Summary
Nous décrivons ici une méthode spécifique au temps pour manipuler efficacement les voies de développement critiques dans le placenta de la souris in vivo. Ceci est réalisé par injection et électroporation de plasmides CRISPR dans les placentas des mères gravides au jour embryonnaire 12.5.
Abstract
Le placenta est un organe essentiel qui régule et maintient le développement des mammifères in utero. Le placenta est responsable du transfert des nutriments et des déchets entre la mère et le fœtus et de la production et de l’administration des facteurs de croissance et des hormones. Les manipulations génétiques placentaires chez la souris sont essentielles pour comprendre le rôle spécifique du placenta dans le développement prénatal. Les souris transgéniques exprimant Cre spécifiques au placental ont une efficacité variable, et d’autres méthodes de manipulation du gène placentaire peuvent être des alternatives utiles. Cet article décrit une technique pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation du gène CRISPR, qui peut être utilisée pour modifier l’expression des gènes ciblés. En utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, les mères enceintes subissent une laparotomie au jour embryonnaire 12.5 (E12.5), et un plasmide CRISPR est délivré par une micropipette en verre dans les placentas individuels. Le plasmide est immédiatement électroporé après chaque injection. Après la récupération de la mère, les placentas et les embryons peuvent continuer à se développer jusqu’à une évaluation ultérieure. L’évaluation du placenta et de la progéniture après l’utilisation de cette technique peut déterminer le rôle de la fonction placentaire spécifique au temps dans le développement. Ce type de manipulation permettra de mieux comprendre l’impact de la génétique et de la fonction placentaires sur la croissance et le développement du fœtus dans de multiples contextes de maladies.
Introduction
Le placenta est un organe essentiel impliqué dans le développement du fœtus. Le rôle principal du placenta est de fournir des facteurs essentiels et de réguler le transfert des nutriments et des déchets vers et depuis le fœtus. Les placentas des mammifères sont composés à la fois de tissus fœtaux et maternels, qui constituent l’interface fœtale-maternelle et, par conséquent, la génétique de la mère et du fœtus a un impact sur la fonction1. Des anomalies génétiques ou une altération de la fonction du placenta peuvent modifier considérablement le développement du fœtus. Des travaux antérieurs ont montré que la génétique placentaire et le développement sont associés au développement altéré de systèmes d’organes spécifiques chez le fœtus. En particulier, les anomalies du placenta sont liées à des changements dans le cerveau, le cœur et le système vasculairedu fœtus 2,3,4,5.
Le transport des hormones, des facteurs de croissance et d’autres molécules du placenta au fœtus joue un rôle majeur dans le développement du fœtus6. Il a été démontré que la modification de la production placentaire de molécules spécifiques peut altérer le développement neurologique. L’inflammation maternelle peut augmenter la production de sérotonine en modifiant l’expression métabolique du gène du tryptophane (TRP) dans le placenta, ce qui crée par la suite une accumulation de sérotonine dans le cerveau du fœtus7. D’autres études ont trouvé des anomalies placentaires ainsi que des malformations cardiaques. On pense que les anomalies du placenta contribuent aux malformations cardiaques congénitales, l’anomalie congénitale la plus fréquente chez l’homme8. Une étude récente a identifié plusieurs gènes qui ont des voies cellulaires similaires dans le placenta et le cœur. Si elles sont perturbées, ces voies pourraient causer des défauts dans les deux organes9. Les défauts du placenta peuvent exacerber les malformations cardiaques congénitales. Le rôle de la génétique placentaire et de sa fonction sur le développement d’organes fœtaux spécifiques est un domaine d’étude émergent.
Les souris ont des placentas hémochoraux et d’autres caractéristiques des placentas humains, ce qui en fait des modèles très utiles pour étudier les maladies humaines1. Malgré l’importance du placenta, il y a actuellement un manque de manipulations génétiques in vivo ciblées. En outre, il existe actuellement plus d’options disponibles pour les knockouts ou knockdowns que les manipulations de surexpression ou de gain de fonction dans le placenta10. Il existe plusieurs lignées transgéniques exprimant Cre pour la manipulation spécifique du placentaire, chacune dans différentes lignées trophoblastiques à différents moments de temps. Il s’agit notamment du Cyp19-Cre, de l’Ada/Tpbpa-Cre, du PDGFRα-Creer et du Gcm1-Cre11,12,13,14. Bien que ces transgènes Cre soient efficaces, ils peuvent ne pas être capables de manipuler certains gènes à des moments spécifiques. Une autre méthode couramment utilisée pour éliminer ou surexprimer l’expression des gènes placentaires est l’insertion de vecteurs lentiviraux dans la culture de blastocystes, ce qui provoque une manipulation génétique spécifique au trophoblaste15,16. Cette technique permet un changement robuste dans l’expression du gène placentaire au début du développement. L’utilisation de l’interférence ARN in vivo a été peu utilisée dans le placenta. L’insertion de plasmides shRNA peut être réalisée de manière similaire à la technique CRIPSR décrite dans cet article. Cela a été fait à E13.5 pour diminuer avec succès l’expression de PlGF dans le placenta, avec des impacts sur le système vasculaire cérébral de la progéniture17.
En plus des techniques qui sont principalement utilisées pour knockout ou knockdown, induire une surexpression est couramment réalisée avec des adénovirus ou l’insertion d’une protéine exogène. Les techniques utilisées pour la surexpression ont des taux de réussite variables et ont pour la plupart été effectuées plus tard dans la gestation. Pour étudier le rôle du facteur de croissance analogue à l’insuline 1 (IGF-1) dans la fonction placentaire, un transfert de gène placentaire médié par l’adénovira a été effectué pour induire la surexpression du gène IGF-1 18,19. Cela a été réalisé tard dans la gestation de la souris sur E18.5 par injection placentaire directe. Pour fournir des options supplémentaires et contourner les échecs possibles des manipulations génétiques placentaires établies, telles que les échecs de la combinaison Cre-Lox, la toxicité possible des adénovirus et les effets hors cible de shRNA, la manipulation directe CRISPR in vivo du placenta peut être utilisée20,21,22. Ce modèle a été développé pour remédier au manque de modèles de surexpression et pour créer un modèle flexible.
