Summary
Burada sunulan protokol, güçlü bir yapışkan hidrojel jelatin o-nitrosobenzaldehitin (jelatin-NB) sentezini göstermektedir. Jelatin-NB, yara yüzeylerini korumak için güçlü bir fiziksel bariyer oluşturabilen hızlı ve etkili doku yapışma yeteneğine sahiptir, bu nedenle yaralanma onarımı biyoteknolojisi alanına uygulanması beklenmektedir.
Abstract
Yapışkan malzemeler, biyomedikal ve doku mühendisliği alanında popüler biyomalzemeler haline gelmiştir. Önceki çalışmamızda, esas olarak doku rejenerasyonu için kullanılan ve kornea hasarı ve enflamatuar bağırsak hastalığının hayvan modellerinde doğrulanan yeni bir materyal - jelatin o-nitrosobenzaldehit (jelatin-NB) - sunduk. Bu, biyolojik jelatinin o-nitrosobenzaldehit (NB) ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojeldir. Jelatin-NB, NB-COOH'un karboksil grubunu aktive ederek ve jelatin ile 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisüksinimid (NHS) yoluyla reaksiyona girerek sentezlendi. Elde edilen bileşik, en az 18 ay boyunca istikrarlı bir şekilde saklanabilen nihai ürünü üretmek için saflaştırıldı. NB, doku üzerinde -NH2'ye güçlü bir yapışmaya sahiptir, bu da birçok C = N bağı oluşturabilir, böylece jelatin-NB'nin doku arayüzüne yapışmasını arttırır. Hazırlama süreci, NB-COOH grubunun sentezi, grubun modifikasyonu, jelatin-NB sentezi ve bileşiğin saflaştırılması için adımları içerir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez sürecini ayrıntılı olarak tanımlamak ve jelatin-NB'nin hasar onarımına uygulanmasını göstermektir. Ayrıca, protokol, daha uygulanabilir senaryolar için bilimsel topluluk tarafından üretilen malzemenin doğasını daha da güçlendirmek ve genişletmek için sunulmaktadır.
Introduction
Hidrojel, suyun şişmesiyle oluşan üç boyutlu bir polimer türüdür. Özellikle, hücre dışı bir matristen elde edilen hidrojel, mükemmel biyouyumluluğu ve terapötik etkinliği nedeniyle biyosentez ve rejeneratif tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır1. Gastrik ülser, nevrit, miyokard enfarktüsü 2,3,4 ve diğer hastalıkların tedavisi için hidrojeller bildirilmiştir. Ayrıca, jelatin-NB'nin inflamasyon ininflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) sonucunu destekleyebileceği kanıtlanmıştır5. Geleneksel hidrojeller arasında jellan zamkı, jelatin, hyaluronik asit, polietilen glikol (PEG), katmanlı, hidrofobik / hidrofilik, aljinat / poliakrilamid , çift ağ ve poliamfoterik hidrojeller6 bulunur ve bunların hepsi iyi histouyumluluk ve mekanik özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, bu geleneksel hidrojeller ortamdaki neme ve havaya karşı savunmasızdır. Uzun süre havaya maruz kalırlarsa, su kaybederler ve kururlar; suya uzun süre daldırılırlarsa, suyu emer ve7'yi genişletir, böylece esnekliklerini ve mekanik işlevlerini azaltırlar. Ek olarak, geleneksel hidrojellerin doku yapışmasını sağlamak büyük bir zorluktur8.
