Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

الماوس في الجسم الحي المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/64760
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 1,2,3,4
1Interdisciplinary Graduate Program in Genetics, University of Iowa, 2Department of Psychiatry, Carver College of Medicine, University of Iowa, 3Iowa Neuroscience Institute, Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Hawk-IDDRC, University of Iowa

Summary

نصف هنا طريقة محددة زمنيا للتعامل بفعالية مع المسارات التنموية الحرجة في مشيمة الفأر في الجسم الحي. يتم إجراء ذلك من خلال الحقن والتثقيب الكهربائي لبلازميدات كريسبر في مشيمة السدود الحامل في اليوم الجنيني 12.5.

Abstract

المشيمة هي عضو أساسي ينظم ويحافظ على نمو الثدييات في الرحم. المشيمة مسؤولة عن نقل العناصر الغذائية والفضلات بين الأم والجنين وإنتاج وتوصيل عوامل النمو والهرمونات. تعد التلاعب الجيني المشيمي في الفئران أمرا بالغ الأهمية لفهم الدور المحدد للمشيمة في تطور ما قبل الولادة. الفئران المعدلة وراثيا المعبرة عن المشيمة لها فعالية متفاوتة ، ويمكن أن تكون الطرق الأخرى لمعالجة الجينات المشيمة بدائل مفيدة. تصف هذه الورقة تقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة الجينات كريسبر ، والتي يمكن استخدامها لتعديل التعبير عن الجينات المستهدفة. باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، تخضع السدود الحامل لبضع البطن في اليوم الجنيني 12.5 (E12.5) ، ويتم تسليم بلازميد كريسبر بواسطة ماصة زجاجية دقيقة إلى المشيمة الفردية. يتم إلكتروبيد البلازميد على الفور بعد كل حقنة. بعد تعافي السد، يمكن أن تستمر المشيمة والأجنة في النمو حتى التقييم في وقت لاحق. يمكن أن يحدد تقييم المشيمة والنسل بعد استخدام هذه التقنية دور وظيفة المشيمة المحددة زمنيا في التنمية. سيسمح هذا النوع من التلاعب بفهم أفضل لكيفية تأثير علم الوراثة المشيمة ووظيفتها على نمو الجنين وتطوره في سياقات مرضية متعددة.

Introduction

المشيمة هي عضو أساسي يشارك في نمو الجنين. يتمثل الدور الرئيسي للمشيمة في توفير العوامل الأساسية وتنظيم نقل العناصر الغذائية والفضلات من وإلى الجنين. تتكون مشيمة الثدييات من أنسجة الجنين والأم ، والتي تشكل واجهة الجنين والأم ، وبالتالي ، فإن الوراثة لكل من الأم والجنين تؤثر على الوظيفة1. يمكن أن تؤدي التشوهات الوراثية أو ضعف وظيفة المشيمة إلى تغيير نمو الجنين بشكل كبير. أظهرت الأعمال السابقة أن علم الوراثة المشيمية وتطورها يرتبطان بالتطور المتغير لأنظمة أعضاء معينة في الجنين. على وجه الخصوص ، ترتبط التشوهات في المشيمة بالتغيرات في دماغ الجنين والقلب ونظام الأوعية الدموية2،3،4،5.

يلعب نقل الهرمونات وعوامل النمو والجزيئات الأخرى من المشيمة إلى الجنين دورا رئيسيا في نمو الجنين6. لقد ثبت أن تغيير إنتاج المشيمة لجزيئات معينة يمكن أن يغير النمو العصبي. يمكن أن يزيد التهاب الأم من إنتاج السيروتونين عن طريق تغيير التعبير الجيني الأيضي للتريبتوفان (TRP) في المشيمة ، مما يؤدي لاحقا إلى تراكم السيروتونين في دماغ الجنين7. وقد وجدت دراسات أخرى تشوهات المشيمة جنبا إلى جنب مع عيوب القلب. يعتقد أن التشوهات في المشيمة تساهم في عيوب القلب الخلقية ، وهو أكثر العيوب الخلقية شيوعا لدى البشر8. حددت دراسة حديثة العديد من الجينات التي لها مسارات خلوية مماثلة في كل من المشيمة والقلب. إذا تعطلت ، يمكن أن تسبب هذه المسارات عيوبا في كلا الجهازين9. قد تؤدي العيوب في المشيمة إلى تفاقم عيوب القلب الخلقية. يعد دور علم الوراثة المشيمة ووظيفتها في تطوير نظام أعضاء الجنين المحدد مجالا ناشئا للدراسة.

الفئران لديها المشيمة الدموية وغيرها من ميزات المشيمة البشرية ، مما يجعلها نماذج مفيدة للغاية لدراسة الأمراض البشرية1. على الرغم من أهمية المشيمة ، يوجد حاليا نقص في التلاعب الجيني المستهدف في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، يوجد حاليا المزيد من الخيارات المتاحة للضربة القاضية أو الضربات القاضية أكثر من الإفراط في التعبير أو التلاعب باكتساب الوظيفة في المشيمة10. هناك العديد من خطوط التعبير عن الكري المعدلة وراثيا للتلاعب الخاص بالمشيمة ، كل منها في سلالات الأرومة الغاذية المختلفة في نقاط زمنية مختلفة. وتشمل هذه Cyp19-Cre و Ada / Tpbpa-Cre و PDGFRα-CreER و Gcm1-Cre 11،12،13،14. في حين أن جينات التحوير Cre هذه فعالة ، فقد لا تكون قادرة على التلاعب ببعض الجينات في نقاط زمنية محددة. هناك طريقة أخرى شائعة الاستخدام إما للتعبير الجيني عن الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن التعبير الوراثي المشيمي وهي إدخال ناقلات الفيروسات العدسية في مزرعة الكيسة الأريمية ، مما يؤدي إلى التلاعب الجيني الخاص بالأرومة الغاذية15,16. تسمح هذه التقنية بتغيير قوي في التعبير الجيني المشيمي في وقت مبكر من التطور. تم استخدام تداخل الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بشكل ضئيل في المشيمة. يمكن إجراء إدخال بلازميدات shRNA بشكل مشابه لتقنية CRIPSR الموضحة في هذه الورقة. وقد تم ذلك في E13.5 لتقليل تعبير PlGF بنجاح في المشيمة ، مع تأثيرات على الأوعية الدموية في الدماغالنسل 17.

بالإضافة إلى التقنيات التي تستخدم في المقام الأول للضربة القاضية أو الضربة القاضية ، يتم إجراء الإفراط في التعبير بشكل شائع مع الفيروسات الغدية أو إدخال بروتين خارجي. التقنيات المستخدمة للإفراط في التعبير لها معدلات نجاح متفاوتة وقد تم إجراؤها في الغالب في وقت لاحق من الحمل. للتحقيق في دور عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) في وظيفة المشيمة ، تم إجراء نقل جين المشيمة بوساطة غدية للحث على الإفراط في التعبير عن جين IGF-1 18,19. تم إجراء ذلك في وقت متأخر من حمل الفئران على E18.5 عن طريق حقن المشيمة المباشر. لتوفير خيارات إضافية والتحايل على الإخفاقات المحتملة للتلاعبات الجينية المشيمية الراسخة ، مثل فشل تركيبة Cre-Lox ، والسمية المحتملة للفيروسات الغدية ، والآثار غير المستهدفة ل shRNA ، يمكن استخدام معالجة CRISPR المباشرة للمشيمة في الجسم الحي 20،21،22. تم تطوير هذا النموذج لمعالجة عدم وجود نماذج الإفراط في التعبير ولإنشاء نموذج يتسم بالمرونة.