Cette technique est basée sur les travaux de Lecuyer et al., dans lesquels les plasmides shRNA et CRISPR ont été ciblés directement in vivo sur les placentas de souris pour modifier l’expression de PlGF 17. Cette technique peut être utilisée pour modifier directement l’expression des gènes placentaires en utilisant la manipulation CRISPR à plusieurs points temporels; pour ce travail, E12.5 a été sélectionné. Le placenta a mûri à ce stade et est assez grand pour être manipulé, ce qui permet l’insertion d’un plasmide CRISPR spécifique sur E12.5, ce qui peut avoir un impact significatif sur le développement du fœtus du milieu à la fin de la grossesse23,24. Contrairement aux approches transgéniques, mais similaires aux inductions virales ou aux interférences ARN, cette technique permet une surexpression ou un knockout à des moments particuliers en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée, évitant ainsi une éventuelle altération de la placentation ou de la létalité embryonnaire due à des changements antérieurs. Comme seuls quelques placentas reçoivent le plasmide expérimental ou témoin dans une portée, l’approche permet deux types de contrôles internes. Ces témoins sont ceux qui sont injectés et électroporés avec le plasmide de contrôle approprié et ceux qui ne reçoivent aucune manipulation directe. Cette technique a été optimisée pour créer une surexpression du gène IGF-1 dans le placenta de souris via un plasmide CRISPR médiateur d’activation synergique (SAM). Le gène IGF-1 a été choisi, car l’IGF-1 est une hormone de croissance essentielle délivrée au fœtus qui est principalement produite dans le placenta avant la naissance25,26. Cette nouvelle technique CRISPR ciblant le placental permettra une manipulation directe pour aider à définir le lien entre la fonction placentaire et le développement fœtal.
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Protocol
Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux règlements fédéraux et à la politique de l’Université de l’Iowa et ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux.
1. Animaux et élevage
- Gardez les animaux dans un cycle de lumière du jour de 12 h avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.
- Utilisez des souris femelles CD-1 âgées de 8 à 15 semaines. Utilisez la présence d’un bouchon copulatoire pour identifier E0.5.
- Sur E0.5, logez seules les mères enceintes.
2. Étalonnage de la micropipette
REMARQUE: L’étalonnage de la micropipette doit être effectué avant la chirurgie lorsque cela est possible.
- Avant de fabriquer et d’étalonner la micropipette, diluer tous les plasmides à la concentration recommandée (0,1 μg/μL) dans de l’eau sans DNase. Mélanger le plasmide avec un colorant vert rapide dilué de manière appropriée (1 μg/μL dans du PBS) (concentration plasmidique finale : 0,06 μg/μL).
- Tirer des micropipettes à l’aide de capillaires en verre de 10 cm d’un diamètre extérieur de 1,5 mm et d’un diamètre intérieur de 0,86 mm avec un extracteur de micropipettes.
- Casser délicatement l’extrémité d’une micropipette (2-3 mm) avec une pince stérile.
- Chargez la micropipette dans une pointe microcapillaire fixée à un microinjecteur. Assurez-vous que le micro-injecteur est fixé à la machine de micro-injection et qu’il y a suffisamment d’azote pour étalonner la micropipette.
- Une fois la micropipette fixée au micro-injecteur, chargez-la avec la solution de colorant Fast Green pour effectuer l’étalonnage (1 μg/μL dans PBS). Calibrer la micropipette pour injecter un volume d’environ 3,5 μL. Vider (« nettoyer ») la micropipette en vue du chargement des solutions plasmidiques comme ci-dessous.
REMARQUE: Chaque micropipette sera légèrement différente. Pour éviter d’endommager le placenta pendant l’injection, le temps d’injection doit être réglé entre 0,5 et 1,5 s. La pression doit être réglée entre 1-8,5 psi. Calibrer chaque micropipette séparément; Si la micropipette ne peut pas être étalonnée dans ces paramètres, elle ne doit pas être utilisée.
3. Chirurgie (figure 1A)
REMARQUE: Pour préparer, nettoyez les surfaces de la préparation et des zones chirurgicales avec de l’éthanol à 70%. Placez un sous-tampon absorbant dans la zone de préparation. Dans la zone de chirurgie, placez un coussin chauffant, puis placez un sous-coussin absorbant par-dessus. Stérilisez tous les outils avant la chirurgie. Le temps que la mère est sous anesthésie devrait être inférieure à 1 h.
- Anesthésiation
- Administrer 5 mg/kg d’AINS (méloxicam) ou un autre analgésique approuvé à la mère enceinte 30 min à 1 h avant la chirurgie.
- Placez la mère enceinte dans une chambre à induction fixée à un vaporisateur d’isoflurane.
- Réglez le vaporisateur à 4% d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène.
- Une fois que l’anesthésie a été confirmée par l’absence de réponse à un pincement de l’orteil et une réduction du rythme respiratoire, retirez la digue de la chambre d’induction à la zone de préparation.
- Préparation à la chirurgie
- Dans la zone de préparation, placez la mère en décubitus dorsal avec un cône nasal.
- Réduire le vaporisateur à 2 % d’isoflurane et 3,5 L/min d’oxygène pendant que le barrage est dans le cône de nez.
- Rasez soigneusement l’abdomen de la digue et enlevez l’excès de fourrure. Alterner l’abdomen rasé avec une solution de povidone et de l’éthanol à 70% trois fois à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton. Appliquer la couche finale de la solution de povidone. Pour éviter le dessèchement de la cornée, placez du gel lacrymal artificiel sur les deux yeux de la digue (Figure 2A, B).
- Après la préparation, déplacez la digue avec le cône nasal vers la zone de chirurgie désignée.
- Laparotomie utérine
REMARQUE: Utilisez des gants stériles tout au long de l’intervention chirurgicale. Changez les gants si une surface non stérile est en contact.- Dans la zone de chirurgie, placez le barrage en décubitus dorsal et fixez le cône nasal en place avec du ruban adhésif. Placez le coussin chauffant sous le tampon absorbant à 45 °C.
- À l’aide d’une pince et de ciseaux, faites une incision médiane d’environ 2 cm à travers la peau. Utilisez des pinces pour tenter la peau et faites une incision verticale dans la peau. Après cela, faites une autre incision de taille similaire à travers le péritoine pour exposer les cornes utérines. À l’aide d’une pince, tentez le péritoine tout en faisant l’incision verticale (Figure 2C, D).