Buna dayanarak, biyolojik jelatinin NB ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojel olan nano ölçekli bir hidrojel jelatin-NB tasarladık ve sentezledik (Şekil 1). NB, doku üzerinde -NH2'ye güçlü bir yapışma kabiliyetine sahiptir, bu da çok sayıda C = N bağı oluşturabilir, böylece hidrojel-doku arayüzünün yapışkanlığını arttırır. Bu güçlü yapışma, hidrojelin doku yüzeyine sıkıca yapışmasını sağlayabilir, böylece nano düzeyde bir moleküler kaplama oluşturabilir. Ekibin önceki çalışmalarında, bu tür modifiye hidrojel kaplamanın doku yapışmasını iyileştirdiği doğrulanmıştır9; kornea ve bağırsak organlarına ve dokularına stabil bir şekilde yapışabilir ve anti-inflamasyon, bariyer izolasyonu ve rejenerasyon teşvik rolleri oynayabilir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez işlemini burada ayrıntılı olarak tanıtmaktır, böylece jelatin-NB daha fazla hasar onarımı senaryosunda uygulanabilir. Ayrıca, diğer araştırmacıları bu malzemenin doğasını daha fazla uygulama senaryosuna uyacak şekilde daha da güçlendirmeye ve genişletmeye teşvik ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL / 6 fareleri, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi'nden satın alındı. Yeni Zelanda tavşanları Zhejiang Üniversitesi'nden satın alındı. Hayvanlar doğal ışık-karanlık döngü koşullarında tutuldu ve serbestçe yiyecek ve içme suyu verildi. Tüm deneysel prosedürler, Zhejiang Üniversitesi Etik Komitesi standart kılavuzlarının (ZJU20200156) ve Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin kurumsal kılavuzları tarafından etik olarak onaylanmıştır.
1. NB-COOH sentezi
- Önceki çalışmada önerilen protokole dayanarak 4-hidroksi-3-(metoksi-D3) benzaldehit (8.90 g, 58.5 mM, 1.06 eşdeğeri [eq.]), potasyum karbonat (10.2 g, 73.8 mM, 1.34 eq.) ve metil 4-bromobutirat (9.89 g, 55.0 mM, 1.0 eq.) hazırlayın10. Bileşikleri 40 mL N, N-dimetilformamid (DMF) içinde çözün ve ortam sıcaklığında 16 saat karıştırın.
- Karışıma 200 mL 0 °C su ekleyin ve ham bir ürün elde etmek için karışımı çökeltin.
- Ham ürünü DMF'de tekrar tekrar çözün ve ardından beş döngü boyunca çökeltin. Ham ürünü çökeltin ve erken ürünü elde etmek için 80 ° C'de 2 saat kurutun.
2. Kimyasal modifikasyon ve işleme
- Aşağıda açıklandığı gibi metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksifenil) butanoik asit metil esterin ipso ikamesini gerçekleştirin.
- % 70 nitrik asit (140 mL) önceden soğutulmuş (-2 °C) çözeltisine yavaşça 9.4 g metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksi) butanoat (37.3 mM, 1 eq.) ekleyin ve 3 saat boyunca -2 °C'de karıştırın.
NOT: Nitrasyon reaksiyonunun sıcaklığına bağlı olarak, formil moiety'nin ipso ikamesi gerçekleşecektir. - Karışımı (~ 9.0 g) 200 mL 0 °C su ile süzün, ardından katı bir ürünü çökeltmek için DMF'de saflaştırın.
- Katı ürünü trifloroasetik asit (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 mL) içinde 90 °C'de hidrolize edin ve kurutun. Son ara ürün, kuru soluk sarı bir toz elde etmek için çözücüyü 80 kPa'nın altında çıkarın.
- Ara ürünü (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) tetrahidrofuran (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 mL) içinde çözün. Daha sonra 0 °C'de yavaşça1,43 g NaBH 4 (35,7 mM, 1,5 eq.) ekleyin. 3 saat sonra, tüm çözücüleri bir vakum altında çıkarın ve kalıntıyı 1: 1 su ve diklorometan çözeltisinde (her biri 50 mL) askıya alın.
- Ürünü sulu tabakadan çıkarmak için diklorometan hazırlayın. Organik tabakayı çıkarın ve magnezyum sülfat üzerinde kurutun.