تعتمد هذه التقنية على عمل Lecuyer et al. ، حيث تم استهداف بلازميدات shRNA و CRISPR مباشرة في الجسم الحي إلى مشيمة الفئران لتغيير تعبير PlGF 17. يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي مباشرة باستخدام معالجة كريسبر في نقاط زمنية متعددة. لهذا العمل ، تم اختيار E12.5. نضجت المشيمة عند هذه النقطة وهي كبيرة بما يكفي للتلاعب بها ، مما يسمح بإدخال بلازميد كريسبر معين على E12.5 ، والذي يمكن أن يكون له تأثير كبير على نمو الجنين من منتصف إلى أواخر الحمل23,24. على عكس الأساليب المعدلة وراثيا ، ولكن على غرار التحريضات الفيروسية أو تداخل الحمض النووي الريبي ، تسمح هذه التقنية بالإفراط في التعبير أو الضربة القاضية في نقاط زمنية معينة باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا ، وبالتالي تجنب ضعف المشيمة المحتمل أو الفتك الجنيني من التغييرات السابقة. نظرا لأن عددا قليلا فقط من المشيمة يتلقى البلازميد التجريبي أو الرقابي داخل القمامة ، فإن النهج يسمح بنوعين من الضوابط الداخلية. هذه الضوابط هي تلك التي يتم حقنها وتزويدها بالكهرباء باستخدام بلازميد التحكم المناسب وتلك التي لا تتلقى أي معالجة مباشرة. تم تحسين هذه التقنية لإنشاء تعبير مفرط عن جين IGF-1 في مشيمة الفأر عبر وسيط التنشيط التآزري (SAM) CRISPR Plasmid. تم اختيار جين IGF-1 ، حيث أن IGF-1 هو هرمون نمو أساسي يتم تسليمه إلى الجنين ويتم إنتاجه بشكل أساسي في المشيمة قبل الولادة25,26. ستسمح تقنية كريسبر الجديدة التي تستهدف المشيمة بالتلاعب المباشر للمساعدة في تحديد العلاقة بين وظيفة المشيمة ونمو الجنين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا والامتثال للوائح الفيدرالية وسياسة جامعة أيوا وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية.

1. الحيوانات والتربية

  1. حافظ على الحيوانات في دورة ضوء النهار لمدة 12 ساعة مع الطعام والماء الإعلاني.
  2. استخدم إناث الفئران CD-1 الذين تتراوح أعمارهم بين 8-15 أسبوعا. استخدم وجود سدادة جماعية لتحديد E0.5.
  3. على E0.5 ، إيواء منفردة السدود الحامل.

2. معايرة الماصة الدقيقة

ملاحظة: يجب إجراء معايرة الماصة الدقيقة قبل الجراحة عندما يكون ذلك ممكنا.

  1. قبل صنع ومعايرة الماصة الدقيقة ، قم بتخفيف جميع البلازميدات إلى التركيز الموصى به (0.1 ميكروغرام / ميكرولتر) في الماء الخالي من DNase. امزج البلازميد مع صبغة Fast Green المخففة بشكل مناسب (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS) (تركيز البلازميد النهائي: 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر).
  2. اسحب الماصات الدقيقة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية 10 سم بقطر خارجي 1.5 مم وقطر داخلي 0.86 مم مع مجتذب ماصة دقيقة.
  3. قطع بعناية طرف micropipette (2-3 مم) مع ملقط معقمة.
  4. قم بتحميل الماصة الدقيقة في طرف شعري دقيق متصل بحاقن دقيق. تأكد من توصيل الحاقن الدقيق بآلة الحقن المجهري وأن هناك مستويات كافية من النيتروجين لمعايرة الماصة الدقيقة.
  5. بمجرد توصيل الماصة الدقيقة بالحاقن الدقيق ، قم بتحميلها بمحلول صبغة Fast Green لإجراء المعايرة (1 ميكروغرام / ميكرولتر في PBS). قم بمعايرة الماصة الدقيقة لحقن حجم يبلغ حوالي 3.5 ميكرولتر. أفرغ ("امسح") الماصة الدقيقة استعدادا لتحميل محاليل البلازميد على النحو التالي.
    ملاحظة: كل ماصة صغيرة ستكون مختلفة قليلا. لتجنب إتلاف المشيمة أثناء الحقن ، يجب ضبط وقت الحقن بين 0.5-1.5 ثانية. يجب ضبط الضغط بين 1-8.5 رطل / بوصة مربعة. معايرة كل ماصة صغيرة على حدة ؛ إذا تعذر معايرة الماصة الدقيقة ضمن هذه المعلمات ، فلا ينبغي استخدامها.

3. الجراحة (الشكل 1 أ)

ملاحظة: للتحضير ، قم بتنظيف أسطح كل من مناطق التحضير والجراحة بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع وسادة سفلية ماصة في منطقة التحضير. في منطقة الجراحة ، ضع وسادة تدفئة لأسفل ، ثم ضع وسادة سفلية ماصة فوقها. تعقيم جميع الأدوات قبل الجراحة. يجب أن يكون الوقت الذي يكون فيه السد تحت التخدير أقل من 1 ساعة.