REMARQUE: Ne pas se préparer correctement lors de l’incision du péritoine peut entraîner une incision mortelle des intestins. - Massez doucement les cornes utérines à travers l’incision en appuyant sur les côtés de l’abdomen. Pour ce faire, guidez soigneusement l’utérus sans outils, en utilisant uniquement les doigts pour éviter les blessures accidentelles. Placez l’utérus exposé sur un champ chirurgical stérile recouvrant l’abdomen de la digue et maintenez-le humide tout au long de la chirurgie avec des gouttes de solution saline stérile, qui peut être chauffée à 30 °C avant d’être utilisée au besoin (Figure 2E, F).
REMARQUE : Les cornes utérines peuvent être identifiées comme décrit dans Wang et al.27. - Une fois l’utérus exposé, sélectionnez trois paires de placentas pour la manipulation.
REMARQUE : Les placentas peuvent être identifiés comme décrit par Elmore et coll.24. Pour maximiser la survie des embryons, pas plus de 6 placentas doivent être traités. S’il y a moins de 12 embryons présents, pas plus de 4 placentas doivent être injectés. Sélectionnez deux placentas adjacents de sorte que l’un reçoive une injection de contrôle et l’autre le plasmide expérimental. L’utilisation de deux placentas adjacents permet une meilleure comparaison des placentas à des endroits similaires dans l’utérus et permet également une augmentation du taux de survie. Les paires placentaires sélectionnées sont choisies au hasard et espacées dans les deux cornes utérines (Figure 1B). - Enregistrer l’emplacement des manipulations placentaires et l’organisation des embryons dans les cornes utérines afin que les embryons et les placentas puissent être identifiés pendant la collecte, car une mère transportera à la fois des placentas / embryons contrôlés et traités expérimentalement.
- Injection placentaire et électroporation du plasmide témoin
NOTE: Pour maintenir une technique aseptique, stériliser les palettes d’électroporation et le micro-injecteur avec un stérilisant froid avant utilisation. Changez de gants si une surface non stérile est en contact.- À l’aide de la micropipette étalonnée, charger une quantité suffisante du plasmide témoin approprié pour trois injections. Effectuer toutes les injections à une profondeur de ~0,5 mm latéralement dans le placenta entre la décidua (blanc) et la zone jonctionnelle (rouge foncé) (Figure 3A-F).
- Effectuer des injections dans les trois placentas témoins.
NOTE: Effectuer toutes les injections de plasmides de contrôle avant les injections expérimentales pour éviter la contamination croisée des plasmides avec la micropipette. Cela permettra d’utiliser la même micropipette, car le changement de micropipettes et de temps d’étalonnage augmente considérablement le temps de chirurgie et diminue la survie de la mère. - Effectuer l’électroporation des placentas injectés par le plasmide de contrôle dans les 2 minutes suivant l’injection.
- Pour l’électroporation, utilisez une paire de palettes de 3 mm fixées à une machine d’électroporation. Pour assurer l’efficacité de l’incorporation de CRISPR et la viabilité des embryons, utilisez les paramètres d’électroporation suivants : 2 impulsions, 30 V, impulsion de 30 ms, impulsion de 970 ms, unipolaire.
- Après l’injection mais immédiatement avant l’électroporation, enduisez les lieux de contact avec une solution saline stérile, en appliquant la solution saline précisément sur les trois sites de la paroi utérine et les palettes avec un compte-gouttes ou une seringue.
- Appuyez doucement sur les palettes d’électroporation sur les côtés latéraux du placenta. Placer la palette anodique sur le site d’injection et la cathode directement en face (figure 4A-C).
- Appuyez sur l’impulsion de la machine d’électroporation et attendez que les deux impulsions soient terminées avant de retirer les palettes d’électroporation.
REMARQUE: Une petite quantité de mousse blanche est souvent observée entre les palettes et le placenta pendant les impulsions. Si cela ne se produit pas, vérifiez la tension des palettes avec un voltmètre avant de les utiliser ultérieurement. Si la lecture sur le voltmètre ne correspond pas au réglage de la tension d’électroporation, les palettes ne fonctionnent pas.
- Injection placentaire et électroporation du plasmide expérimental
- Suivez les mêmes instructions de l’étape 3.4.1. à l’étape 3.4.2. en utilisant le plasmide expérimental au lieu du plasmide témoin.
- Effectuer l’électroporation des trois placentas injectés expérimentaux dans les 2 minutes suivant l’injection. Cela doit être effectué de la même manière que pour ceux injectés avec les plasmides témoins. Suivez l’étape 3.4.4. à l’étape 3.4.7.
- Achèvement de la chirurgie
- Une fois la manipulation placentaire terminée, massez doucement les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale en utilisant uniquement les doigts (Figure 5A).
- Tout d’abord, effectuez des sutures simples à double nœud sur la couche péritonéale à l’aide de sutures solubles enduites et tressées de 45 cm de long avec un alliage d’aiguilles 3/8c de 13 mm. Espacez les sutures de 2 à 3 mm (figure 5B).
- Après avoir suturé la couche péritoine, suturer la peau avec des sutures solubles. Nouer trois nœuds les sutures simples à 2-3 mm l’une de l’autre pour s’assurer que le barrage ne peut pas défaire la suture (figure 5C).
- Une fois la suture terminée, régler l’isoflurane à 1 % et l’oxygène à 3,5 L/min, et appliquer de l’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau (figure 5D).
REMARQUE: L’adhésif tissulaire est facultatif mais recommandé pour empêcher la réouverture de l’incision due à la mastication de la mère. - Lorsque l’adhésif tissulaire a séché, éteignez le vaporisateur et retirez la digue de la zone de chirurgie. Placez le barrage dans une cage de soutien sur son dos.
4. Soins postopératoires et surveillance
- Laissez la mère enceinte récupérer dans une cage propre sous surveillance pendant au moins 30 minutes pour éviter les complications immédiates de la chirurgie. Observez jusqu’à ce qu’il soit complètement ambulatoire et puisse basculer sur ses pieds sans assistance. Abriter seul le barrage après la chirurgie.
- Suivre les soins postopératoires institutionnels et le suivi jusqu’au prélèvement d’embryons. Enregistrez le poids de la mère et surveillez quotidiennement les sutures et le site d’incision.
5. Collection placentaire E14.5
- Sur E14.5, anesthésier profondément la mère avec un cocktail kétamine/xylazine (1 mg/mL de kétamine et 0,1 mg/mL de xylazine), puis disloquer cerviquement la mère.