- Ham ürünü, DCM / MeOH kullanarak 10: 1 oranında (% 1 TEA) silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Son olarak, 5.31 g (18.6 mM, 78.3%) nispeten saf sarımsı toz NB-COOH elde edin.
3. Jelatin-NB sentezi
- Bir parti modifikasyon için 5 g jelatin hazırlayın. 5 g jelatini 100 mL deiyonize suda eriterek homojen bir jelatin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'de saklayın.
NOT: Burada, orijinal 33 x 10-5 mol ε-amino grupları/g jelatin11 tanımlanmıştır. - Besleme oranını (FR), jelatindeki NB grupları ve primer amino grupları arasındaki molar oran olarak tanımlayın. Bu çalışmada 1 g jelatin içeren 53 mg NB FRNB = 1 olarak tanımlanmıştır.
- NB-COOH'un karboksil gruplarını aktive etmek için 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.060 mg NB-COOH çözün. NB grubu çözelti halindeyken ultraviyole (UV) ışığa duyarlı olduğundan, daima ışıktan uzak tutun.
- NB-COOH DMSO çözeltisine 746 mg 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodimid hidroklorür (EDC) ekleyin ve 5 dakika karıştırın. EDC çözüldükten sonra, 448 mg N-hidroksisüksinamid (NHS) ekleyin ve 5 dakika karıştırın.
- Karışımı 0,5 mL/dak hızında, 4 saat boyunca 45 °C'de reaksiyona girmek üzere kuvvetli bir karıştırma ile çözünmüş jelatin çözeltisine yavaşça düşürmek için bir damlama hunisi kullanın.
4. Ürünün saflaştırılması ve depolanması
- Jelatin-NB çözeltisini aşırı deiyonize suya karşı en az 3 gün boyunca diyalize edin, daha sonra jelatin-NB köpüklerini elde etmek için toplayın, dondurun ve liyofilize edin. Daha fazla kullanım için köpükleri karanlıkta bir kurutucuda tutun.
- Dondurularak kurutulmuş jelatin-NB köpükleri, kullanımdan hemen önce, 37 °C'de deiyonize suda çözün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2A , NB gruplarını jelatin üzerine aşılayarak doku entegrasyonunu teşvik eden jelatin-NB sentezinde yer alan ana kimyasal reaksiyonların bir şemasını göstermektedir. Şekil 2B, jelatin-NB hidrojelinin O-nitrobenzenin, UV ışınlamasından hemen sonra bir NB grubuna dönüştüğünü ve daha sonra aktif aldehit grubunun bir Schiff tabanı oluşturmak için bir amino grubuyla çapraz bağlanabileceğini göstermektedir. Şekil 2C, NB gruplarının farklı oranlarının, jelatin-NB'nin farklı çapraz bağlı yapılarına yol açabileceğini göstermektedir.