  1. التخدير
    1. تطبيق 5 ملغ/ كغ من مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية (ميلوكسيكام) أو مسكن آخر معتمد لدى السد الحامل قبل 30 دقيقة إلى 1 ساعة من الجراحة.
    2. ضع السد الحامل في غرفة تحريض متصلة بمبخر إيزوفلوران.
    3. اضبط المرذاذ على 4٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين.
    4. بمجرد تأكيد التخدير من خلال عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم وانخفاض معدل التنفس ، قم بإزالة السد من غرفة الحث إلى منطقة التحضير.
  2. التحضير للجراحة
    1. في منطقة التحضير ، ضع السد ضعيفا مع مخروط الأنف.
    2. قلل المرذاذ إلى 2٪ إيزوفلوران و 3.5 لتر / دقيقة أكسجين أثناء وجود السد في مخروط الأنف.
    3. حلق بطن السد جيدا وإزالة الفراء الزائد. قم بطلاء البطن المحلوق بمحلول البوفيدون و 70٪ من الإيثانول ثلاث مرات باستخدام أدوات تطبيق معقمة ذات رؤوس قطنية. تطبيق الطبقة النهائية من محلول البوفيدون. لمنع جفاف القرنية ، ضع الجل المسيل للدموع الاصطناعي على كلتا عيني السد (الشكل 2 أ ، ب).
    4. بعد التحضير ، انقل السد مع مخروط الأنف إلى منطقة الجراحة المخصصة.
  3. بضع البطن الرحمي
    ملاحظة: استخدم قفازات معقمة طوال العملية الجراحية. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.
    1. في منطقة الجراحة ، ضع السد مستلقا ، وقم بتثبيت مخروط الأنف في مكانه بشريط. اضبط وسادة التدفئة أسفل وسادة الامتصاص على 45 درجة مئوية.
    2. باستخدام ملقط ومقص ، قم بعمل شق خط الوسط تقريبا 2 سم عبر الجلد. استخدم الملقط لخيمة الجلد ، وقم بعمل شق عمودي في الجلد. بعد ذلك ، قم بعمل شق آخر مماثل الحجم عبر الصفاق لفضح قرون الرحم. باستخدام الملقط ، خيمة الصفاق أثناء عمل شق عمودي (الشكل 2C ، D).
      ملاحظة: قد يؤدي عدم وضع الخيمة بشكل صحيح أثناء شق الصفاق إلى شق قاتل في الأمعاء.
    3. تدليك بلطف قرون الرحم من خلال شق عن طريق الضغط على جانبي البطن. افعل ذلك عن طريق توجيه الرحم بعناية بدون أدوات ، باستخدام الأصابع فقط لتجنب الإصابة العرضية. ضعي الرحم المكشوف فوق ستارة جراحية معقمة تغطي بطن السد وحافظي على رطوبته طوال الجراحة باستخدام قطرات من محلول ملحي معقم ، والذي يمكن تسخينه إلى 30 درجة مئوية قبل الاستخدام حسب الحاجة (الشكل 2E ، F).
      ملاحظة: يمكن تحديد قرون الرحم كما هو موضح في Wang et al.27.
    4. بمجرد تعرض الرحم ، حدد ثلاثة أزواج من المشيمة للتلاعب.
      ملاحظة: يمكن تحديد المشيمة كما وصفها Elmore et al.24. لتحقيق أقصى قدر من بقاء الأجنة ، لا ينبغي علاج أكثر من 6 مشيمات. إذا كان هناك أقل من 12 جنينا ، فلا ينبغي حقن أكثر من 4 مشيمة. اختر مشيمتين متجاورتين بحيث يتلقى أحدهما حقنة تحكم والآخر يتلقى البلازميد التجريبي. يسمح استخدام مشيمتين متجاورتين بمقارنة أفضل للمشيمة في مواقع مماثلة في الرحم ويتيح أيضا زيادة معدل البقاء على قيد الحياة. يتم اختيار أزواج المشيمة المختارة عشوائيا ومتباعدة في جميع أنحاء قرني الرحم (الشكل 1B).
    5. سجل موقع التلاعب بالمشيمة وتنظيم الأجنة داخل قرون الرحم بحيث يمكن التعرف على الأجنة والمشيمة أثناء الجمع ، حيث سيحمل سد واحد كلا من المشيمة / الأجنة المعالجة تجريبيا.
  4. حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي لبلازميد التحكم
    ملاحظة: للحفاظ على تقنية التعقيم ، قم بتعقيم المجاذيف الكهربائية والحاقن الدقيق بمعقم بارد قبل الاستخدام. قم بتغيير القفازات في حالة ملامسة أي سطح غير معقم.
    1. باستخدام الماصة الدقيقة المعايرة ، قم بتحميل كمية كافية من بلازميد التحكم المناسب لثلاث حقن. قم بإجراء جميع الحقن على عمق ~ 0.5 مم أفقيا في المشيمة بين النفضية (البيضاء) ومنطقة الوصلات (الأحمر الداكن) (الشكل 3A-F).
    2. إجراء الحقن في المشيمة السيطرة الثلاثة.
      ملاحظة: قم بإجراء جميع حقن البلازميد الضابطة قبل الحقن التجريبية لتجنب التلوث المتبادل للبلازميدات باستخدام الماصة الدقيقة. سيسمح ذلك باستخدام نفس الماصة الدقيقة ، حيث أن تغيير الماصات الدقيقة ووقت المعايرة يزيد بشكل كبير من وقت الجراحة ويقلل من بقاء السد.
    3. إجراء التثقيب الكهربائي للمشيمة المحقونة بالبلازميد في غضون 2 دقيقة من الحقن.
    4. للتثقيب الكهربائي ، استخدم زوجا من المجاذيف مقاس 3 مم متصلة بآلة التثقيب الكهربائي. لضمان كفاءة دمج كريسبر وصلاحية الأجنة، استخدم إعدادات التثقيب الكهربائي التالية: 2 نبضة، 30 فولت، 30 مللي ثانية نبضة، 970 مللي ثانية نبضة، أحادية القطب.
    5. بعد الحقن ولكن قبل التثقيب الكهربائي مباشرة ، قم بتغطية أماكن التلامس بمحلول ملحي معقم ، مع تطبيق المحلول الملحي بدقة على المواقع الثلاثة على جدار الرحم والمجاديف بقطارة أو حقنة.
    6. اضغط برفق على مجاذيف التثقيب الكهربائي على الجوانب الجانبية للمشيمة. ضع مجداف الأنود فوق موقع الحقن والكاثود المقابل مباشرة (الشكل 4A-C).
    7. اضغط على النبض الموجود على آلة التثقيب الكهربائي ، وانتظر حتى تكتمل النبضتان قبل إزالة مجاذيف التثقيب الكهربائي.
      ملاحظة: غالبا ما ترى كمية صغيرة من الرغوة البيضاء بين المجاذيف والمشيمة أثناء النبضات. إذا لم يحدث هذا ، تحقق من الجهد من المجاذيف باستخدام الفولتميتر قبل الاستخدام مرة أخرى. إذا كانت القراءة على الفولتميتر لا تتطابق مع إعداد جهد التثقيب الكهربائي ، فإن المجاذيف لا تعمل.
  5. حقن المشيمة والتثقيب الكهربائي للبلازميد التجريبي
    1. اتبع نفس الإرشادات الواردة في الخطوة 3.4.1. إلى الخطوة 3.4.2. باستخدام البلازميد التجريبي بدلا من بلازميد التحكم.
    2. إجراء التثقيب الكهربائي لجميع المشيمة التجريبية الثلاثة المحقونة في غضون 2 دقيقة من الحقن. يجب أن يتم ذلك بنفس الطريقة التي يتم بها حقن بلازميدات التحكم. اتبع الخطوة 3.4.4. إلى الخطوة 3.4.7.
  6. الانتهاء من الجراحة
    1. بمجرد اكتمال معالجة المشيمة ، قم بتدليك قرون الرحم برفق داخل تجويف البطن باستخدام الأصابع فقط (الشكل 5 أ).
    2. أولا ، قم بإجراء خيوط مفردة مزدوجة العقد على طبقة الصفاق باستخدام خيوط قابلة للذوبان مطلية ومضفرة بطول 45 سم مع سبيكة إبرة 13 مم 3/8c. باعد بين الغرز بمسافة 2-3 مم (الشكل 5 ب).
    3. بعد خياطة طبقة الصفاق ، قم بخياطة الجلد بخيوط قابلة للذوبان. عقدة ثلاثية الغرز المفردة بمسافة 2-3 مم لضمان عدم تمكن السد من التراجع عن الخياطة (الشكل 5C).
    4. بمجرد اكتمال الخياطة ، اضبط الأيزوفلوران على 1٪ والأكسجين على 3.5 لتر / دقيقة ، وقم بتطبيق لاصق الأنسجة على الغرز على الجلد (الشكل 5 د).
      ملاحظة: لاصق الأنسجة اختياري ولكن يوصى به لمنع إعادة فتح الشق بسبب مضغ السد.
    5. عندما يجف لاصق الأنسجة ، قم بإيقاف تشغيل المرذاذ وإزالة السد من منطقة الجراحة. ضع السد في قفص داعم على ظهره.

4. رعاية ومراقبة ما بعد الجراحة

  1. اسمح للسد الحامل بالتعافي في قفص نظيف تحت الإشراف لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لضمان عدم حدوث مضاعفات فورية للجراحة. راقب حتى يصبح متنقلا بالكامل ويمكن أن ينقلب على قدميه دون مساعدة. منزل منفرد السد بعد الجراحة.
  2. اتبع الرعاية المؤسسية بعد الجراحة والمراقبة حتى جمع الأجنة. سجل وزن السد ، وراقب الغرز وموقع الشق يوميا.

