может быть или не быть легко доступным для пользователя. Это важное соображение при выборе CGM. - Для анализа с помощью предоставленного программного обеспечения отформатируйте данные в соответствии с инструкциями в файле readme на Github (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git).
Рисунок 1: Крепление датчика к мыши . (A) Два шва, отмеченные красными стрелками, пропускаются через сенсорную ленту с обеих сторон канюли на нижней стороне датчика CGM, отмеченного белой стрелкой. (B) Острыми ножницами в центре бритой области вдоль позвоночника делается небольшой разрез толщиной 2 мм. Небольшие щипцы с тупым краем ненадолго вставляются под кожу, образуя небольшой подкожный карман, чтобы канюлю можно было вводить подкожно. (C) Те же швы из А накладываются подкожно с каждой стороны разреза. Красные стрелки отмечают швы, прикрепленные к датчику, как показано в A, синие стрелки отмечают место, где швы прошли через кожу в задней части мыши, а черная стрелка показывает разрез. (D) После того, как канюля вставлена, внутренние швы затягиваются и завязываются близко к разрезу, чтобы закрепить CGM. Затем датчик пришивается к коже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Исход операции
Показаны результаты восьми мышей HSD: ICR (в возрасте 8 недель), которых кормили диетой с высоким содержанием жиров и высоким содержанием сахарозы (HFHS) в течение 18 недель, и пяти постных мышей HSD: ICR (в возрасте 12 недель). Устройство, которое мы использовали, хранит данные до 8 часов. Доступ к местному животноводческому комплексу был ограничен с 07:00 до 19:00, что запрещало сбор данных в поздние часы, когда мыши активны. Поэтому мышей поместили в комнату с обратным освещением за 7 дней до хирургической процедуры, с темными часами между 8:30 и 20:30. Это не обязательно для всех устройств или помещений для животных, и мы рекомендуем использовать устройства, которые могут хранить информацию более 12 часов.
Смертности после операции не было. Операция привела к потере веса примерно на 10% во время эксперимента (рис. 2А). Поэтому измерения, сделанные в первые несколько дней после операции, во время похудения, следует интерпретировать с осторожностью. Потеря веса не была связана с неспособностью мышей дотянуться до пищи и воды. Сравнение измерений CGM и измерений уровня глюкозы в крови на кончике хвоста показало хорошее совпадение в состояниях натощак и без голодания (рис. 2B). CGM был активен в среднем в течение 11 дней (рис. 2C). Максимальное количество дней для этого типа устройств составляет 14 дней. Когда устройство стало неактивным раньше, это произошло не из-за падения CGM.
Рисунок 2: Общие результаты применения CGM. (A) Среднее снижение веса в течение времени активности CGM. n = 8 мышей. (B) Средняя разница между показаниями глюкозы с помощью ручного глюкометра и устройства CGM. Разница существенно не отличалась от 0 мг/дл. n = 10 показаний у шести мышей. (C) Среднее время, в течение которого CGM был активен у n = 8 мышей. Полосы погрешности представляют собой стандартную погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Необработанный выход
Уровни глюкозы за один день показаны на графике, созданном программным обеспечением CGM (рис. 3A). Данные за несколько дней можно просмотреть с помощью предоставленного кода (рис. 3B). Для наглядности показываем данные за 3 дня.
Рисунок 3: Анализ данных . А) Коммерческая продукция. Данные не были собраны с 18:00 до полуночи. Заштрихованная область показывает значения нормогликемии у пациентов, которые составляют от 70 до 100 мг / дл. (B) Необработанные выходные данные за 3 дня с одной мыши с использованием предоставленного кода. Обратите внимание на разницу в масштабе по оси Y между A и B. Параметры оси и все остальные параметры могут быть модулированы в коде. Для наглядности приведены данные за 3 дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Анализ
После извлечения данных анализ может быть выполнен с использованием предоставленного кода или любого другого специально разработанного программного обеспечения. Ниже приведены средние (рис. 4A, C) и медианные (рис. 4B, D) уровни глюкозы в каждый момент времени для одной мыши. Для сглаживания участка можно использовать раздвижное окно. Для наглядности показаны только две мыши.
Рисунок 4: Вывод анализа данных с использованием предоставленных скриптов . (A) Средний и (B) средний уровень глюкозы в каждый момент времени у конкретной мыши. Заштрихованная область обозначает стандартное отклонение уровня глюкозы. (C) Средний и (D) средний уровень глюкозы у двух мышей. Для наглядности показаны только две мыши. Пунктирной линией обозначен переход от светлого (20:30-08:30) к темному (8:30-20:30). Для сглаживания кривой использовалось скользящее окно продолжительностью 20 минут. Размер окна и все параметры могут быть изменены в коде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол предлагает простой, недорогой метод мониторинга уровня глюкозы у мышей, который не требует сложной микрохирургии и не связан с кровотечением или обращением с мышами. Метод прост в применении в каждом учреждении и не вызывает смертности, боли или чрезмерного дискомфорта у мышей. Наиболее важным шагом в протоколе является введение канюли датчика глюкозы под кожу мыши. Добавление нескольких швов позволяет канюле оставаться на месте в течение более длительного времени. Датчики маленькие и могут блокироваться или теряться при движении мыши. Датчик должен быть закреплен внутренними швами и прикреплен к задней части мыши несколькими швами. Протокол может быть адаптирован ко многим коммерческим системам CGM.