Aynı zamanda, jelatin-NB'nin fiziksel özelliklerinin ön karakterizasyonu da yapılmıştır. Şekil 3'te gösterildiği gibi, jelatin-NB, NB'nin besleme oranı (FR) düşük olduğunda güçlü bir jelleşmeye sahiptir. Bu, düşük FR'li jelatin-NB'nin, fotojenere aldehit gruplarıyla reaksiyona girebilen çok sayıda amino grubunun varlığı nedeniyle yumuşak bir hidrojel oluşturduğu, yüksek FR'li jelatin-NB'nin esnek bir damlacığı koruyabileceği anlamına gelir. Ayrıca, jelatin-NB'nin genel morfolojisinin, Şekil 3C'de gösterildiği gibi, elektron mikroskobu (SEM) taranarak kornea yüzeyine istikrarlı bir şekilde yapıştığını gözlemledik. Bununla birlikte, hiçbir şey veya jelatin ile muamele edilmemiş yaralı bir kornea yüzeyi pürüzsüz görünmektedir. Şekil 3D, floresan olarak etiketlenmiş jelatin-NB'nin bağırsak dokusuna yapışma ve yoğun bir kaplama oluşturma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, jelatin grubunun floresan yoğunluğu çok zayıftır, bu da bağırsak duvarına sıkıca yapışmadığını gösterir. Şekil 3E, hem jelatin hem de jelatin-NB'nin başlangıçta aminlenmiş plakaya yapışabildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, fosfat tamponlu salin (PBS) aminlenmiş plakaya döküldükten ve 24 saat boyunca her 4 saatte bir değiştirildikten sonra, sadece jelatin-NB güçlü bir floresan tutar ve bu da güçlü bir şekilde yapıştığını gösterir. Bu sonuçlar, jelatin-NB'nin düzgün ve kararlı bir yoğun tabaka oluşturmak için doku yüzeyine yapışabileceğini göstermektedir. Şekil 3F'de gösterildiği gibi, bir kornea yüzeyinin spektrumu ve jelatin ile muamele edilmiş bir yüzey neredeyse aynıdır. Bununla birlikte, jelatin-NB ile tedavi edilen grupta, 400 eV'de ortaya çıkan ve UV ile aktive edilen jelatin-NB12 ile tedaviden sonra dokuda birçok C = N bağının oluşumunu gösteren ekstra bir tepe noktası vardır.
Resim 1: NB-COOH sentez reaksiyonunun adımları. Şekil, sentez reaksiyonunun şematik bir temsilini sağlar Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Jelatin-NB'nin tasarımı ve sentezi . (A) Jelatin-NB oluşumu için kimyasal reaksiyonun şeması. (B) Jelatin-NB hidrojelinin foto-tetiklemeli kimyasal yapı dönüşümünü gösteren şematik diyagram. O-nitrobenzen, UV ışınlarına maruz kalma altında NB gruplarına dönüştürülür. Daha sonra aktif aldehit grubu daha sonra Schiff bazları oluşturmak için amino gruplarıyla çapraz bağlanabilir. (C) Jelatin-NB oluşturan hidrojel ve kaplamanın farklı besleme oranları altında şematik. Bu rakam12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Jelatin-NB'nin karakterizasyonu. (A) Jelatin-NB'nin çeşitli besleme oranları ile değişen jelleşme performansı. (1-4) jelatin-NB'nin sırasıyla 0.5, 1, 2 ve 4 NB besleme oranlarını temsil eder. (B) UV aydınlatmasından sonra inaktive edilmiş modifiye jelatin-NB çözeltisinin ve jelatin-NB çözeltisinin brüt görünümü. (C) Yaralı kornea yüzeyinin, jelatinin ve jelatin-NB-4 protein kaplaması ile işlenmiş kornea yüzeyinin SEM görüntüleri. Ölçek çubukları: 30 μm (üst paneller); 40 μm (alt paneller, büyütülmüş). (D) Jelatin ve jelatin-NB moleküler kaplama ile etiketlenmiş farelerin kolonik yüzeyinin floresan görüntüleri. Ölçek çubukları: 200 μm. (E) Etiketli jelatin ve jelatin-NB moleküler kaplama ile işlenmiş aminasyonlu plakaların 0 saat ve 24 saatte floresan görüntüleri. Ölçek çubukları: 20 μm. (F) X-ışını foton spektroskopisi (XPS) jelatin-NB-4'ün dokuya bağlanması. Peptit -C-NH- ve amino amin grubu C-NH2'nin C = N bağ zirvesinin ortaya çıkması nedeniyle kayan bağ enerjileri, Schiff bazlarının UV kaynaklı oluşumunu ortaya koymaktadır. Bu rakam5 ve12'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yapışkan malzemeler yeni bir malzeme sınıfıdır. Giderek daha fazla araştırmacı, çeşitli yapışkan malzemelerin sentezine kendini adamıştır ve biyoteknoloji, doku mühendisliği, rejeneratif tıp ve son yıllarda güçlü bir gelişmeye yol açan diğer alanlarda uygulamalarını bulmaya çalışmaktadır. Yapışkan malzemelerin güçlü yapışmasına odaklanmanın yanı sıra, araştırmacılar ayrıca enjekte edilebilirlik, kendi kendini iyileştirme, hemostatik, antibakteriyel, kontrollü çıkarma ve benzeri gibi diğer özelliklere de daha fazla dikkat ediyorlar13. Bu yeni uygulamalar, umut verici uygulama beklentileri ile yapışkan malzemelerin uygulama kapsamını büyük ölçüde genişletmektedir.