5. E14.5 جمع المشيمة

  1. في E14.5 ، قم بتخدير السد بعمق باستخدام كوكتيل الكيتامين / الزيلازين (1 مجم / مل من الكيتامين و 0.1 مجم / مل زيلازين) ، ثم قم بخلع عنق الرحم للسد.
  2. قم بعمل شق على شكل حرف V في بطن السد بالمقص ، وأزل الرحم. ضعيها على الفور على طبق بتري 5 سم على الثلج. باستخدام ملقط ، قم بإزالة الجنين والمشيمة المقابلة بعناية من الرحم.
    ملاحظة: احتفظ بسجل لموقع الجنين والمشيمة المقابلة في قرون الرحم لتحديد أي منها تلقى التلاعب المباشر أثناء الجراحة.
  3. سجل أوزان المشيمة. باستخدام ملقط وشفرات حلاقة خالية من الحمض النووي الريبي ، اقطع المشيمة إلى نصفين أسفل خط الوسط. ضع نصفا في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية. اقطع النصف المتبقي إلى النصف مرة أخرى ، وقم بتخزين الربعين المتبقيين عند -80 درجة مئوية في أنبوبين ، أحدهما مزود بكاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة وأنسجة الأم الأخرى من المجموعة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

6. تحليل التعبير الجيني المشيمي

  1. استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية في كاشف تخزين الحمض النووي الريبي.
  2. قم بمعالجة المشيمة ل qPCR كما هو موضح في Elser et al. باستخدام طريقة Trizol لعزل الحمض النووي الريبي ، ومقياس الطيف الضوئي لتركيز الحمض النووي الريبي ، ومجموعة تخليق cDNA ، و qPCR مع SYBR Green Master Mix28. بدلا من مجموعة Turbo DNAfree DNA المشار إليها في Elser et al. ، استخدم مجموعة RNAcleanup بعد عزل Trizol RNA للتأكد من أن العينات لا تحتوي على ملوثات28.
    ملاحظة: اقرأ ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) ل Trizol ، واستخدمها في غطاء دخان كيميائي.
  3. تقييم إدخال البلازميد لبلازميد التحكم باستخدام بادئات GFP والبلازميد التجريبي باستخدام بادئات BLAST (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم قيمة التصوير المقطعي المحوسب لتحديد وجود البلازميد.
    ملاحظة: قيم التصوير المقطعي المحوسب فوق 35 هي إيجابيات كاذبة ، ويجب اعتبار تلك التي تقل عن 35 فقط مؤشرا إيجابيا على إدخال البلازميد بنجاح.
  4. تقييم تعبير المشيمة IGF-1 الطبيعي لجين التدبير المنزلي 18s (الاشعال المدرجة في الجدول التكميلي 1). استخدم طريقة ddCT لحساب تغير الطي ، ثم احسب تغيير الطي الطبيعي للعينات التجريبية إلى متوسط تغيير الطي لعينات التحكم.

7. تحليل مستوى البروتين المشيمي

  1. استخدم ربع المشيمة المخزنة عند -80 درجة مئوية. تجانس الأنسجة في محلول عازل مصنوع من 11.5 mM Tris HCl و 5 mM MgCl 2 ومثبط الأنزيم البروتيني 10 mM في diH2O مع درجة حموضة نهائية تبلغ 7.4. استخدم الخالط المحمول والمدقة لتفتيت الأنسجة.
    ملاحظة: يجب ألا تتجاوز العينة 10٪ من حجم المخزن المؤقت.
  2. قم بتخفيف العينات المتجانسة في المخزن المؤقت عند 1:12 ، بحيث تكون ضمن النطاق الذي يمكن اكتشافه لمجموعة مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA). قم بإجراء مقايسة BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد البروتين الكلي باستخدام قارئ اللوحة.
  3. بعد إجراء مقايسة BCA ، قم بتطبيع جميع العينات إلى نفس تركيز البروتين الكلي البالغ 2 مجم / مل ل IGF-1 ELISA ، كما حدث في Gumusoglu et al.29.
  4. قم بإجراء IGF-1 ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وحدد مستويات بروتين IGF-1 باستخدام قارئ لوحة باستخدام منحنى تركيز قياسي.

8. التحقق المكاني من CRIPSR باستخدام وسم التهجين الفلوري في الموقع

  1. بعد تثبيت نصفي المشيمة بشكل مناسب في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية لمدة 1-3 أيام ، انقلها إلى 20٪ سكروز عند 4 درجات مئوية قبل تجميدها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT).
  2. تقسم المشيمة المدمجة في OCT إلى نصفين في كريوستات -20 درجة مئوية إلى أقسام 10 ميكرومتر ، وتضعها على شرائح ليتم تصنيفها. قسم المشيمة إلى نصفين بحيث تكون المناطق الفرعية الثلاث مرئية. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها للتهجين في الموقع .
  3. قم بإجراء وضع العلامات على التهجين الفلوري في الموقع (FISH) باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة. قم بتهجين شريحة واحدة باستخدام مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وشريحة "شقيقة" ثانية من نفس المشيمة باستخدام مسبار Prl8a8.
    ملاحظة: يكتشف مسبار dCas9-3xNLS-VP64 وجود بلازميد التعبير المفرط. يسلط مسبار Prl8a8 الضوء على الأرومات الإسفنجية في منطقة الوصلة ، مما يسمح بتحديد المناطق الفرعية للمشيمة. يتم تمييز هذين المجسين على شرائح "شقيقة" منفصلة لتجنب تداخل التألق متعدد القنوات مع التألق الذاتي الأخضر في المشيمة.
  4. قم بتسمية كلا المجسين بصبغة الكشف (Opal 620). بعد الانتهاء من بروتوكول الشركة المصنعة ل FISH ، قم بتطبيق وسيط تركيب DAPI ، وضع غطاء على الشريحة. أغلق غطاء الغطاء بطلاء أظافر شفاف.
  5. قم بتصوير الشرائح على مجهر مضان مركب قائم ، وقم بمعالجتها باستخدام برنامج مناسب لمعالجة الصور. هنا ، تم استخدام برنامج CellSens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نتائج الإجراءات العامة (الشكل 6)
في الدراسة ، كانت هناك ثلاث مجموعات تم التلاعب بها. وشملت هذه المشيمة التي تم حقنها ببلازميد التحكم العام CRISPR Cas9 (Cas9 Control) ، أو بلازميد CRISPR للتحكم في التنشيط (التحكم في الفعل) ، أو بلازميد تنشيط IGF-1 SAM (Igf1-OE). يعتبر Cas9 Control أكثر ملاءمة للبلازميدات بالضربة القاضية ، والتحكم في التنشيط مناسب بشكل أفضل لبلازميدات التعبير الزائد / التنشيط. لتقييم التغيرات في الجدوى الناتجة عن التلاعب بالمشيمة عن طريق الحقن والتثقيب الكهربائي ، تم تحليل بقاء الجنين داخل القمامة على E14.5 (الشكل 6 أ). تم اختيار هذه النقطة الزمنية حيث أظهرت الدراسات الأخرى التي أجريت إدخال بلازميدات كريسبر في الجسم الحي باستخدام التثقيب الكهربائي أنه يمكن تحقيق تغييرات التعبير في غضون 8-22 ساعة30،31،32. يسمح الجمع في E14.5 لبلازميد كريسبر حوالي 48 ساعة بدمج وتنشيط زيادة في التعبير الجيني. وجد أن التلاعب الجراحي بالسد أثر على بقاء جميع الأجنة ، لكن الأجنة المرتبطة بالمشيمة التي تم التلاعب بها والتي خضعت للحقن والتثقيب الكهربائي قللت بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة. انخفض معدل بقاء الأجنة غير المعالجة (في نفس القمامة ولكن لا تخضع للتلاعب المستهدف) من 100٪ من البقاء على قيد الحياة إلى متوسط 79.05٪. كان هناك انخفاض كبير في بقاء الأجنة التي تم التلاعب بها ، بمتوسط معدل بقاء 55.56٪. لم يتم العثور على فرق كبير بين المجموعات الثلاث التي تم التلاعب بها.