- Faites une incision en forme de V dans l’abdomen de la digue avec des ciseaux et retirez l’utérus. Placer immédiatement sur une boîte de Petri de 5 cm sur de la glace. À l’aide de forceps, retirez soigneusement l’embryon et le placenta correspondant de l’utérus.
REMARQUE: Conservez un registre de l’emplacement de l’embryon et du placenta correspondant dans les cornes utérines pour déterminer lequel a reçu la manipulation directe pendant la chirurgie. - Notez les poids placentaires. À l’aide de forceps et de rasoirs sans ARNase, coupez le placenta en deux le long de la ligne médiane. Mettre la moitié dans 4% PFA à 4 ° C. Couper à nouveau la moitié restante en deux et conserver les deux quartiers restants à −80 °C dans deux tubes, dont un avec un réactif de stockage d’ARN.
REMARQUE : Les embryons et autres tissus maternels peuvent être conservés à partir de la collection à −80 °C pour une utilisation ultérieure.
6. Analyse de l’expression génique placentaire
- Utiliser le quart du placenta stocké à −80 °C dans un réactif de stockage d’ARN.
- Traiter les placentas pour la qPCR comme décrit dans Elser et al. en utilisant la méthode Trizol pour l’isolement de l’ARN, un spectrophotomètre pour la concentration d’ARN, un kit de synthèse d’ADNc et qPCR avec SYBR Green Master Mix28. Au lieu de la DNAse Turbo DNAfree kit référencée dans Elser et al., utiliser une trousse de nettoyage de l’ARN après l’isolement de l’ARN Trizol pour s’assurer que les échantillons ne contiennent pas de contaminants28.
NOTE: Lisez la fiche signalétique (FS) de Trizol et utilisez-la dans une hotte chimique. - Évaluer l’insertion plasmidique du plasmide témoin avec les amorces GFP et du plasmide expérimental avec les amorces BLAST (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la valeur CT pour déterminer la présence du plasmide.
REMARQUE: Les valeurs CT supérieures à 35 sont des faux positifs, et seules celles inférieures à 35 doivent être considérées comme un indicateur positif que le plasmide a été inséré avec succès. - Évaluer l’expression placentaire de l’IGF-1 normalisée au gène 18s (amorces énumérées dans le tableau supplémentaire 1). Utilisez la méthode ddCT pour calculer le changement de pli, puis calculez le changement de pli normalisé des échantillons expérimentaux au changement de pli moyen des échantillons témoins.
7. Analyse du niveau de protéine placentaire
- Utilisez le quart du placenta qui a été conservé à −80 °C. Homogénéiser le tissu dans une solution tampon composée de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl2 et 10 mM d’inhibiteur de protéase dansdiH2Oavec un pH final de 7,4. Utilisez un homogénéisateur portatif et un pilon pour briser le tissu.
REMARQUE : L’échantillon ne doit pas dépasser 10 % du volume du tampon. - Diluer les échantillons homogénéisés dans le tampon à 1:12, de sorte qu’ils se situent dans la plage détectable d’une trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA). Effectuez le dosage BCA conformément aux instructions du fabricant et quantifiez la protéine totale à l’aide d’un lecteur de plaques.
- Après avoir effectué le test BCA, normaliser tous les échantillons à la même concentration totale de protéines de 2 mg/mL pour l’ELISA IGF-1, comme cela a été fait dans Gumusoglu et coll.29.
- Effectuer le test ELISA IGF-1 conformément aux instructions du fabricant et quantifier les niveaux de protéines IGF-1 à l’aide d’un lecteur de plaque à l’aide d’une courbe de concentration standard.
8. Vérification spatiale CRIPSR par hybridation fluorescente in situ
- Une fois que les moitiés placentaires ont été fixées de manière appropriée dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant 1 à 3 jours, les déplacer dans du saccharose à 20 % à 4 °C avant de les congeler dans un composé à température de coupe optimale (OCT).
- Couper en série les moitiés placentaires intégrées dans un cryostat à −20 °C en sections de 10 μm et les placer sur des lames à étiqueter. Couper les moitiés du placenta de manière à ce que les trois sous-régions soient visibles. Conserver les lames à −80 °C jusqu’à leur utilisation pour l’hybridation in situ .
- Effectuer l’étiquetage par hybridation in situ par fluorescence (FISH) en suivant les protocoles du fabricant. Hybridez une lame avec une sonde dCas9-3xNLS-VP64 et une deuxième lame « sœur » du même placenta avec une sonde Prl8a8.
REMARQUE: La sonde dCas9-3xNLS-VP64 détecte la présence du plasmide de surexpression. La sonde Prl8a8 met en évidence les spongiotrophoblastes de la zone jonctionnelle, ce qui permet d’identifier les sous-régions du placenta. Ces deux sondes sont étiquetées sur des lames « sœurs » séparées pour éviter l’interférence de la fluorescence multicanal avec l’autofluorescence verte dans les placentas. - Étiquetez les deux sondes avec le colorant de détection (Opal 620). Après avoir terminé le protocole du fabricant pour FISH, appliquez le support de montage DAPI et placez une lamelle de couverture sur la glissière. Scellez le couvercle avec du vernis à ongles transparent.
- Imagez les lames sur un microscope à fluorescence composé vertical et traitez-les à l’aide d’un logiciel de traitement d’image approprié. Ici, le logiciel CellSens a été utilisé.
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Representative Results
Résultats de la procédure générale (Figure 6)
Dans l’étude, il y avait trois groupes manipulés. Ceux-ci comprenaient des placentas injectés avec un plasmide de contrôle général CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR de contrôle d’activation (Act Control) ou un plasmide d’activation IGF-1 SAM (Igf1-OE). Le Cas9 Control est mieux adapté aux plasmides knock-out, et le contrôle d’activation est mieux adapté aux plasmides de surexpression / activation. Pour évaluer les changements de viabilité causés par la manipulation des placentas par injection et électroporation, la survie de l’embryon dans la portée a été analysée sur E14.5 (Figure 6A). Ce point temporel a été choisi car d’autres études qui ont effectué l’insertion in vivo de plasmides CRISPR par électroporation ont montré que des changements d’expression peuvent être obtenus en 8-22 h30,31,32. La collecte à E14.5 permet au plasmide CRISPR d’environ 48 h d’intégrer et d’activer une augmentation de l’expression génique. Il a été constaté que la manipulation chirurgicale de la mère avait un impact sur la survie de tous les embryons, mais les embryons associés aux placentas manipulés qui avaient subi une injection et une électroporation avaient considérablement réduit la survie. Le taux de survie des embryons non traités (dans la même portée mais ne subissant pas de manipulation ciblée) a été réduit de 100% à une moyenne de 79,05%. Il y avait une diminution significative de la survie des embryons manipulés, avec un taux de survie moyen de 55,56%. Aucune différence significative n’a été trouvée entre les trois groupes manipulés.