Мыши потеряли вес после операции, что ожидается после операции и может быть связано со стрессом от операции и анестезии, бременем переноски устройства и одноместным жильем, налагаемым конкретным протоколом, используемым в этом исследовании. По мере того, как устройства CGM становятся все более легкими и точными, ожидается, что эти эффекты станут меньше. Мы наблюдали, что мыши, несущие CGM, свободно перемещались в клетке и добирались до пищевых гранул, по которым требовалось лазить. Метод ограничен способностью каждого CGM функционировать с течением времени. Исследователи должны следить за потерей веса и учитывать преимущества и недостатки этого метода по сравнению со стандартными альтернативами, требующими частого обращения и кровотечения мышей, которые предполагают, что кровотечение одной мыши мало влияет на гликемию ее соседей и включает измерение уровня глюкозы в стрессовом состоянии в дневное время.
Описанный выше протокол довольно прост, быстр и масштабируем. Он не требует специальной настройки в животноводческом помещении или дорогостоящего оборудования, может использоваться параллельно с другими процедурами, входящими в состав эксперимента, и может использоваться на любом генетическом фоне или с любым питанием. Сценарии анализа данных предоставляются для облегчения анализа исследовательскими группами, которые имеют меньший опыт в анализе данных. Надеемся, что этот подробный протокол и сценарии анализа данных позволят другим лабораториям измерять глюкозу в своих экспериментах в области метаболизма и других исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Двир Минц DVM и ветеринарный и животноводческий персонал животноводческого комплекса, а также членов нашей группы за плодотворные обсуждения. Это исследование было поддержано грантом Израильского научного фонда 1541/21, присужденным D.B.Z. D.B.Z. является факультетом STEM Цукермана.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% Chlorhexidine Gluconate and 70% Isopropyl Alcohol | 3M | ID 7000136290 | |
| 5% Dextrose and 0.45% Sodium Chloride Injection, USP | Braun | L6120 | |
| Castroviejo needle holder | FST | 12061-02 | |
| Extra Fine Bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| FreeStyle Libre 1 reader | Abbott | ART27543 | |
| FreeStyle Libre sensor | Abbott | ART36687 | |
| FreeStyle Libre sensor applicator | Abbott | ART36787 | |
| Gauze pads | Sion medical | PC912017 | |
| Graefe Forceps | FST | 11052-10 | |
| Hair Removal Cream | Veet | 3116523 | |
| High-fat high-sucrose diet | Envigo Teklad diets | TD.08811 | |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal | 26675-46-7 | |
| Meloxicam 5 mg/mL | Chanelle Pharma | 08749/5024 | |
| MiniARCO Clipper kit | Moser | CL8787-KIT | |
| PROLENE Polypropylene Suture 5-0 | Ethicon | 8725H | |
| Puralube Opthalmic Ointment | Perrigo | 574402511 | |
| Q-tips | B.H.W | 271676 | |
| SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System | Kent Scientific | SOMNO |
References
- Polonsky, K. S. The past 200 years in diabetes. New England Journal of Medicine. 367 (14), 1332-1340 (2012).
- Rees, D. A., Alcolado, J. C.
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the non-obese diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Heydemann, A. An overview of murine high fat diet as a model for Type 2 diabetes mellitus. Journal of Diabetes Research. 2016, 2902351 (2016).
- Kennard, M. R., et al. The use of mice in diabetes research: The impact of experimental protocols. Diabetic Medicine. 38 (12), 14705 (2021).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technology and Therapeutics. 8 (3), 402-412 (2006).
- Wuyts, C., Simoens, C., Pinto, S., Philippaert, K., Vennekens, R. Continuous glucose monitoring during pregnancy in healthy mice. Scientific Reports. 11, 4450 (2021).
- Korstanje, R., et al. Continuous glucose monitoring in female NOD mice reveals daily rhythms and a negative correlation with body temperature. Endocrinology. 158 (9), 2707-2712 (2017).
- Han, B. G., et al. Markers of glycemic control in the mouse: Comparisons of 6-h-and overnight-fasted blood glucoses to Hb A1c. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 295 (4), 981-986 (2008).
- Xie, X., et al. Reduction of measurement noise in a continuous glucose monitor by coating the sensor with a zwitterionic polymer. Nature Biomedical Engineering. 2 (12), 894-906 (2018).
- Van Der Meulen, T., et al. Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nature Medicine. 21 (7), 769-776 (2015).
- Peterson, Q. P., et al. A method for the generation of human stem cell-derived alpha cells. Nature Communications. 11, 2241 (2020).
- Klueh, U., Liu, Z., Feldman, B., Kreutzer, D. Interstitial fluid physiology as it relates to glucose monitoring technologies: Importance of Interleukin-1 and Interleukin-1 receptor antagonist in short-term glucose sensor function in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 4 (5), 1073 (2010).
- Klueh, U., Antar, O., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Role of interleukin-1/interleukin-1 receptor antagonist family of cytokines in long-term continuous glucose monitoring in vivo. Journal of Diabetes Science and Technology. 7 (6), 1538 (2013).
- Klueh, U., Kaur, M., Qiao, Y., Kreutzer, D. L. Critical role of tissue mast cells in controlling long-term glucose sensor function in vivo. Biomaterials. 31 (16), 4540-4551 (2010).
- Kogot-Levin, A., et al. Mapping the metabolic reprogramming induced by sodium-glucose cotransporter 2 inhibition. JCI Insight. , 164296 (2023).