لتحديد ما إذا كانت هناك تغييرات إجمالية كبيرة حدثت في المشيمة التي تم التلاعب بها ، تم تسجيل وزن المشيمة. لم يكن هناك فرق كبير في وزن المشيمة لأي مجموعة (الشكل 6 ب) ، ولم يتغير المظهر الإجمالي للمشيمة والجنين. تم التقاط صور تمثيلية لما بعد التنخر على مجهر تشريح عند التجميع على E14.5. تم التقاط صور للمشيمة / الأجنة من مجموعات علاجية مختلفة ، وكلها داخل نفس القمامة. لم يكن هناك أي ضرر ملحوظ أو تغيير في المظهر الظاهري في أي مجموعات علاجية سواء في الكيس الأمنيوسي أو الجنين المكشوف والمشيمة المقابلة له (الشكل 6D-I). في حين لم يلاحظ أي اختلافات جسيمة في مورفولوجيا المجموعات التي تم التلاعب بها باستخدام بلازميد تنشيط IGF-1 ، فقد لا يكون هذا صحيحا بالنسبة للبلازميدات التجريبية الأخرى التي تستهدف جينات أخرى قد تؤثر بشكل كبير على النمو الأساسي ومنظمات وظيفة المشيمة أو الجنين. لم يتم العثور على فروق في أي مقياس بين المشيمة Cas9 Control و Act Control. لذلك ، تم دمج هاتين المجموعتين ويشار إليهما باسم Con أو Controls لجميع التحليلات. توضح هذه النتائج أن التلاعب بالمشيمة في الرحم على E12.5 باستخدام هذه التقنية يؤدي إلى انخفاض في بقاء الجنين ، ولكن لا يزال هناك قابلية كبيرة للحياة. تظهر النتائج أيضا أن نمو المشيمة بشكل عام لا يتأثر بشكل كبير ، حيث لم يكن هناك تغيير كبير في الوزن بين المشيمة التي تم التلاعب بها وغير المعالجة. وهذا يدل على أن التقنية المقترحة يمكن أن تسمح ببقاء المشيمة الصحية والقابلة للحياة التي تتلاعب بها كريسبر والأجنة المقابلة لها.

تم تسجيل تغير وزن السد كل يوم بعد الجراحة قبل جمع الأجنة على E14.5 (الشكل 6C). أجريت الجراحة على E12.5 ، لذلك يتم سرد جميع تغييرات وزن السد بالنسبة للوزن على E12.5. خضعت السدود التجريبية (Exp) للتلاعب بالمشيمة، في حين خضعت السدود الوهمية للتخدير وبضع البطن لمدة مماثلة دون أي تلاعب بالمشيمة. أظهرت العديد من السدود الحوامل انخفاضا طفيفا أو لم يتغير في الوزن في اليوم التالي للإجراء (E13.5) ؛ كان هذا على الأرجح بسبب تعطل تناول الطعام أثناء الجراحة وبعدها لفترة وجيزة. أظهرت معظم السدود زيادة في الوزن على E14.5 ، ولكن في بعض الأحيان ، كان لا يزال يلاحظ انخفاض في الوزن. سمح تتبع وزن سد الأم بعد الجراحة بمراقبة بقاء الجنين. كان الاختلاف بين وزن السدود الحامل بعد الجراحة شائعا ولم يشر إلى فقدان جميع الأجنة المعالجة. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في تغيرات الوزن بعد الجراحة في السدود الوهمية مقابل السدود التجريبية. هذا يدل على أنه تم الحفاظ على رفاهية السد بشكل عام بعد إدخال بلازميدات كريسبر في المشيمة. بشكل عام ، هذا يدل على أنه في حين أن هذه التقنية الجراحية يمكن أن تسبب انخفاضا في صلاحية الأجنة ، إلا أنها لا تزال تنتج نسبة كبيرة من النسل الصحي الذي يمكن استخدامه للدراسة.

تحليل التعبير ودمج كريسبر في المشيمة E14.5 (الشكل 7)
لتحديد ما إذا كان الإدخال الخلوي لبلازميد تنشيط IGF-1 ناجحا في الإفراط في التعبير عن IGF-1 ، تم إجراء qPCR. كما هو متوقع ، أظهر qPCR زيادة كبيرة في تعبير IGF-1 في المشيمة IGF1-OE مقابل المشيمة الضابطة عندما تم تطبيع تغيير الطي إلى تعبير 18s (اختبار Welch t ، p = 0.0302) (الشكل 7A). لتحديد ما إذا تم تغيير مستويات بروتين IGF-1 ، تم إجراء ELISA على المشيمة من جميع المجموعات. تمشيا مع qPCR ، أظهر تقييم ELISA للمشيمة E14.5 زيادة كبيرة في مستويات بروتين IGF-1 في مشيمة IGF1-OE مقابل المشيمة الضابطة (اختبار Welch's t ، p = 0.0469) (الشكل 7B). أظهر qPCR و ELISA أن البلازميد المفرط في التعبير نجح في زيادة التعبير الجيني IGF-1 وإنتاج بروتين IGF-1 ، على التوالي.

للتأكد من أن توصيل البلازميد كان خاصا بالمشيمة التي تم التلاعب بها ، تم إجراء qPCR لبلازميد تنشيط IGF-1 المحدد وبلازميد التحكم CRISPR Cas9. تم إجراء qPCRs على كل من المشيمة التي تم التلاعب بها والمشيمة غير المعالجة المجاورة لتلك التي تم حقنها. استهدفت بادئات qPCR المستخدمة لتقييم تعبير بلازميد التنشيط سلسلة من بلازميد BLAST ، وهو جزء من نظام التنشيط (الشكل 7C). لم تظهر المشيمة غير المعالجة أي وجود لبلازميد BLAST (عتبة الدورة [CT] غير محددة ، المسمى 40 على الرسم البياني) ، وأظهرت مشيمة Igf1-OE التصوير المقطعي المحوسب حوالي 30. استهدف qPCR الذي تم إجراؤه لتقييم تعبير البلازميد الضابط تسلسلا من جين GFP المدرج (الشكل 7D). أظهرت المشيمة غير المعالجة قيم CT أكثر من 35 ، على الأرجح بسبب dimerization التمهيدي ، لأن هذه القيم خارج نطاق التعبير المتوقع. أظهرت عناصر التحكم قيمة CT تبلغ حوالي 30. تعمل qPCRs هذه كفحص للجودة لإثبات الإفراط المتوقع في التعبير عن IGF-1 أو عدم وجوده وأن البلازميدات موجودة فقط في المشيمة التي تم التلاعب بها المتوقعة.