Pour déterminer si des changements bruts significatifs se produisaient dans les placentas manipulés, le poids placentaire a été enregistré. Il n’y avait pas de différence significative dans le poids placentaire d’aucun groupe (Figure 6B), et l’apparence brute du placenta et de l’embryon était inchangée. Des images post-nécroscopiques représentatives ont été prises au microscope à dissection lors de la collecte sur E14.5. Des images ont été prises des placentas / embryons de différents groupes de traitement, tous dans la même portée. Il n’y avait pas de dommages notables ou de changement dans l’apparence phénotypique dans les groupes de traitement, que ce soit dans le sac amniotique ou dans l’embryon exposé et son placenta correspondant (Figure 6D-I). Bien qu’aucune différence grossière n’ait été observée dans la morphologie des groupes manipulés avec l’utilisation d’un plasmide d’activation de l’IGF-1, cela peut ne pas être vrai pour d’autres plasmides expérimentaux ciblant d’autres gènes qui peuvent avoir un impact plus substantiel sur les régulateurs essentiels de la croissance et de la fonction du placenta ou de l’embryon. Aucune différence n’a été observée dans aucune mesure entre les placentas Cas9 Control et Act Control. Par conséquent, ces deux groupes ont été combinés et appelés Con ou Témoins pour toutes les analyses. Ces résultats démontrent que la manipulation des placentas in utero sur E12.5 à l’aide de cette technique entraîne une diminution de la survie de l’embryon, mais il existe toujours une viabilité significative. Les résultats démontrent également que la croissance placentaire n’est globalement pas affectée de manière significative, car il n’y a pas eu de changement significatif de poids entre les placentas manipulés et non traités. Cela démontre que la technique proposée peut permettre la survie de placentas manipulés par CRISPR sains et viables et de leurs embryons correspondants.
Un changement de poids de la mère a été enregistré chaque jour après la chirurgie avant la collecte d’embryons sur E14.5 (Figure 6C). La chirurgie a eu lieu sur E12.5, de sorte que tous les changements de poids de la mère sont répertoriés par rapport au poids sur E12.5. Les mères expérimentales (Exp) ont subi une manipulation placentaire, tandis que les mères fictives ont subi une anesthésie et une laparotomie de durée similaire sans manipulation placentaire. De nombreuses mères gestantes ont montré une légère diminution ou aucun changement de poids le lendemain de l’intervention (E13.5); Cela était probablement dû à une alimentation perturbée pendant et brièvement après la chirurgie. La plupart des mères ont montré une augmentation du poids sur E14.5, mais occasionnellement, une diminution du poids a encore été observée. Le suivi du poids de la mère maternelle après la chirurgie a permis de surveiller la survie de l’embryon. La variation entre le poids des mères gravides après la chirurgie était fréquente et n’indiquait pas que tous les embryons traités avaient été perdus. Il n’y avait pas de différences significatives dans les changements de poids post-opératoires chez les mères fictives par rapport aux mères expérimentales. Cela démontre que le bien-être de la mère a été généralement préservé après l’insertion des plasmides CRISPR dans le placenta. Dans l’ensemble, cela montre que même si cette technique chirurgicale peut entraîner une diminution de la viabilité des embryons, elle donne toujours un pourcentage important de descendants sains qui peuvent être utilisés pour l’étude.
Analyse de l’expression et de l’incorporation de CRISPR dans les placentas E14.5 (Figure 7)
Pour déterminer si l’insertion cellulaire du plasmide d’activation de l’IGF-1 a réussi à surexprimer l’IGF-1, une qPCR a été réalisée. Comme prévu, la qPCR a montré une augmentation significative de l’expression de l’IGF-1 dans les placentas IGF1-OE par rapport aux placentas témoins lorsque le changement de pli a été normalisé à l’expression 18s (test t de Welch, p = 0,0302) (Figure 7A). Pour déterminer si les niveaux de protéine IGF-1 ont été modifiés, un test ELISA a été effectué sur les placentas de tous les groupes. Conformément à la qPCR, l’évaluation ELISA des placentas E14.5 a montré une augmentation significative des taux de protéines IGF-1 dans les placentas IGF1-OE par rapport aux placentas témoins (test t de Welch, p = 0,0469) (Figure 7B). La qPCR et l’ELISA ont montré que le plasmide de surexpression augmentait avec succès l’expression du gène IGF-1 et la production de protéines IGF-1, respectivement.
Pour s’assurer que l’administration du plasmide était spécifique aux placentas manipulés, la qPCR a été réalisée pour le plasmide d’activation spécifique de l’IGF-1 et le plasmide de contrôle CRISPR Cas9. Ces qPCR ont été effectuées à la fois sur les placentas manipulés et sur les placentas non traités adjacents à ceux injectés. Les amorces qPCR utilisées pour évaluer l’expression du plasmide d’activation ciblaient une séquence du plasmide BLAST, qui fait partie du système d’activation (Figure 7C). Les placentas non traités n’ont montré aucune présence du plasmide BLAST (seuil de cycle [CT] indéterminé, étiqueté comme 40 sur le graphique), et les placentas Igf1-OE ont montré un scanner autour de 30. La qPCR réalisée pour évaluer l’expression plasmidique de contrôle ciblait une séquence du gène GFP inséré (Figure 7D). Les placentas non traités ont montré des valeurs CT supérieures à 35, probablement causées par la dimérisation de l’amorce, car ces valeurs sont en dehors d’une plage d’expression attendue. Les témoins ont montré une valeur CT d’environ 30. Ces qPCR servent de contrôle de qualité pour démontrer la surexpression attendue de l’IGF-1 ou son absence et que les plasmides ne sont présents que dans les placentas manipulés attendus.