Bu yazıda, yeni bir hidrojel jelatin-NB'nin sentez yöntemi tanıtılmıştır. Jelatin-NB'nin güçlü yapışıklığı vardır ve klinik pratikte kornea hasarı ve intestinal hasarın onarımında uygulanabileceği bildirilmektedir 5,12. Bu nedenle, jelatin-NB'nin hazırlama yöntemini popülerleştirmek büyük akademik ve uygulama değerindedir.
Jelatin-NB hazırlamanın en önemli adımı sentez işlemidir. Jelatinde NB grubu ile primer amino grubu arasındaki molar oran olan besleme oranı (FR) kavramını öneriyoruz. Jelatin-NB'yi sentezlemek için FR bir sabit değildir ve yapışkan doku arayüzünün doğasına göre ayarlanabilir. Tavşan korneaları için, jelatin-NB göz damlalarının FR'si FRNB = 2 iken, fare kolonlarının yüzeyindeki amino gruplarının sayısı nispeten yüksektir12; FRNB = 2, bunun için en uygun FR olmadığını kanıtlar ve optimal yapışma etkisini elde etmek için genellikle yaklaşık 4'e çıkarılması gerekir. Farklı uygulama senaryolarında jelatin-NB sentezlenirken, en iyi yapışma etkisini keşfetmek için bir ön deney FR gradyanı ayarlamak gerekir. Ayrıca yazıda NB'nin her zaman UV ışığından uzak tutulması gerektiğinden bahsetmiştik, çünkü NB grupları UV'ye karşı çok hassastır; UV ışığının NB grupları üzerindeki etkisini en aza indirmek için sentez işlemi sırasında tüm doğrudan ışık kaynaklarından mümkün olduğunca kaçınmanızı öneririz.
Aynı zamanda, bu sentez teknolojisinin bazı sınırlamaları vardır. Örneğin, ham ürünlerin düşük verimi, daha fazla hammadde tüketimine ihtiyaç duyulmasına neden olmaktadır. Reaksiyon sıcaklığını ayarlamak ve reaksiyon süresini daha da uzatmak gibi verimi artırmak için çeşitli reaksiyon koşullarını değiştirmeye çalışıyoruz. Araştırma ilerlemesini zaman içinde güncelleyeceğiz. Araştırmacılar, jelatin o-nitrosobenzaldehitin hazırlama stratejisini geliştirmek için videoya başvurabilir veya daha fazla biyomedikal ihtiyacı karşılamak için grubu bu temelde daha da değiştirebilirler. Bu yazıda açıklanan jelatin o-nitrosobenzaldehitin sentez yönteminin biyosentetik ve rejeneratif tıbbın gelişimini hızlandıracağına inanıyoruz. Ek olarak, jelatin-NB'nin akut vasküler hasarın neden olduğu kanama, karaciğer ve dalak rüptürü ve gelecekte gastrik perforasyon gibi kritik klinik vakalarda daha fazla uygulanması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Hiç kimse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hydroxy-3-(methoxy-D3) benzaldehyde | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| methyl 4-(4-formyl-2-methoxyphenoxy methoxyphenyl) butanoic acid methyl ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| methyl 4-bromobutyrate | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitric acid | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
References
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604 (2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587 (2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315 (2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060 (2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