تم إجراء التحقق المكاني من بلازميد تنشيط IGF-1 باستخدام أقسام المشيمة. تم تقسيم المشيمة التي تم تثبيتها وتجميدها في مركب OCT بشكل متسلسل عند 10 ميكرومتر على شرائح بحيث تكون جميع الطبقات مرئية. ثم تم تجميد الشرائح عند -80 درجة مئوية حتى استخدامها لوضع العلامات على FISH. للتحقق من مكان دمج بلازميد تنشيط IGF-1 CRISPR داخل المشيمة ، تم استخدام مسبار dCas9-3xNLS-VP64 مع وضع علامات الفلورسنت الحمراء. يستهدف هذا المسبار مكونا وظيفيا لنظام التنشيط. تم استخدام التألق الذاتي الأخضر لإظهار المناطق الفرعية للواجهة المشيمية بين الأم والجنين (الشكل 7E ، F). لم يتم الكشف عن dCas9-3xNLS-VP64 في المشيمة غير المعالجة ، حيث لم يتم علاجها بمعالجة كريسبر (الشكل 7E). كما هو متوقع ، عرضت المشيمة IGF1-OE وضع العلامات على dCas9-3xNLS-VP64 ، كما هو موضح باللون الأحمر (الشكل 7F). تم العثور على دمج كريسبر في جميع المناطق الفرعية الثلاث للمشيمة، مع أوضح وضع العلامات على منطقة الوصلة (الشكل 7E). تباينت شدة التألق لوسم dCas9-3xNLS-VP64 عبر المشيمة المعالجة بالبلازميد ، مما يشير إلى أن البعض عبر عن البلازميد بدرجة أعلى من البعض الآخر ، وكانت هناك اختلافات في الموقع / المدى الدقيق للوسم ، لكن الوسم كان موجودا بشكل عام في جميع المناطق الفرعية. لتأكيد موقع وضع العلامات dCas9-3xNLS-VP64 ، تم إجراء وسم Prl8a8 FISH الذي يستهدف الأرومات الإسفنجية لتسمية المنطقة الفرعية الموصلة الوسطى (الشكل 7G ، H). تم إجراء ذلك في أقسام متجاورة من نفس المشيمة على شريحة "شقيقة" من الأقسام التي تم تصنيفها ل dCas9-3xNLS-VP64. كما هو متوقع ، كان الهيكل المشار إليه بواسطة وضع العلامات Prl8a8 مشابها بين IGF1-OE والمشيمة غير المعالجة. يمكن تحديد منطقة النفضيات والمتاهة من خلال تسمية النوى الزرقاء (DAPI) المحيطة بمنطقة الوصلات الحمراء (الشكل 7G ، H). أوضح وضع العلامات FISH ل dCas9-3xNLS-VP64 أن البلازميد تم إدخاله في جميع المناطق الفرعية الثلاث ، وتم تأكيد ذلك باستخدام وسم Prl8a8. أكدت نتائج وضع العلامات FISH أن دمج بلازميد تنشيط IGF-1 كان ناجحا ، ولم يهاجر البلازميد إلى المشيمة غير المعالجة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي للبروتوكول. (أ) رسم تخطيطي مبسط للإجراء الجراحي. الترتيب الزمني للخطوات الرئيسية للتقنية. ب: رسم تخطيطي يوضح مثالا على تباعد المشيمة المتلاعب به داخل قرني الرحم. تم إنشاء كلتا اللوحتين باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إجراء فتح البطن الرحمي. (أ-ب) أثناء التحضير للجراحة، أ: بطن السد المحلوق، ب: المنطقة المحلوقة المغلفة بمحلول اليود. (سي إف) في منطقة الجراحة ، (ج) شق ~ 2 سم في جلد البطن ، و (د) شق ~ 2 سم في الصفاق ؛ الأمعاء مرئية. ه: التلاعب بقرون الرحم من خلال موقع الشق. قرون الرحم مرئية. (و) قرون الرحم المكشوفة تماما الموضوعة على ستارة جراحية معقمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: حقن بلازميدات كريسبر في المشيمة E12.5 . (أ، ب) توجيه الأجنة والمشيمة داخل قرني الرحم. أ: منظر مائل لقرن الرحم المسمى يظهر النبيديا، ومناطق الجنين، وجنينا. يمثل الخط المتقطع المكان الذي يجب أن يكون فيه موقع الحقن. ب: قرن رحم غير مسمى من اللوحة (أ). (ج، د) منظر جانبي للماصة الدقيقة التي يتم إدخالها في موقع الحقن في المشيمة. D هو decidua ، FZ هو مناطق الجنين ، E هو الجنين ، والخط المتقطع يمثل موقع موقع الحقن. (د) صورة غير موسومة لإدخال الماصة الدقيقة من اللوحة C. (ه، و) منظر جانبي للصبغة في المشيمة بعد الحقن. ه: صورة مميزة لقرن رحم يعرض مشيمة تم حقنها ببلازميد CRIPSR يحتوي على صبغة مرئية ومشيمة لم يتم حقنها. (F) صورة غير موسومة لقرن الرحم في اللوحة E. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التثقيب الكهربي للمشيمة E12.5 بعد حقن بلازميدات كريسبر. أ: منظر علوي للمشيمة في قرن الرحم. يتم تمييز مجاذيف التثقيب الكهربائي للأنود والكاثود ، ويشير السهم الأبيض إلى موقع موقع الحقن. ب: منظر مائل للتثقيب الكهربي للمشيمة. ج: منظر جانبي للتثقيب الكهربي للمشيمة. (مد-واو) مخطط مبسط للألواح A و B و C. يشار إلى مجاذيف الأنود والكاثود ، P هي المشيمة ، E هي الجنين ، والمنطقة غير المسماة هي الرحم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: خياطة جلد البطن والصفاق. أ: عادت قرون الرحم إلى البطن بعد الانتهاء من الجراحة. يمكن رؤية شقوق الجلد البطني والبريتوني. (ب) شق الصفاق مخيط بالكامل. ج: شق جلد البطن مخيط بالكامل. د: وضع لاصق الأنسجة على خيوط الجلد البطنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: نتائج الإجراء العام. (أ) معدلات بقاء الجنين بعد الجراحة التي تم جمعها في E14.5 ، يومين بعد الإجراء. لوحظ انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة في المجموعات التي تم التلاعب بها مقابل الأجنة غير المعالجة (اختبار Mann-Whitney U: غير المعالج مقابل Cas9 Control, p = 0.0077; غير المعالجة مقابل التحكم في القانون ، p = 0.0330 ؛ وغير المعالجة مقابل IGF1-OE ، p = 0.0032). لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في بقاء المجموعات التي تم التلاعب بها (ANOVA أحادي الاتجاه ، p = 0.9454). تمثل كل نقطة النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة من فضلات واحدة (غير المعالجة n = 22 ، Cas9 Control n = 9 ، Act Control n = 13 ، و IGF1-OE n = 22 لتر). (ب) وزن المشيمة للأجنة الباقية على قيد الحياة على E14.5 (ANOVA أحادي الاتجاه ، p = 0.1436) (غير معالج n = 138 ، Cas9 Control n = 15 ، Act Control n = 20 ، و IGF1-OE n = 36 مشيمة). (ج) يتغير وزن السد بعد الجراحة على E13.5 و E14.5 الذي يظهر في السدود التي خضعت لإجراء فتح البطن الوهمي أو خضعت لمعالجة مشيمية تجريبية (Exp). لم يلاحظ فرق كبير بين مجموعتي تغيرات وزن السدود بعد الجراحة (اختبارات t غير المقترنة: E13.5 p = 0.5452 و E14.5 p = 0.2493) (سدود الشام n = 3 وسدود Exp n = 10). تمثل جميع أشرطة الخطأ SEM. (D-F) صور أجنة E14.5 بعد التنظير في الكيس الأمنيوسي مع استمرار المشيمة متصلة. (F) يمثل شريط المقياس في أقصى اليمين 3.75 مم. (G-I) صورة مائلة للجنين والمنظر العلوي للمشيمة المقابلة. (I) يمثل شريط المقياس في الزاوية اليمنى القصوى 3.75 مم. (D-I) يتم سرد جميع ملصقات مجموعة العلاج أسفل الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحليل التعبير ودمج كريسبر في المشيمة E14.5. (أ) تحليل qPCR لتعبير IGF-1 في التحكم E14.5 ومشيمة IGF1-OE. لوحظت زيادة كبيرة في تعبير IGF-1 الطبيعي إلى تعبير 18s في المشيمة IGF1-OE (اختبار Welch's t ، p = 0.0302) (Control n = 15 و IGF1-OE n = 20 مشيمة). (ب) ELISA لمستويات بروتين IGF-1 في التحكم E14.5 ومشيمة IGF1-OE. لوحظت زيادة كبيرة في مستويات IGF-1 في مشيمة IGF1-OE مقارنة بمستويات التحكم (اختبار Welch's t ، p = 0.0469) (التحكم n = 13 و IGF1-OE n = 15 المشيمة.) (ج) تحليل qPCR لتسلسل الانفجار من بلازميد IGF-1 SAM. تم العثور على تعبير BLAST في المشيمة IGF1-OE فقط ، وتم العثور على تعبير غير محدد / غير محدد في المشيمة غير المعالجة (غير المعالجة n = 4 و IGF1-OE n = 9 المشيمة). (د) تحليل qPCR لتسلسل GFP من بلازميد التحكم CRISPR Cas9. تم العثور على تعبير البلازميد في المشيمة الضابطة ، وتم العثور على قيم CT أكثر من 35 / نتائج إيجابية كاذبة في العينات غير المعالجة (غير المعالجة n = 4 والسيطرة = 5 المشيمة). يمثل الخط المتقطع العتبة الموجبة الكاذبة عند 35 CT. كل نقطة بيانات من مشيمة واحدة. تمثل جميع أشرطة الخطأ SEM. (E-H) مضان في الموقع تهجين أقسام المشيمة E14.5 بسمك 10 ميكرومتر. (ه) أقسام المشيمة غير المعالجة و (F) IGF1-OE مع مسبار dCas9-3xNLS-VP64 المسمى باللون الأحمر. الإشارة الحمراء موجودة فقط في المشيمة IGF1-OE. الإشارة الخضراء هي التألق الذاتي المستخدم للمساعدة في تحديد المناطق الفرعية للمشيمة. (G) أقسام المشيمة غير المعالجة و (H) IGF1-OE مع مسبار Prl8a8 المسمى باللون الأحمر لتحديد الأرومات الإسفنجية في منطقة الوصلة الوسطى. يظهر DAPI باللون الأزرق مناطق decidua والمتاهة التي تحيط بمنطقة الوصلة هذه. (H) يمثل شريط المقياس في أقصى اليمين 2 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: البادئات المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المشيمة هي المنظم الأساسي لنمو الجنين ، وكما لوحظ سابقا ، فإن التغيرات في التعبير الجيني للمشيمة أو وظيفتها قد تؤثر بشكل كبير على نمو الجنين6. يمكن استخدام البروتوكول الموضح هنا لإجراء معالجة مستهدفة في الجسم الحي بتقنية كريسبر لمشيمة الفأر باستخدام نهج جراحي متقدم نسبيا. تسمح هذه التقنية بإنتاجية كبيرة من الأجنة القابلة للحياة والمشيمة المقابلة لها والتي يمكن استخدامها لمزيد من الدراسة (الشكل 6 أ ، ب). سمحت لنا هذه التقنية بالإفراط في التعبير عن المشيمة IGF-1 بنجاح على E14.5 (الشكل 7 أ ، ب). أظهرت البلازميدات المستخدمة خصوصية ، حيث بقيت البلازميدات المدرجة في المشيمة التي تم التلاعب بها ولم تكن موجودة في المشيمة المجاورة غير المعالجة (الشكل 7C ، D). تم تأكيد التوزيع المكاني لبلازميد تنشيط IGF-1 بواسطة FISH ل dCas9-3xNLS-VP64 و Prl8a8 ، مما أظهر أن بلازميد التنشيط كان موجودا في المناطق الفرعية الثلاث لمشيمة IGF1-OE وليس في أي مناطق فرعية من المشيمة غير المعالجة (الشكل 7E-H). يمكن استخدام هذه التقنية لتغيير التعبير الجيني المشيمي بطرق قد لا تكون ممكنة مع التقنيات السابقة. سيسمح استخدام هذه التقنية بفهم أكبر لتأثير التعبير الجيني المشيمي ووظيفته على نمو الجنين في سياقات متعددة.