La vérification spatiale du plasmide d’activation de l’IGF-1 a été réalisée à l’aide de coupes placentaires. Les placentas fixés et congelés dans le composé OCT ont été sectionnés en série à 10 μm sur des lames afin que toutes les couches soient visibles. Les lames ont ensuite été congelées à −80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour l’étiquetage FISH. Pour vérifier où dans le placenta le plasmide d’activation IGF-1 CRISPR a été incorporé, une sonde dCas9-3xNLS-VP64 avec marquage fluorescent rouge a été utilisée. Cette sonde cible un composant fonctionnel du système d’activation. L’autofluorescence verte a été utilisée pour mettre en évidence les sous-régions de l’interface mère-fœtus placentaires (Figure 7E,F). Aucun dCas9-3xNLS-VP64 n’a été détecté dans les placentas non traités, car ils n’avaient pas été traités par manipulation CRISPR (Figure 7E). Comme prévu, les placentas IGF1-OE affichaient un étiquetage pour dCas9-3xNLS-VP64, comme on le voit en rouge (Figure 7F). L’incorporation de CRISPR a été trouvée dans les trois sous-régions du placenta, avec l’étiquetage le plus clair de la zone de jonction (Figure 7E). L’intensité de fluorescence du marquage dCas9-3xNLS-VP64 variait d’un placenta traité au plasmide, indiquant que certains exprimaient le plasmide plus fortement que d’autres, et qu’il y avait des variations dans l’emplacement précis / l’étendue du marquage, mais le marquage était généralement présent dans toutes les sous-régions. Pour confirmer l’emplacement du marquage dCas9-3xNLS-VP64, le marquage Prl8a8 FISH ciblant les spongiotrophoblastes a été effectué pour marquer la sous-région jonctionnelle moyenne (Figure 7G,H). Cela a été effectué dans des sections adjacentes du même placenta sur une diapositive « sœur » des sections étiquetées pour dCas9-3xNLS-VP64. Comme prévu, la structure indiquée par le marquage Prl8a8 était similaire entre l’IGF1-OE et les placentas non traités. La zone de décidua et de labyrinthe a pu être identifiée par l’étiquetage des noyaux bleus (DAPI) entourant la zone de jonction rouge (Figure 7G,H). Le marquage FISH de dCas9-3xNLS-VP64 a précisé que le plasmide avait été inséré dans les trois sous-régions, ce qui a été confirmé par le marquage Prl8a8. Les résultats du marquage FISH ont confirmé que l’incorporation du plasmide d’activation de l’IGF-1 a réussi et que le plasmide n’a pas migré dans les placentas non traités.
Figure 1 : Schéma du protocole. (A) Schéma simplifié de l’intervention chirurgicale. Ordre chronologique des principales étapes de la technique. (B) Schéma montrant un exemple d’espacement du placenta manipulé dans les cornes utérines. Les deux panneaux ont été créés avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Procédure de laparotomie utérine. (A-B) Pendant la préparation de la chirurgie, (A) l’abdomen rasé d’une mère, et (B) la zone rasée recouverte d’une solution d’iode. (C-F) Dans la zone de chirurgie, (C) une incision de ~2 cm dans la peau abdominale et (D) une incision de ~2 cm dans le péritoine; Les intestins sont visibles. (E) Manipulation des cornes utérines à travers le site d’incision. Les cornes utérines sont visibles. (F) Cornes utérines complètement exposées placées sur un champ chirurgical stérile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Injection de plasmides CRISPR dans les placentas E12.5. (A,B) Orientation des embryons et du placenta dans les cornes utérines. (A) Vue oblique d’une corne utérine étiquetée montrant la décidue, les zones fœtales et un embryon. La ligne pointillée représente l’endroit où le site d’injection devrait être. (B) Une corne utérine non étiquetée du panneau A. (C, D) Vue latérale de la micropipette insérée dans le site d’injection dans le placenta. D est la décidue, FZ est la zone fœtale, E est l’embryon et la ligne pointillée représente l’emplacement du site d’injection. (D) Image non étiquetée de l’insertion de la micropipette du panneau C. (E,F) Vue latérale du colorant dans le placenta post-injection. (E) Image étiquetée d’une corne utérine montrant un placenta qui a été injecté avec un plasmide CRIPSR contenant un colorant visible et un placenta qui n’a pas été injecté. (F) Image non étiquetée de la corne utérine dans le panneau E. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Électroporation des placentas E12.5 après injection de plasmides CRISPR. (A) Vue de dessus des placentas dans une corne utérine. Les palettes d’électroporation de l’anode et de la cathode sont étiquetées, et la flèche blanche indique l’emplacement du site d’injection. (B) Vue oblique de l’électroporation d’un placenta. (C) Vue latérale de l’électroporation d’un placenta. (D-F) Contour simplifié des panneaux A, B et C. Les palettes d’anode et de cathode sont étiquetées, P est le placenta, E est l’embryon et la zone non marquée est l’utérus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Suture de la peau abdominale et du péritoine. (A) Les cornes utérines sont retournées à l’abdomen après la fin de la chirurgie. Des incisions de la peau abdominale et du péritoine sont visibles. (B) Incision péritonéale complètement suturée. (C) Incision cutanée abdominale complètement suturée. (D) Application d’adhésif tissulaire sur les sutures de la peau abdominale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Résultats de la procédure générale. (A) Taux de survie des embryons après la chirurgie collectés sur E14.5, 2 jours après l’intervention. Une diminution significative de la survie a été observée dans les groupes manipulés par rapport aux embryons non traités (test U de Mann-Whitney : non traité vs Cas9 témoin, p = 0,0077 ; Contrôle non traité vs contrôle de l’acte, p = 0,0330; et Non traité vs IGF1-OE, p = 0,0032). Aucune différence significative n’a été observée dans la survie des groupes manipulés (ANOVA unidirectionnelle, p = 0,9454). Chaque point représente le pourcentage de survie d’une seule portée (n non traité = 22, Cas9 témoin n = 9, témoin Act n = 13 et IGF1-OE n = 22 portées). (B) Poids placentaire des embryons survivants sur E14.5 (ANOVA unidirectionnelle, p = 0,1436) (n non traité = 138, Cas9 témoin n = 15, contrôle Act n = 20 et IGF1-OE n = 36 placentas). (C) Changements de poids de la mère après la chirurgie sur E13.5 et E14.5 observés chez les mères qui ont subi une procédure de laparotomie simulée ou une manipulation placentaire expérimentale (Exp). Aucune différence significative n’est observée entre les changements de poids des deux groupes de mères après la chirurgie (tests t non appariés : E13,5 p = 0,5452 et E14,5 p = 0,2493) (barrages fictifs n = 3 et mères Exp n = 10). Toutes les barres d’erreur représentent les images MEB (D-F) d’embryons E14.5 post-nécroscopie dans le sac amniotique avec le placenta encore attaché. (F) La barre d’échelle dans le coin extrême droit représente 3,75 mm. (G-I) Image oblique de l’embryon et vue de dessus du placenta correspondant. (I) La barre d’échelle dans le coin extrême droit représente 3,75 mm. (D-I) Toutes les étiquettes des groupes de traitement sont énumérées sous les images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Analyse de l’expression et de l’incorporation de CRISPR dans les placentas E14.5. (A) Analyse qPCR de l’expression de l’IGF-1 dans le contrôle E14.5 et les placentas IGF1-OE. Une augmentation significative de l’expression de l’IGF-1 normalisée à l’expression de 18s a été observée dans les placentas IGF1-OE (test t de Welch, p = 0,0302) (contrôle n = 15 et IGF1-OE n = 20 placentas). (B) ELISA des taux de protéine IGF-1 dans le contrôle E14.5 et les placentas IGF1-OE. Une augmentation significative des taux d’IGF-1 a été observée dans les placentas IGF1-OE par rapport aux niveaux de contrôle (test t de Welch, p = 0,0469) (contrôle n = 13 et IGF1-OE n = 15 placentas.) (C) analyse qPCR de la séquence BLAST du plasmide SAM IGF-1. L’expression de BLAST a été trouvée dans les placentas IGF1-OE seulement, et aucune expression ou indéterminée n’a été trouvée dans les placentas non traités (n non traité = 4 et IGF1-OE n = 9 placentas). (D) analyse qPCR de la séquence GFP du plasmide témoin CRISPR Cas9. L’expression du plasmide a été trouvée dans les placentas témoins, et des valeurs CT supérieures à 35/résultats faussement positifs ont été trouvées dans les échantillons non traités (n non traité = 4 et témoin = 5 placentas). La ligne pointillée représente le seuil de faux positifs à 35 CT. Chaque point de données provient d’un placenta. Toutes les barres d’erreur représentent l’hybridation in situ par fluorescence MEB (E-H) des coupes placentaires E14.5 à une épaisseur de 10 μm. (E) Coupes non traitées et (F) coupes de placenta IGF1-OE avec une sonde dCas9-3xNLS-VP64 marquée en rouge. Le signal rouge n’est présent que dans le placenta IGF1-OE. Le signal vert est l’autofluorescence utilisée pour aider à identifier les sous-régions placentaires. (G) Coupes non traitées et (H) placenta IGF1-OE avec une sonde Prl8a8 marquée en rouge pour identifier les spongiotrophoblastes de la zone de jonction médiane. DAPI en bleu montre les zones de décidua et de labyrinthe qui entourent cette zone de jonction. (H) La barre d’échelle dans le coin le plus à droite représente 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Amorces utilisées dans cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le placenta est un régulateur primaire de la croissance fœtale et, comme indiqué précédemment, les changements dans l’expression ou la fonction des gènes placentaires peuvent avoir un impact significatif sur le développement du fœtus6. Le protocole décrit ici peut être utilisé pour effectuer une manipulation CRISPR in vivo ciblée du placenta de souris en utilisant une approche chirurgicale relativement avancée. Cette technique permet un rendement significatif d’embryons viables et de leurs placentas correspondants qui peuvent être utilisés pour une étude plus approfondie (Figure 6A,B). Cette technique nous a permis de surexprimer avec succès l’IGF-1 placentaire sur E14.5 (Figure 7A,B). Les plasmides utilisés ont montré une spécificité, car les plasmides insérés sont restés dans les placentas manipulés et n’étaient pas présents dans les placentas adjacents non traités (Figure 7C,D). La distribution spatiale du plasmide d’activation de l’IGF-1 a été confirmée par FISH pour dCas9-3xNLS-VP64 et Prl8a8, qui a démontré que le plasmide d’activation était présent dans les trois sous-régions des placentas IGF1-OE et non dans les sous-régions des placentas non traités (Figure 7E-H). Cette technique peut être utilisée pour modifier l’expression des gènes placentaires d’une manière qui n’est peut-être pas possible avec les techniques précédentes. L’utilisation de cette technique permettra de mieux comprendre l’influence de l’expression et de la fonction des gènes placentaires sur le développement fœtal dans de multiples contextes.
Pour optimiser le succès de cette procédure pour les résultats maternels et fœtaux, les effets de la modification de plusieurs paramètres ont été explorés, y compris les paramètres d’injection et d’électroporation, ainsi que les matériaux utilisés. Pour augmenter la survie et la récupération de la digue, il a été constaté que le temps sous anesthésie ne devrait pas dépasser 1 h, car des périodes de chirurgie plus longues diminuaient considérablement la survie. Si le temps sous anesthésie atteint environ 2 heures, la probabilité de survie est considérablement réduite à des niveaux inférieurs à 20%, probablement en raison des effets négatifs d’une période prolongée sous isoflurane. Outre le temps passé sous anesthésie, la complication la plus courante de la chirurgie qui a entraîné la mort maternelle était l’incapacité à installer correctement le péritoine lors des incisions de la peau et du péritoine. Si le péritoine n’est pas correctement tenté, les intestins peuvent être blessés, ce qui pourrait entraîner la mort dans les jours suivant la chirurgie. Le moment où l’utérus est exposé a également un impact sur la survie de la mère et des embryons. Le temps moyen d’exposition de l’utérus dans les expériences réussies était d’environ 15 minutes; Plus de 30 minutes d’exposition peuvent entraîner une augmentation des résorptions et une maladie maternelle possible. L’utérus exposé et tous les autres organes exposés (souvent les intestins) doivent être maintenus humides, mais trop de solution saline peut refroidir l’animal; lors de l’humidification périodique des organes exposés, moins de 1 mL de solution saline stérile doit être utilisée.
Les paramètres de l’injection et de l’électroporation ont eu un impact considérable sur la survie de l’embryon. Le volume d’injection ne doit pas dépasser environ 4,5 μL, car cela a entraîné des résorptions. Le temps et la pression d’injection sont importants pour maximiser la survie; Le temps d’injection doit être réglé entre 0,5 s et 1,5 s, bien que 0,8 s semble optimal. La pression doit être réglée entre 1-8,5 psi. De faibles taux de survie des embryons ont été observés avec de faibles temps d’injection et des taux élevés de PSI d’injection. Il a également été observé que si la micropipette était trop émoussée, il pourrait y avoir une diminution de la viabilité embryonnaire, et la solution fuira souvent de la micropipette. Le type de colorant utilisé pour visualiser les injections peut avoir un impact sur la survie. Le bleu de méthylène a entraîné la mort maternelle lorsqu’il était utilisé à cette fin, mais une solution de colorant vert rapide filtrée n’a montré aucun impact négatif sur la santé maternelle. Les réglages d’électroporation ont été optimisés à partir des réglages recommandés par le fabricant sur la base d’études d’électroporation antérieures in vivo33. L’électroporation s’est avérée être la manipulation qui causait le plus de dommages et diminuait la survie de l’embryon. Les paramètres d’électroporation embryonnaire in vivo recommandés suggèrent quatre impulsions pour maximiser l’efficacité de CRISPR, mais deux impulsions sont recommandées pour un taux de survie plus élevé33. Il a été constaté que quatre impulsions provoquaient la résooration de presque tous les embryons. Deux impulsions ont permis d’augmenter la viabilité tout en maintenant l’efficacité de CRISPR. La taille de la palette d’électroporation a également eu un impact significatif sur la survie de l’embryon. Il a été constaté que les palettes d’électroporation de 5 mm conduisaient à une résorption presque complète lorsqu’elles étaient utilisées avec les réglages recommandés. En effet, des palettes d’électroporation de 3 mm sont recommandées dans le guide du fabricant et augmentent significativement la viabilité de l’embryon33. Il est également important de noter que de nombreuses palettes d’électroporation ont une certaine durée de vie des impulsions. Après avoir été utilisés à ce maximum, une diminution de la qualité peut être observée. Cela peut être identifié s’il n’y a pas de formation d’une petite mousse blanche entre les palettes et le placenta pendant une impulsion. La tension de la palette d’électroporation peut être vérifiée à l’aide d’un voltmètre pour déterminer si elle produit la tension attendue.
Cette étude est limitée à plusieurs égards. Cette technique est spécifique au temps et probablement mieux exécutée au plus tôt E10.5 et au plus tard E16.5. Cela est dû au fait que le placenta était trop petit avant E10.5, et après E16.5, le plasmide peut ne pas avoir assez de temps pour produire l’effet désiré. Ce délai signifie que cette technique est mieux adaptée à des types spécifiques d’études chez la souris. Cette technique est utile pour étudier le neurodéveloppement, car E12.5 tombe dans un moment crucial de la neurogenèse pour de nombreuses structures du cerveau34. Cette technique peut ne pas être utile pour étudier les impacts placentaires sur les premiers stades de développement, tels que la formation de plaques neurales, qui a lieu sur E8.535. Les résultats d’un plasmide CRISPR knockout ne sont pas connus pour le moment; L’application de cette méthode à la réduction de l’expression génique doit faire l’objet d’études plus approfondies, car seule la surexpression/activation d’un gène a été démontrée. Malgré cela, il est prévu que cette technique serait également couronnée de succès pour l’insertion d’un plasmide CRISPR knockout.
Cette technique pourrait également permettre la possibilité d’effectuer une culture primaire de tissu placentaire génétiquement modifié36. Selon le type de CRISPR utilisé, comme CRISPRi et CRISPRa, une culture primaire pourrait être utilisée pour effectuer une étude de sauvetage37,38. Cette technique pourrait également être utilisée pour explorer davantage les liens entre les anomalies génétiques et fonctionnelles placentaires et les problèmes chez la progéniture. Plus précisément, une étude antérieure a révélé une corrélation significative entre les scores de risque génomique spécifiques au placental et les risques de schizophrénie39. Cette étude a identifié de nombreux gènes placentaires qui peuvent jouer un rôle dans le développement de la schizophrénie qui n’ont pas été explorés dans les modèles animaux. Cette technique se prête à d’autres études de ce type et d’autres.
Les connaissances acquises grâce à la modification CRISPR du placenta pourraient être traduites dans une gamme d’applications biomédicales différentes. Les études qui identifient comment l’expression de gènes spécifiques dans le placenta peut avoir un impact sur le développement du fœtus pourraient être utilisées pour créer des interventions pharmacologiques ciblées sur le placental qui pourraient traiter ces anomalies. Les traitements ciblant directement un fœtus peuvent être difficiles et dangereux40,41. Le placenta est une cible plus accessible pour le traitement. Dans le cas de problèmes de développement dans le cœur ou le cerveau qui peuvent être modifiables avant la naissance, la manipulation directe du cœur ou du cerveau est à haut risque. Un tel risque pourrait être évité avec une intervention placentaire, qui est plus plausible et pourrait conduire à des stratégies préventives pour les troubles neurodéveloppementaux pour lesquels l’environnement moléculaire, qui est en partie fourni par le placenta, peut être critique5. Cette technique pourrait également être utilisée pour traiter des maladies telles que les cardiopathies congénitales, qui ont été liées aux troubles placentaires9. Comme la cardiopathie congénitale est une anomalie congénitale courante, la possibilité d’un traitement d’intervention placentaire pourrait avoir un impact significatif8. Comme le placenta a de nombreuses fonctions, cette technique pourrait être utilisée pour faire progresser le développement d’interventions pour de multiples maladies. Dans l’ensemble, cette technique ciblée placentaire pourrait être utilisée pour approfondir la compréhension de l’influence de la génétique placentaire et de la fonction sur de multiples domaines du développement fœtal.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs reconnaissent les sources de financement suivantes : R01 MH122435, NIH T32GM008629 et NIH T32GM145441. Les auteurs remercient les laboratoires du Dr Val Sheffield et du Dr Calvin Carter à l’Université de l’Iowa pour l’utilisation de leur salle d’opération et de leur équipement, ainsi que le Dr Eric Van Otterloo, le Dr Nandakumar Narayanan et le Dr Matthew Weber pour leur aide en microscopie. Les auteurs remercient également la Dre Sara Maurer, Maya Evans et Sreelekha Kundu pour leur aide dans les chirurgies pilotes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
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