لتحسين نجاح هذا الإجراء لنتائج الأم والجنين ، تم استكشاف آثار تغيير المعلمات المتعددة ، بما في ذلك إعدادات الحقن والتثقيب الكهربائي ، وكذلك المواد المستخدمة. لزيادة بقاء السد والتعافي ، وجد أن الوقت تحت التخدير يجب ألا يتجاوز 1 ساعة ، لأن فترات الجراحة الأطول قللت بشكل كبير من البقاء على قيد الحياة. إذا وصل الوقت تحت التخدير إلى حوالي 2 ساعة ، فإن احتمال البقاء على قيد الحياة ينخفض بشكل كبير إلى مستويات أقل من 20 ٪ ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الآثار السلبية للوقت الطويل تحت الأيزوفلوران. بخلاف الوقت تحت التخدير ، كانت المضاعفات الأكثر شيوعا للجراحة التي أدت إلى وفاة الأم هي الفشل في خيمة الصفاق بشكل صحيح أثناء إجراء شقوق الجلد والبريتوني. إذا لم يتم خيمة الصفاق بشكل صحيح ، فقد تصاب الأمعاء ، مما قد يتسبب في الوفاة في الأيام التالية للجراحة. يؤثر الوقت الذي يتعرض فيه الرحم أيضا على بقاء السد والأجنة. كان متوسط الوقت الذي تعرض فيه الرحم في التجارب الناجحة حوالي 15 دقيقة. أكثر من 30 دقيقة من التعرض يمكن أن يؤدي إلى زيادة ارتشاف وأمراض الأم المحتملة. يجب أن يبقى الرحم المكشوف وأي أعضاء أخرى مكشوفة (غالبا الأمعاء) رطبة ، ولكن الكثير من المياه المالحة يمكن أن يبرد الحيوان ؛ عند ترطيب الأعضاء المكشوفة بشكل دوري ، يجب استخدام أقل من 1 مل من المياه المالحة المعقمة.

أثرت معلمات الحقن والتثقيب الكهربائي بشكل كبير على بقاء الجنين. يجب ألا يتجاوز حجم الحقن حوالي 4.5 ميكرولتر ، حيث أدى ذلك إلى ارتشاف. وقت الحقن والضغط مهمان لتحقيق أقصى قدر من البقاء على قيد الحياة. يجب ضبط وقت الحقن بين 0.5 ثانية و 1.5 ثانية ، على الرغم من أن 0.8 ثانية تبدو مثالية. يجب ضبط الضغط بين 1-8.5 رطل / بوصة مربعة. شوهدت معدلات بقاء الجنين منخفضة مع أوقات حقن منخفضة ومستويات حقن PSI عالية. ولوحظ أيضا أنه إذا كانت الماصة الدقيقة حادة للغاية ، فقد يكون هناك انخفاض في صلاحية الجنين ، وغالبا ما يتسرب المحلول أيضا من الماصة الدقيقة. يمكن أن يؤثر نوع الصبغة المستخدمة لتصور الحقن على البقاء على قيد الحياة. أدى الميثيلين الأزرق إلى وفاة الأمهات عند استخدامه لهذا الغرض ، لكن محلول صبغة Fast Green المصفى لم يظهر أي آثار سلبية على صحة الأم. تم تحسين إعدادات التثقيب الكهربائي من إعدادات الشركة المصنعة الموصى بها بناء على دراسات التثقيب الكهربائي السابقة في vivo33. تم العثور على التثقيب الكهربائي ليكون التلاعب الذي تسبب في أكبر قدر من الضرر وانخفاض بقاء الجنين. تقترح إعدادات التثقيب الكهربائي للجنين الموصى بها في الجسم الحي أربع نبضات لزيادة كفاءة كريسبر إلى أقصى حد ، ولكن يوصى بنبضتين لمعدل بقاء أعلى33. وقد وجد أن أربع نبضات تسببت في امتصاص جميع الأجنة تقريبا. سمحت نبضتان بزيادة الجدوى مع الحفاظ على كفاءة كريسبر. أثر حجم مجداف التثقيب الكهربائي بشكل كبير على بقاء الجنين أيضا. وقد وجد أن مجاذيف التثقيب الكهربائي 5 مم أدت إلى ارتشاف كامل تقريبا عند استخدامها مع الإعدادات الموصى بها. في الواقع ، يوصى باستخدام مجاذيف التثقيب الكهربائي 3 مم في دليل الشركة المصنعة وتزيد بشكل كبير من صلاحية الجنين33. من المهم أيضا ملاحظة أن العديد من مجاذيف التثقيب الكهربائي لها عمر نبضي معين. بعد استخدامها إلى هذا الحد الأقصى ، يمكن ملاحظة انخفاض في الجودة. يمكن تحديد ذلك إذا لم يكن هناك تكوين لرغوة بيضاء صغيرة بين المجاذيف والمشيمة أثناء النبض. يمكن فحص جهد مجداف التثقيب الكهربائي باستخدام الفولتميتر لتحديد ما إذا كان ينتج الجهد المتوقع.

هذه الدراسة محدودة من نواح قليلة. هذه التقنية محددة زمنيا ومن المحتمل أن يكون أفضل أداء لها في موعد لا يتجاوز E10.5 وفي موعد لا يتجاوز E16.5. ويرجع ذلك إلى أن المشيمة صغيرة جدا قبل E10.5 ، وبعد E16.5 ، قد لا يكون لدى البلازميد الوقت الكافي لإنتاج التأثير المطلوب. هذا الإطار الزمني يعني أن هذه التقنية مناسبة بشكل أفضل لأنواع معينة من الدراسات على الفئران. هذه التقنية مفيدة لدراسة النمو العصبي ، حيث يقع E12.5 في وقت حاسم من تكوين الخلايا العصبية للعديد من الهياكل داخل الدماغ34. قد لا تكون هذه التقنية مفيدة لدراسة تأثيرات المشيمة على المراحل المبكرة من التطور ، مثل تكوين الصفيحة العصبية ، والتي تحدث على E8.535. نتائج بلازميد كريسبر بالضربة القاضية غير معروفة في هذا الوقت. يحتاج تطبيق هذه الطريقة على تقليل التعبير الجيني إلى مزيد من التحقيق حيث تم إثبات الإفراط في التعبير / تنشيط الجين فقط. على الرغم من ذلك ، من المتوقع أن تكون هذه التقنية ناجحة أيضا في إدخال بلازميد كريسبر بالضربة القاضية.

يمكن أن تسمح هذه التقنية أيضا بإمكانية إجراء مزرعة أولية لأنسجة المشيمة المعدلة وراثيا36. اعتمادا على نوع كريسبر المستخدم ، مثل كريسبري وكريسبر ، يمكن استخدام ثقافة أولية لإجراء دراسة إنقاذ37,38. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لمزيد من استكشاف الروابط بين التشوهات الوراثية والوظيفية المشيمة ومشاكل النسل. على وجه التحديد ، وجدت دراسة سابقة وجود علاقة كبيرة بين درجات المخاطر الجينومية الخاصة بالمشيمة ومخاطر الفصام39. حددت هذه الدراسة العديد من جينات المشيمة التي قد تلعب دورا في تطور مرض انفصام الشخصية والتي لم يتم استكشافها في النماذج الحيوانية. هذه التقنية تفسح المجال لمزيد من الدراسات من هذا النوع وغيره.

يمكن ترجمة المعرفة المكتسبة من تعديل كريسبر للمشيمة إلى مجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية المختلفة. يمكن استخدام الدراسات التي تحدد كيف يمكن أن يؤثر التعبير الجيني المحدد في المشيمة على نمو الجنين لإنشاء تدخلات دوائية تستهدف المشيمة يمكنها علاج هذه التشوهات. يمكن أن تكون العلاجات التي تستهدف الجنين مباشرة صعبة وخطيرة40,41. المشيمة هي هدف يسهل الوصول إليه للعلاج. في حالة وجود مشاكل في النمو في القلب أو الدماغ والتي قد تكون قابلة للتعديل قبل الولادة ، فإن التلاعب المباشر بالقلب أو الدماغ يكون عالي الخطورة. يمكن تجنب مثل هذا الخطر من خلال تدخل المشيمة ، وهو أمر أكثر منطقية ويمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات وقائية لاضطرابات النمو العصبي التي قد تكون البيئة الجزيئية ، التي توفرها المشيمة جزئيا ، حرجة5. يمكن استخدام هذه التقنية أيضا لعلاج أمراض مثل أمراض القلب الخلقية ، والتي تم ربطها باضطرابات المشيمة9. نظرا لأن أمراض القلب الخلقية هي عيب خلقي شائع ، فإن إمكانية علاج تدخل المشيمة يمكن أن يكون لها تأثير كبير8. نظرا لأن المشيمة لها العديد من الوظائف ، يمكن استخدام هذه التقنية لتعزيز تطوير التدخلات لأمراض متعددة. بشكل عام ، يمكن استخدام هذه التقنية المستهدفة للمشيمة لتعزيز فهم تأثير علم الوراثة المشيمية ووظيفتها على مجالات متعددة من نمو الجنين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بمصادر التمويل التالية: R01 MH122435 و NIH T32GM008629 و NIH T32GM145441. يشكر المؤلفون مختبرات الدكتور فال شيفيلد والدكتور كالفن كارتر في جامعة أيوا على استخدام غرفة الجراحة والمعدات الخاصة بهم ، وكذلك الدكتور إريك فان أوترلو والدكتور نانداكومار نارايانان والدكتور ماثيو ويبر لمساعدتهم في الفحص المجهري. كما يشكر المؤلفون الدكتورة سارة ماورير ومايا إيفانز وسريليخا كوندو على مساعدتهم في العمليات الجراحية التجريبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD - Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 - 44 - 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/?
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24x60 Leica 3800160
Syringes BD - Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Tags

علم الوراثة ، العدد 194 ، المشيمة ، الفأر ، كريسبر ، عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 ، التثقيب الكهربائي ، الإفراط في التعبير ، التطور
الماوس <em>في الجسم الحي</em> المشيمة المستهدفة كريسبر التلاعب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carver, A. J., Taylor, R. J.,… More

Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter