Summary
Aquí describimos un método específico en el tiempo para manipular eficazmente las vías críticas de desarrollo en la placenta del ratón in vivo. Esto se realiza mediante la inyección y electroporación de plásmidos CRISPR en las placentas de madres embarazadas en el día embrionario 12.5.
Abstract
La placenta es un órgano esencial que regula y mantiene el desarrollo de los mamíferos en el útero. La placenta es responsable de la transferencia de nutrientes y desechos entre la madre y el feto y la producción y entrega de factores de crecimiento y hormonas. Las manipulaciones genéticas placentarias en ratones son fundamentales para comprender el papel específico de la placenta en el desarrollo prenatal. Los ratones transgénicos que expresan Cre específicos de la placenta tienen una efectividad variable, y otros métodos para la manipulación de genes placentarios pueden ser alternativas útiles. Este documento describe una técnica para alterar directamente la expresión génica placentaria utilizando la manipulación del gen CRISPR, que se puede utilizar para modificar la expresión de genes específicos. Utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, las madres embarazadas se someten a una laparotomía en el día embrionario 12.5 (E12.5), y un plásmido CRISPR se administra mediante una micropipeta de vidrio en las placentas individuales. El plásmido se electropora inmediatamente después de cada inyección. Después de la recuperación de la madre, las placentas y los embriones pueden continuar el desarrollo hasta la evaluación en un momento posterior. La evaluación de la placenta y la descendencia después del uso de esta técnica puede determinar el papel de la función placentaria específica en el tiempo en el desarrollo. Este tipo de manipulación permitirá una mejor comprensión de cómo la genética placentaria y la función afectan el crecimiento y desarrollo fetal en múltiples contextos de enfermedades.
Introduction
La placenta es un órgano esencial implicado en el desarrollo del feto. El papel principal de la placenta es proporcionar factores esenciales y regular la transferencia de nutrientes y desechos hacia y desde el feto. Las placentas de mamíferos están compuestas por tejido fetal y materno, que constituye la interfaz fetal-materna y, por lo tanto, la genética de la madre y el feto impactan la función1. Las anomalías genéticas o la función deteriorada de la placenta pueden alterar drásticamente el desarrollo fetal. Trabajos anteriores han demostrado que la genética y el desarrollo de la placenta están asociados con el desarrollo alterado de sistemas de órganos específicos en el feto. En particular, las anomalías en la placenta están relacionadas con cambios en el cerebro, el corazón y el sistema vascular fetales 2,3,4,5.
El transporte de hormonas, factores de crecimiento y otras moléculas de la placenta al feto juega un papel importante en el desarrollo fetal6. Se ha demostrado que alterar la producción placentaria de moléculas específicas puede alterar el neurodesarrollo. La inflamación materna puede aumentar la producción de serotonina al alterar la expresión génica metabólica del triptófano (TRP) en la placenta, lo que posteriormente crea una acumulación de serotonina en el cerebro fetal7. Otros estudios han encontrado anomalías placentarias junto con defectos cardíacos. Se cree que las anomalías en la placenta contribuyen a los defectos cardíacos congénitos, el defecto congénito más común en los seres humanos8. Un estudio reciente ha identificado varios genes que tienen vías celulares similares tanto en la placenta como en el corazón. Si se interrumpen, estas vías podrían causar defectos en ambos órganos9. Los defectos en la placenta pueden exacerbar los defectos cardíacos congénitos. El papel de la genética placentaria y la función en el desarrollo de sistemas específicos de órganos fetales es un campo de estudio emergente.
Los ratones tienen placentas hemocoriales y otras características de las placentas humanas, lo que los convierte en modelos muy útiles para estudiar enfermedades humanas1. A pesar de la importancia de la placenta, actualmente hay una falta de manipulaciones genéticas in vivo dirigidas. Además, actualmente hay más opciones disponibles para knockouts o knockdowns que manipulaciones de sobreexpresión o ganancia de función en la placenta10. Hay varias líneas transgénicas que expresan Cre para la manipulación placentaria específica, cada una en diferentes linajes de trofoblastos en diferentes puntos de tiempo. Estos incluyen Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER y Gcm1-Cre 11,12,13,14. Si bien estos transgenes Cre son eficientes, es posible que no sean capaces de manipular algunos genes en puntos de tiempo específicos. Otro método comúnmente utilizado para noquear o sobreexpresar la expresión génica placentaria es la inserción de vectores lentivirales en el cultivo de blastocisto, lo que causa una manipulación genética específica del trofoblasto15,16. Esta técnica permite un cambio robusto en la expresión génica placentaria al principio del desarrollo. El uso de la interferencia de ARN in vivo se ha utilizado escasamente en la placenta. La inserción de plásmidos de ARNsh se puede realizar de manera similar a la técnica CRIPSR descrita en este artículo. Esto se ha hecho en E13.5 para disminuir con éxito la expresión de PlGF en la placenta, con impactos en la vasculatura cerebral de la descendencia17.
Además de las técnicas que se utilizan principalmente para knockout o knockdown, la inducción de la sobreexpresión se realiza comúnmente con adenovirus o la inserción de una proteína exógena. Las técnicas utilizadas para la sobreexpresión tienen diferentes tasas de éxito y en su mayoría se han realizado más tarde en la gestación. Para investigar el papel del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) en la función placentaria, se realizó una transferencia génica placentaria mediada por adenovirus para inducir la sobreexpresión del gen IGF-1 18,19. Esto se realizó al final de la gestación del ratón en E18.5 mediante inyección placentaria directa. Para proporcionar opciones adicionales y eludir posibles fallos de manipulaciones genéticas placentarias establecidas, como fallos de combinación Cre-Lox, la posible toxicidad de adenovirus y los efectos fuera del objetivo del ARNsh, se puede utilizar la manipulación directa in vivo de CRISPR de la placenta20,21,22. Este modelo fue desarrollado para abordar la falta de modelos de sobreexpresión y para crear un modelo con flexibilidad.
Esta técnica se basa en el trabajo de Lecuyer et al., en el que los plásmidos shRNA y CRISPR fueron dirigidos directamente in vivo a placentas de ratón para alterar la expresión de PlGF 17. Esta técnica se puede utilizar para alterar directamente la expresión génica placentaria mediante la manipulación CRISPR en múltiples puntos de tiempo; para este trabajo, se seleccionó E12.5. La placenta ha madurado en este punto y es lo suficientemente grande como para manipularla, lo que permite la inserción de un plásmido CRISPR específico en E12.5, que puede tener un impacto significativo en el desarrollo fetal desde mediados hasta finales del embarazo23,24. A diferencia de los enfoques transgénicos, pero similares a las inducciones virales o la interferencia de ARN, esta técnica permite la sobreexpresión o el knockout en puntos de tiempo particulares utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado, evitando así posibles alteraciones de la placenta o letalidad embrionaria de cambios anteriores. Como solo unas pocas placentas reciben el plásmido experimental o de control dentro de una camada, el enfoque permite dos tipos de controles internos. Estos controles son los inyectados y electroporados con el plásmido de control adecuado y los que no reciben manipulación directa. Esta técnica se optimizó para crear una sobreexpresión del gen IGF-1 en la placenta del ratón a través de un plásmido CRISPR mediador de activación sinérgico (SAM). Se eligió el gen IGF-1, ya que el IGF-1 es una hormona de crecimiento esencial entregada al feto que se produce principalmente en la placenta antes del nacimiento25,26. Esta nueva técnica CRISPR dirigida a la placenta permitirá la manipulación directa para ayudar a definir la conexión entre la función placentaria y el desarrollo fetal.
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Protocol
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo y cumplimiento con las regulaciones federales y la política de la Universidad de Iowa y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
1. Animales y cría
- Mantener a los animales en un ciclo de luz diurna de 12 h con comida y agua ad libitum.
- Use ratones hembra CD-1 de 8 a 15 semanas. Utilice la presencia de un tapón copulatorio para identificar E0.5.
- En E0.5, casa sola las presas preñadas.
2. Calibración de la micropipeta
NOTA: La calibración de la micropipeta debe realizarse antes de la cirugía cuando sea posible.
- Antes de hacer y calibrar la micropipeta, diluir todos los plásmidos a la concentración recomendada (0,1 μg/μL) en agua libre de DNasa. Mezclar el plásmido con el colorante verde rápido adecuadamente diluido (1 μg/μL en PBS) (concentración final del plásmido: 0,06 μg/μL).
- Tire de micropipetas utilizando capilares de vidrio de 10 cm con un diámetro exterior de 1,5 mm y un diámetro interior de 0,86 mm con un extractor de micropipetas.
- Rompa con cuidado la punta de una micropipeta (2-3 mm) con pinzas estériles.
- Cargue la micropipeta en una punta microcapilar conectada a un microinyector. Asegúrese de que el microinyector esté conectado a la máquina de microinyección y que haya niveles suficientes de nitrógeno para calibrar la micropipeta.
- Una vez que la micropipeta esté conectada al microinyector, cárguela con la solución de colorante Fast Green para realizar la calibración (1 μg/μL en PBS). Calibrar la micropipeta para inyectar un volumen de aproximadamente 3,5 μL. Vacíe ("limpie") la micropipeta en preparación para cargar las soluciones plásmidas como se muestra a continuación.
NOTA: Cada micropipeta será ligeramente diferente. Para evitar dañar la placenta durante la inyección, el tiempo de inyección debe establecerse entre 0,5-1,5 s. La presión debe establecerse entre 1-8.5 psi. Calibrar cada micropipeta por separado; Si la micropipeta no se puede calibrar dentro de estos parámetros, entonces no debe utilizarse.
3. Cirugía (Figura 1A)
NOTA: Para preparar, limpie las superficies de las áreas de preparación y quirúrgicas con etanol al 70%. Coloque una almohadilla absorbente en el área de preparación. En el área de la cirugía, coloque una almohadilla térmica hacia abajo y luego coloque una almohadilla interna absorbente encima de esta. Esterilice todas las herramientas antes de la cirugía. El tiempo que la presa está bajo anestesia debe ser inferior a 1 h.
- Anestesia
- Administrar 5 mg/kg de AINE (meloxicam) u otro analgésico aprobado a la madre embarazada de 30 min a 1 h antes de la cirugía.
- Coloque la madre embarazada en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano.
- Ajuste el vaporizador al 4% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno.
- Una vez que la anestesia ha sido confirmada por la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie y una frecuencia respiratoria reducida, retire la presa de la cámara de inducción al área de preparación.
- Preparación quirúrgica
- En el área de preparación, coloque la presa supina con un cono nasal.
- Reduzca el vaporizador al 2% de isoflurano y 3,5 L/min de oxígeno mientras la presa está en el cono de la nariz.
- Afeite bien el abdomen de la presa y elimine el exceso de pelaje. Alterne el recubrimiento del abdomen afeitado con solución de povidona y etanol al 70% tres veces usando aplicadores estériles con punta de algodón. Aplique la capa final de la solución de povidona. Para evitar el secado de la córnea, coloque gel lagrimal artificial sobre ambos ojos de la presa (Figura 2A, B).
- Después de la preparación, mueva la presa con el cono de la nariz al área de cirugía designada.
- Laparotomía uterina
NOTA: Use guantes estériles durante todo el procedimiento quirúrgico. Cambie los guantes si entra en contacto alguna superficie no estéril.- En el área de la cirugía, coloque la madre supina y asegure el cono nasal en su lugar con cinta adhesiva. Ajuste la almohadilla térmica debajo de la almohadilla absorbente a 45 °C.
- Usando fórceps y tijeras, haga una incisión de aproximadamente 2 cm en la línea media a través de la piel. Use fórceps para colocar la piel en la carpa y haga una incisión vertical en la piel. Después de esto, haga otra incisión de tamaño similar a través del peritoneo para exponer los cuernos uterinos. Con fórceps, coloque el peritoneo mientras realiza la incisión vertical (Figura 2C, D).
NOTA: Si no se coloca correctamente la tienda de campaña mientras se incide el peritoneo, puede provocar una incisión fatal en los intestinos. - Masajee suavemente los cuernos uterinos a través de la incisión presionando los lados del abdomen. Haga esto guiando cuidadosamente el útero sin herramientas, usando solo los dedos para evitar lesiones accidentales. Coloque el útero expuesto encima de una cortina quirúrgica estéril que cubra el abdomen de la presa y manténgalo húmedo durante toda la cirugía con gotas de solución salina estéril, que se puede calentar a 30 ° C antes de usar según sea necesario (Figura 2E, F).
NOTA: Los cuernos uterinos pueden ser identificados como se describe en Wang et al.27. - Una vez que el útero está expuesto, seleccione tres pares de placentas para su manipulación.
NOTA: Las placentas pueden ser identificadas como lo describen Elmore et al.24. Para maximizar la supervivencia de los embriones, no se deben tratar más de 6 placentas. Si hay menos de 12 embriones presentes, no se deben inyectar más de 4 placentas. Seleccione dos placentas adyacentes para que una reciba una inyección de control y la otra reciba el plásmido experimental. El uso de dos placentas adyacentes permite una mejor comparación de placentas en lugares similares en el útero y también permite una mayor tasa de supervivencia. Los pares placentarios seleccionados se eligen al azar y se espacian a lo largo de ambos cuernos uterinos (Figura 1B). - Registre la ubicación de las manipulaciones placentarias y la organización de los embriones dentro de los cuernos uterinos para que los embriones y las placentas puedan identificarse durante la recolección, ya que una madre llevará placentas / embriones controlados y tratados experimentalmente.
- Inyección placentaria y electroporación del plásmido control
NOTA: Para mantener una técnica aséptica, esterilice las paletas de electroporación y el microinyector con un esterilizante frío antes de su uso. Cambie los guantes si entra en contacto con alguna superficie no estéril.- Utilizando la micropipeta calibrada, cargar una cantidad suficiente del plásmido de control adecuado para tres inyecciones. Realice todas las inyecciones a una profundidad de ~0.5 mm lateralmente en la placenta entre la decidua (blanco) y la zona de unión (rojo oscuro) (Figura 3A-F).
- Realizar inyecciones en las tres placentas de control.
NOTA: Realice todas las inyecciones de plásmidos de control antes de las inyecciones experimentales para evitar la contaminación cruzada de los plásmidos con la micropipeta. Esto permitirá utilizar la misma micropipeta, ya que cambiar las micropipetas y el tiempo de calibración aumenta drásticamente el tiempo de cirugía y disminuye la supervivencia de la madre. - Realizar la electroporación de las placentas inyectadas con plásmidos de control dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección.
- Para la electroporación, utilice un par de paletas de 3 mm conectadas a una máquina de electroporación. Para garantizar la eficiencia de incorporación de CRISPR y la viabilidad de los embriones, utilice los siguientes ajustes de electroporación: 2 pulsos, 30 V, pulso de 30 ms, pulso de 970 ms apagado, unipolar.
- Después de la inyección, pero inmediatamente antes de la electroporación, cubra los lugares de contacto con solución salina estéril, aplicando la solución salina con precisión en los tres sitios de la pared uterina y las paletas con un gotero o jeringa.
- Presione suavemente las paletas de electroporación en los lados laterales de la placenta. Coloque la paleta del ánodo sobre el lugar de inyección y el cátodo directamente opuesto (Figura 4A-C).
- Presione el pulso en la máquina de electroporación y espere a que se completen los dos pulsos antes de retirar las paletas de electroporación.
NOTA: A menudo se ve una pequeña cantidad de espuma blanca entre las paletas y la placenta durante los pulsos. Si esto no ocurre, verifique el voltaje de las paletas con un voltímetro antes de seguir usándolo. Si la lectura en el voltímetro no coincide con la configuración de voltaje de electroporación, las paletas no funcionan.
- Inyección placentaria y electroporación del plásmido experimental
- Siga las mismas instrucciones del paso 3.4.1. al paso 3.4.2. utilizando el plásmido experimental en lugar del plásmido de control.
- Realizar la electroporación de las tres placentas inyectadas experimentales dentro de los 2 minutos posteriores a la inyección. Esto debe realizarse de la misma manera que para aquellos inyectados con los plásmidos de control. Siga el paso 3.4.4. al paso 3.4.7.
- Finalización de la cirugía
- Una vez que se complete la manipulación placentaria, masajee suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal usando solo los dedos (Figura 5A).
- Primero, realice suturas simples de doble nudo en la capa de peritoneo utilizando suturas solubles recubiertas y trenzadas que tengan 45 cm de largo con una aleación de aguja de 13 mm 3/8c. Espaciar las suturas a 2-3 mm de distancia (Figura 5B).
- Después de suturar la capa de peritoneo, suture la piel con suturas solubles. Anude tres veces las suturas simples separadas por 2-3 mm para garantizar que la presa no pueda deshacer la sutura (Figura 5C).
- Una vez completada la sutura, ajustar el isoflurano al 1% y el oxígeno a 3,5 L/min, y aplicar adhesivo tisular a las suturas sobre la piel (Figura 5D).
NOTA: El adhesivo tisular es opcional, pero se recomienda para evitar la reapertura de la incisión debido a la masticación de la presa. - Cuando el adhesivo tisular se haya secado, apague el vaporizador y retire la presa del área de la cirugía. Coloque la presa en una jaula de apoyo sobre su espalda.
4. Atención y seguimiento postoperatorio
- Permita que la madre preñada se recupere en una jaula limpia bajo supervisión durante un mínimo de 30 minutos para garantizar que no haya complicaciones inmediatas de la cirugía. Observe hasta que esté completamente ambulatorio y pueda voltearse sobre sus pies sin ayuda. Individualmente casa la presa post-cirugía.
- Seguir el cuidado postoperatorio institucional y el seguimiento hasta la recolección de embriones. Registre el peso de la presa y controle las suturas y el sitio de la incisión diariamente.
5. Recolección placentaria E14.5
- En E14.5, anestesiar profundamente la presa con un cóctel de ketamina/xilazina (1 mg/ml de ketamina y 0,1 mg/ml de xilazina), y luego dislocar cervicamente la presa.
- Haga una incisión en forma de V en el abdomen de la presa con tijeras y retire el útero. Colocar inmediatamente sobre una placa de Petri de 5 cm sobre hielo. Con fórceps, retire cuidadosamente el embrión y la placenta correspondiente del útero.
NOTA: Mantenga un registro de la ubicación del embrión y la placenta correspondiente en los cuernos uterinos para determinar cuál recibió la manipulación directa durante la cirugía. - Registre los pesos de la placenta. Usando fórceps y cuchillas de afeitar sin ARNasa, corte la placenta por la mitad en la línea media. Poner la mitad en PFA al 4% a 4 °C. Cortar la mitad restante por la mitad de nuevo, y almacenar los dos cuartos restantes a -80 °C en dos tubos, uno con reactivo de almacenamiento de ARN.
NOTA: Los embriones y otros tejidos maternos pueden almacenarse de la colección a -80 °C para su uso futuro.
6. Análisis de expresión génica placentaria
- Utilice la cuarta parte de la placenta almacenada a -80 °C en un reactivo de almacenamiento de ARN.
- Procesar las placentas para qPCR como se describe en Elser et al. utilizando el método Trizol para el aislamiento de ARN, un espectrofotómetro para la concentración de ARN, un kit de síntesis de ADNc y qPCR con SYBR Green Master Mix28. En lugar de la DNAsa del kit Turbo DNAfree a la que se hace referencia en Elser et al., use un kit RNAcleanup después del aislamiento de ARN Trizol para asegurarse de que las muestras no contengan contaminantes28.
NOTA: Lea la hoja de datos de seguridad de materiales (MSDS) de Trizol y úsela en una campana extractora de humos químicos. - Evaluar la inserción del plásmido control con cebadores GFP y del plásmido experimental con cebadores BLAST (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el valor de TC para determinar la presencia del plásmido.
NOTA: Los valores de TC superiores a 35 son falsos positivos, y solo los inferiores a 35 deben considerarse un indicador positivo de que el plásmido se insertó correctamente. - Evaluar la expresión placentaria de IGF-1 normalizada al gen de mantenimiento 18s (cebadores enumerados en la Tabla suplementaria 1). Utilice el método ddCT para calcular el cambio de pliegue y, a continuación, calcule el cambio de pliegue normalizado de las muestras experimentales al cambio medio de pliegue de las muestras de control.
7. Análisis del nivel de proteína placentaria
- Utilice el cuarto de la placenta que se ha almacenado a -80 °C. Homogeneizar el tejido en una solución tampón hecha de 11,5 mM de Tris HCl, 5 mM de MgCl2 y 10 mM de inhibidor de la proteasa endiH2Ocon un pH final de 7,4. Use un homogeneizador de mano y un mortero para romper el tejido.
NOTA: La muestra no debe exceder el 10% del volumen del tampón. - Diluir las muestras homogeneizadas en el tampón a 1:12, de modo que estén dentro del rango detectable de un kit de ensayo de ácido bicinchonínico (BCA). Realice el ensayo de BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique la proteína total utilizando un lector de placas.
- Después de realizar el ensayo de BCA, normalizar todas las muestras a la misma concentración total de proteína de 2 mg/mL para el ELISA de IGF-1, como se hizo en Gumusoglu et al.29.
- Realice el ELISA IGF-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cuantifique los niveles de proteína IGF-1 con un lector de placas utilizando una curva de concentración estándar.
8. Verificación espacial de CRIPSR mediante etiquetado fluorescente de hibridación in situ
- Después de que las mitades placentarias se hayan fijado adecuadamente en PFA al 4% a 4 °C durante 1-3 días, moverlas a sacarosa al 20% a 4 °C antes de congelarlas en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT).
- Dividir en serie las mitades de la placenta incrustada en OCT en un criostato de −20 °C en secciones de 10 μm, y colocarlas en portaobjetos para etiquetarlas. Secciona la placenta a la mitad para que las tres subregiones sean visibles. Conservar los portaobjetos a -80 °C hasta su uso para la hibridación in situ .
- Realizar el etiquetado de hibridación fluorescente in situ (FISH) siguiendo los protocolos del fabricante. Hibridar un portaobjetos con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 y un segundo portaobjetos "hermano" de la misma placenta con una sonda Prl8a8.
NOTA: La sonda dCas9-3xNLS-VP64 detecta la presencia del plásmido de sobreexpresión. La sonda Prl8a8 resalta los espongiotrofoblastos de la zona de unión, lo que permite identificar las subregiones de la placenta. Estas dos sondas están etiquetadas en portaobjetos "hermanos" separados para evitar la interferencia de la fluorescencia multicanal con la autofluorescencia verde en las placentas. - Etiquete ambas sondas con el tinte de detección (Opal 620). Después de completar el protocolo del fabricante para FISH, aplique el medio de montaje DAPI y coloque un cubreobjetos en la corredera. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.
- Tome imágenes de los portaobjetos en un microscopio de fluorescencia compuesto vertical y procese utilizando un software de procesamiento de imágenes apropiado. Aquí, se utilizó el software CellSens.
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Representative Results
Resultados generales del procedimiento (Figura 6)
En el estudio, hubo tres grupos manipulados. Estos incluyeron placentas inyectadas con un plásmido de control CRISPR Cas9 general (Cas9 Control), un plásmido CRISPR de control de activación (Act Control) o un plásmido de activación SAM IGF-1 (Igf1-OE). El Cas9 Control es más adecuado para plásmidos knockout, y el control de activación es más adecuado para plásmidos de sobreexpresión/activación. Para evaluar los cambios de viabilidad causados por la manipulación de las placentas mediante inyección y electroporación, se analizó la supervivencia embrionaria dentro de la camada en E14.5 (Figura 6A). Este punto de tiempo fue seleccionado ya que otros estudios que han realizado la inserción in vivo de plásmidos CRISPR mediante electroporación han demostrado que los cambios de expresión se pueden lograr dentro de 8-22 h30,31,32. La recolección en E14.5 permite que el plásmido CRISPR aproximadamente 48 h se integre y active un aumento en la expresión génica. Se encontró que la manipulación quirúrgica de la madre afectó la supervivencia de todos los embriones, pero los embriones asociados con las placentas manipuladas que se sometieron a inyección y electroporación habían reducido significativamente la supervivencia. La tasa de supervivencia de los embriones no tratados (en la misma camada pero sin manipulación dirigida) disminuyó del 100% de supervivencia a un promedio del 79,05%. Hubo una disminución significativa en la supervivencia de los embriones manipulados, con una tasa de supervivencia promedio del 55,56%. No se encontraron diferencias significativas entre los tres grupos manipulados.
Para determinar si ocurrieron cambios macroscópicos significativos en las placentas manipuladas, se registró el peso placentario. No hubo diferencias significativas en el peso placentario de ningún grupo (Figura 6B), y la apariencia macroscópica de la placenta y el embrión no se modificó. Se tomaron imágenes representativas posteriores a la necroscopia en un microscopio de disección en la recolección de E14.5. Se tomaron imágenes de las placentas / embriones de diferentes grupos de tratamiento, todos dentro de la misma camada. No hubo daño o cambio notable en la apariencia fenotípica en ningún grupo de tratamiento, ya sea en el saco amniótico o en el embrión expuesto y su placenta correspondiente (Figura 6D-I). Si bien no se observaron diferencias graves en la morfología de los grupos manipulados con el uso de un plásmido de activación de IGF-1, esto puede no ser cierto para otros plásmidos experimentales dirigidos a otros genes que pueden afectar más sustancialmente el crecimiento esencial y los reguladores de la función de la placenta o el embrión. No se encontraron diferencias en ninguna medida entre las placentas Cas9 Control y Act Control. Por lo tanto, estos dos grupos se combinaron y se denominaron Con o Controles para todos los análisis. Estos resultados demuestran que la manipulación de placentas en el útero sobre E12.5 mediante esta técnica provoca una disminución de la supervivencia embrionaria, pero todavía existe una viabilidad significativa. Los resultados también demuestran que el crecimiento de la placenta en general no se ve afectado significativamente, ya que no hubo un cambio significativo en el peso entre las placentas manipuladas y no tratadas. Esto demuestra que la técnica propuesta puede permitir la supervivencia de placentas sanas y viables manipuladas con CRISPR y sus correspondientes embriones.
El cambio de peso de la madre se registró cada día después de la cirugía antes de la recolección de embriones en E14.5 (Figura 6C). La cirugía se llevó a cabo en E12.5, por lo que todos los cambios de peso de la presa se enumeran en relación con el peso en E12.5. Las presas experimentales (Exp) se sometieron a manipulación placentaria, mientras que las presas simuladas se sometieron a anestesia y una laparotomía de duración similar sin manipulación placentaria. Muchas madres embarazadas mostraron una ligera disminución o ningún cambio en el peso el día después del procedimiento (E13.5); Esto probablemente se debió a la interrupción de la alimentación durante y brevemente después de la cirugía. La mayoría de las presas mostraron un aumento de peso en E14.5, pero ocasionalmente, todavía se observó una disminución en el peso. El seguimiento del peso de la madre materna después de la cirugía permitió el monitoreo de la supervivencia embrionaria. La variación entre el peso de las madres embarazadas después de la cirugía fue común y no indicó que se perdieran todos los embriones tratados. No hubo diferencias significativas en los cambios de peso posteriores a la cirugía en las madres simuladas versus experimentales. Esto demuestra que el bienestar de la madre generalmente se preservó después de la inserción de los plásmidos CRISPR en la placenta. En general, esto muestra que, si bien esta técnica quirúrgica puede causar una disminución en la viabilidad de los embriones, aún produce un porcentaje significativo de progenie sana que se puede utilizar para el estudio.
Análisis de expresión e incorporación de CRISPR en placentas E14.5 (Figura 7)
Para determinar si la inserción celular del plásmido de activación de IGF-1 fue exitosa para sobreexpresar IGF-1, se realizó qPCR. Como era de esperar, la qPCR mostró un aumento significativo en la expresión de IGF-1 en las placentas de IGF1-OE frente a las placentas control cuando el cambio de pliegue se normalizó a la expresión de 18s (prueba t de Welch, p = 0,0302) (Figura 7A). Para determinar si los niveles de proteína IGF-1 estaban alterados, se realizó un ELISA en las placentas de todos los grupos. Consistente con la qPCR, la evaluación ELISA de las placentas E14.5 mostró un aumento significativo en los niveles de proteína IGF-1 en las placentas IGF1-OE frente a las placentas control (prueba t de Welch, p = 0.0469) (Figura 7B). La qPCR y el ELISA mostraron que el plásmido de sobreexpresión aumentó con éxito la expresión del gen IGF-1 y la producción de la proteína IGF-1, respectivamente.
Para garantizar que la administración del plásmido fuera específica para las placentas manipuladas, se realizó qPCR para el plásmido de activación específico de IGF-1 y el plásmido CRISPR Cas9 Control. Estas qPCR se realizaron tanto en las placentas manipuladas como en las placentas no tratadas adyacentes a las inyectadas. Los cebadores qPCR utilizados para evaluar la expresión del plásmido de activación se dirigieron a una secuencia del plásmido BLAST, que forma parte del sistema de activación (Figura 7C). Las placentas no tratadas no mostraron presencia del plásmido BLAST (umbral del ciclo [CT] indeterminado, etiquetado como 40 en el gráfico), y las placentas Igf1-OE mostraron una TC alrededor de 30. La qPCR realizada para evaluar la expresión del plásmido control se dirigió a una secuencia del gen GFP insertado (Figura 7D). Las placentas no tratadas mostraron valores de TC superiores a 35, probablemente causados por la dimerización del cebador, ya que estos valores están fuera de un rango de expresión esperado. Los controles mostraron un valor de TC de aproximadamente 30. Estas qPCR sirven como un control de calidad para demostrar la sobreexpresión esperada de IGF-1 o la falta de ella y que los plásmidos solo están presentes en las placentas manipuladas esperadas.
La verificación espacial del plásmido de activación de IGF-1 se realizó mediante secciones placentarias. Las placentas que se fijaron y congelaron en un compuesto OCT se seccionaron en serie a 10 μm en portaobjetos para que todas las capas fueran visibles. Los portaobjetos se congelaron a -80 °C hasta su uso para el etiquetado de FISH. Para verificar en qué parte de la placenta se incorporó el plásmido de activación CRISPR de IGF-1, se utilizó una sonda dCas9-3xNLS-VP64 con marcado fluorescente rojo. Esta sonda se dirige a un componente funcional del sistema de activación. Se utilizó autofluorescencia verde para demostrar las subregiones de la interfaz placentaria materno-fetal (Figura 7E, F). No se detectó dCas9-3xNLS-VP64 en las placentas no tratadas, ya que no habían sido tratadas con manipulación CRISPR (Figura 7E). Como era de esperar, las placentas IGF1-OE mostraron el etiquetado de dCas9-3xNLS-VP64, como se ve en rojo (Figura 7F). La incorporación de CRISPR se encontró en las tres subregiones de la placenta, con el etiquetado más claro de la zona de unión (Figura 7E). La intensidad de fluorescencia del marcado dCas9-3xNLS-VP64 varió en las placentas tratadas con plásmidos, lo que indica que algunas expresaron el plásmido más que otras, y hubo variaciones en la ubicación / extensión precisas del etiquetado, pero el etiquetado generalmente estuvo presente en todas las subregiones. Para confirmar la ubicación del etiquetado dCas9-3xNLS-VP64, se realizó un etiquetado FISH Prl8a8 dirigido a espongiotrofoblastos para etiquetar la subregión de unión media (Figura 7G,H). Esto se realizó en secciones adyacentes de la misma placenta en un portaobjetos "hermano" de las secciones que fueron etiquetadas para dCas9-3xNLS-VP64. Como era de esperar, la estructura indicada por el etiquetado de Prl8a8 fue similar entre el IGF1-OE y las placentas no tratadas. La zona decidua y laberíntica podría identificarse por el etiquetado de núcleos azules (DAPI) que rodea la zona de unión roja (Figura 7G, H). El etiquetado FISH de dCas9-3xNLS-VP64 aclaró que el plásmido se insertó en las tres subregiones, y esto se confirmó con el etiquetado Prl8a8. Los resultados del etiquetado FISH confirmaron que la incorporación del plásmido de activación de IGF-1 fue exitosa, y el plásmido no migró a placentas no tratadas.
Figura 1: Esquema del protocolo . (A) Esquema simplificado del procedimiento quirúrgico. Orden cronológico de los pasos principales de la técnica. (B) Esquema que muestra un ejemplo de espaciamiento manipulado de la placenta dentro de los cuernos uterinos. Ambos paneles fueron creados con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de laparotomía uterina. (A-B) Durante la preparación de la cirugía, (A) el abdomen afeitado de una presa, y (B) el área afeitada recubierta con solución de yodo. (C-F) En el área de la cirugía, (C) una incisión de ~2 cm en la piel abdominal, y (D) una incisión de ~2 cm en el peritoneo; Los intestinos son visibles. (E) Manipular los cuernos uterinos a través del sitio de la incisión. Los cuernos uterinos son visibles. (F) Cuernos uterinos completamente expuestos colocados en una cortina quirúrgica estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección de plásmidos CRISPR en placentas E12.5. (A,B) Orientación de los embriones y la placenta dentro de los cuernos uterinos. (A) Vista oblicua de un cuerno uterino marcado que muestra decidua, zonas fetales y un embrión. La línea discontinua representa dónde debe estar el lugar de inyección. (B) Un cuerno uterino sin etiqueta del panel A. (C,D) Vista lateral de la micropipeta insertada en el lugar de inyección en la placenta. D es la decidua, FZ son las zonas fetales, E es el embrión y la línea discontinua representa la ubicación del sitio de inyección. (D) Imagen sin etiqueta de la inserción de micropipetas del panel C. (E,F) Vista lateral del tinte en la placenta después de la inyección. (E) Imagen etiquetada de un cuerno uterino que muestra una placenta que ha sido inyectada con un plásmido CRIPSR que contiene un tinte visible y una placenta que no ha sido inyectada. (F) Imagen sin etiqueta del cuerno uterino en el panel E. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Electroporación de placentas E12.5 después de la inyección de plásmidos CRISPR. (A) Vista superior de placentas en un cuerno uterino. Las paletas de electroporación del ánodo y del cátodo están etiquetadas, y la flecha blanca indica la ubicación del sitio de inyección. (B) Vista oblicua de la electroporación de una placenta. (C) Vista lateral de la electroporación de una placenta. (D-F) Esquema simplificado de los paneles A, B y C. Las paletas del ánodo y el cátodo están marcadas, P es la placenta, E es el embrión y el área no marcada es el útero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Sutura de la piel abdominal y peritoneo . (A) Cuernos uterinos devueltos al abdomen después de la finalización de la cirugía. Las incisiones de piel abdominal y peritoneo son visibles. (B) Incisión del peritoneo completamente suturada. (C) Incisión abdominal en la piel completamente suturada. (D) Aplicación de adhesivo tisular a las suturas de la piel abdominal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados generales del procedimiento. (A) Tasas de supervivencia embrionaria después de la cirugía recolectadas en E14.5, 2 días después del procedimiento. Se observó una disminución significativa de la supervivencia en los grupos manipulados frente a los embriones no tratados (prueba U de Mann-Whitney: Control no tratado vs. Cas9, p = 0,0077; No tratado vs. Control de Actos, p = 0,0330; y No tratado vs. IGF1-OE, p = 0,0032). No se observaron diferencias significativas en la supervivencia de los grupos manipulados (ANOVA unidireccional, p = 0,9454). Cada punto representa el porcentaje de supervivencia de una sola camada (no tratada n = 22, Cas9 Control n = 9, Control de acto n = 13 e IGF1-OE n = 22 camadas). (B) Peso placentario de los embriones supervivientes en E14.5 (ANOVA unidireccional, p = 0.1436) (No tratado n = 138, Cas9 Control n = 15, Control de Acto n = 20 e IGF1-OE n = 36 placentas). (C) Cambios en el peso de la presa después de la cirugía en E13.5 y E14.5 observados en madres que se sometieron a un procedimiento de laparotomía simulada o se sometieron a manipulación placentaria experimental (Exp). No se observan diferencias significativas entre los cambios de peso de los dos grupos de madres después de la cirugía (pruebas t no pareadas: E13.5 p = 0.5452 y E14.5 p = 0.2493) (presas simuladas n = 3 y presas Exp n = 10). Todas las barras de error representan el SEM. (D-F) Imágenes de embriones E14.5 después de la necroscopia en el saco amniótico con la placenta aún adherida. (F) La barra de escala en la esquina derecha representa 3,75 mm. (G-I) Imagen oblicua del embrión y vista superior de la placenta correspondiente. (I) La barra de escala en la esquina derecha representa 3,75 mm. (D-I) Todas las etiquetas del grupo de tratamiento se enumeran debajo de las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de expresión e incorporación de CRISPR en placentas E14.5. (A) Análisis por PCR de la expresión de IGF-1 en placentas control E14.5 e IGF1-OE. Se observó un aumento significativo en la expresión de IGF-1 normalizada a la expresión de 18s en las placentas de IGF1-OE (prueba t de Welch, p = 0.0302) (Control n = 15 e IGF1-OE n = 20 placentas). (B) ELISA de los niveles de proteína IGF-1 en el control E14.5 y placentas IGF1-OE. Se observó un aumento significativo en los niveles de IGF-1 en las placentas de IGF1-OE en comparación con los niveles de control (prueba t de Welch, p = 0.0469) (Control n = 13 e IGF1-OE n = 15 placentas). (C) análisis por PCR de la secuencia BLAST del plásmido SAM IGF-1. La expresión de BLAST se encontró solo en las placentas de IGF1-OE, y no se encontró expresión / expresión indeterminada en las placentas no tratadas (n no tratada = 4 e IGF1-OE n = 9 placentas). (D) análisis por PCR de la secuencia GFP del plásmido control CRISPR Cas9. Se encontró expresión del plásmido en las placentas control, y se encontraron valores de TC superiores a 35/resultados falsos positivos en las muestras no tratadas (n no tratada = 4 y Control = 5 placentas). La línea discontinua representa el umbral de falsos positivos a 35 CT. Cada punto de datos proviene de una placenta. Todas las barras de error representan el SEM. (E-H) Hibridación fluorescente in situ de secciones placentarias E14.5 a 10 μm de espesor. (E) Secciones de placenta no tratadas y (F) IGF1-OE con una sonda dCas9-3xNLS-VP64 marcada en rojo. La señal roja sólo está presente en la placenta IGF1-OE. La señal verde es la autofluorescencia utilizada para ayudar a identificar las subregiones placentarias. (G) Secciones de placenta no tratadas y (H) IGF1-OE con una sonda Prl8a8 marcada en rojo para identificar espongiotrofoblastos de la zona de unión media. DAPI en azul muestra las zonas decidua y laberíntica que rodean esa zona de unión. (H) La barra de escala en la esquina derecha representa 2 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: Imprimaciones utilizadas en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La placenta es un regulador primario del crecimiento fetal y, como se señaló anteriormente, los cambios en la expresión o función génica de la placenta pueden afectar significativamente el desarrollo fetal6. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para realizar una manipulación CRISPR in vivo dirigida de la placenta del ratón utilizando un enfoque quirúrgico relativamente avanzado. Esta técnica permite un rendimiento significativo de embriones viables y sus correspondientes placentas que pueden ser utilizadas para estudios posteriores (Figura 6A,B). Esta técnica nos permitió sobreexpresar con éxito el IGF-1 placentario en E14.5 (Figura 7A,B). Los plásmidos utilizados mostraron especificidad, ya que los plásmidos insertados permanecieron en las placentas manipuladas y no estaban presentes en las placentas adyacentes no tratadas (Figura 7C, D). La distribución espacial del plásmido de activación de IGF-1 fue confirmada por FISH para dCas9-3xNLS-VP64 y Prl8a8, lo que demostró que el plásmido de activación estaba presente en las tres subregiones de las placentas IGF1-OE y no en ninguna subregión de las placentas no tratadas (Figura 7E-H). Esta técnica se puede utilizar para alterar la expresión génica placentaria de maneras que pueden no ser posibles con técnicas anteriores. El uso de esta técnica permitirá una mayor comprensión de la influencia de la expresión génica placentaria y la función en el desarrollo fetal en múltiples contextos.
Para optimizar el éxito de este procedimiento para los resultados maternos y fetales, se exploraron los efectos de cambiar múltiples parámetros, incluidos los ajustes de inyección y electroporación, así como los materiales utilizados. Para aumentar la supervivencia y recuperación de la madre, se encontró que el tiempo bajo anestesia no debe exceder 1 h, ya que los períodos quirúrgicos más largos disminuyeron significativamente la supervivencia. Si el tiempo bajo anestesia alcanza aproximadamente 2 horas, la probabilidad de supervivencia disminuye drásticamente a niveles inferiores al 20%, probablemente debido a los efectos negativos del tiempo prolongado bajo isoflurano. Aparte del tiempo bajo anestesia, la complicación más común de la cirugía que condujo a la muerte materna fue la falta de colocación adecuada del peritoneo mientras se hacían las incisiones en la piel y el peritoneo. Si el peritoneo no está correctamente embalado, los intestinos pueden lesionarse, lo que podría causar la muerte en los días posteriores a la cirugía. El tiempo que el útero está expuesto también afecta la supervivencia de la madre y los embriones. El tiempo promedio que el útero estuvo expuesto en experimentos exitosos fue de aproximadamente 15 minutos; Más de 30 minutos de exposición pueden conducir a un aumento de las reabsorciones y posibles enfermedades maternas. El útero expuesto y cualquier otro órgano expuesto (a menudo intestinos) deben mantenerse húmedos, pero demasiada solución salina puede enfriar al animal; al humedecer periódicamente los órganos expuestos, se debe usar menos de 1 ml de solución salina estéril.
Los parámetros de la inyección y la electroporación tuvieron un gran impacto en la supervivencia del embrión. El volumen de inyección no debe exceder aproximadamente 4,5 μL, ya que esto dio lugar a reabsorciones. El tiempo de inyección y la presión son importantes para maximizar la supervivencia; El tiempo de inyección debe establecerse entre 0,5 s y 1,5 s, aunque 0,8 s parece óptimo. La presión debe establecerse entre 1-8.5 psi. Se observaron bajas tasas de supervivencia embrionaria con tiempos de inyección bajos y niveles altos de PSI de inyección. También se observó que si la micropipeta era demasiado roma, podría haber una disminución en la viabilidad embrionaria, y la solución también se escapará a menudo de la micropipeta. El tipo de tinte utilizado para visualizar las inyecciones puede afectar la supervivencia. El azul de metileno condujo a la muerte materna cuando se usó para este propósito, pero una solución filtrada de colorante verde rápido no mostró impactos negativos en la salud materna. Los ajustes de electroporación se optimizaron a partir de los ajustes recomendados por el fabricante basados en estudios previos de electroporación in vivo33. Se encontró que la electroporación era la manipulación que causaba el mayor daño y disminuía la supervivencia embrionaria. Los ajustes recomendados de electroporación embrionaria in vivo sugieren cuatro pulsos para maximizar la eficiencia CRISPR, pero se recomiendan dos pulsos para una mayor tasa de supervivencia33. Se encontró que cuatro pulsos causaron que casi todos los embriones se reabsorbieran. Dos pulsos permitieron una mayor viabilidad mientras se mantenía la eficiencia CRISPR. El tamaño de la paleta de electroporación también afectó significativamente la supervivencia del embrión. Se encontró que las paletas de electroporación de 5 mm conducían a una reabsorción casi completa cuando se usaban con los ajustes recomendados. De hecho, las paletas de electroporación de 3 mm se recomiendan en la guía del fabricante y aumentan significativamente la viabilidad embrionaria33. También es importante tener en cuenta que muchas paletas de electroporación tienen cierta vida útil de pulso. Después de que se han utilizado al máximo, se puede ver una disminución en la calidad. Esto se puede identificar si no hay formación de una pequeña espuma blanca entre las paletas y la placenta durante un pulso. El voltaje de la paleta de electroporación se puede verificar usando un voltímetro para determinar si está produciendo el voltaje esperado.
Este estudio es limitado de varias maneras. Esta técnica es específica en el tiempo y probablemente se realice mejor no antes de E10.5 y no más tarde de E16.5. Esto se debe a que la placenta es demasiado pequeña antes de E10.5, y después de E16.5, el plásmido puede no tener suficiente tiempo para producir el efecto deseado. Este período de tiempo significa que esta técnica es más adecuada para tipos específicos de estudios en ratones. Esta técnica es útil para estudiar el neurodesarrollo, ya que E12.5 cae dentro de un tiempo crucial de neurogénesis para muchas estructuras dentro del cerebro34. Esta técnica puede no ser útil para estudiar los impactos placentarios en las primeras etapas del desarrollo, como la formación de la placa neural, que tiene lugar en E8.535. Los resultados de un plásmido CRISPR knockout no se conocen en este momento; La aplicación de este método a la reducción de la expresión génica necesita más investigación, ya que solo se ha demostrado la sobreexpresión/activación de un gen. A pesar de esto, se anticipa que esta técnica también sería exitosa para la inserción de un plásmido CRISPR knockout.
Esta técnica también podría permitir la posibilidad de realizar un cultivo primario de tejido placentario modificado genéticamente36. Dependiendo del tipo de CRISPR utilizado, como CRISPRi y CRISPRa, se podría utilizar un cultivo primario para realizar un estudio de rescate37,38. Esta técnica también podría usarse para explorar más a fondo los vínculos entre las anomalías genéticas y funcionales de la placenta y los problemas en la descendencia. Específicamente, un estudio previo encontró una correlación significativa entre las puntuaciones de riesgo genómico específico de la placenta y los riesgos de esquizofrenia39. Este estudio identificó muchos genes placentarios que pueden desempeñar un papel en el desarrollo de la esquizofrenia que no se han explorado en modelos animales. Esta técnica se presta para estudios posteriores de este tipo y otros.
El conocimiento obtenido de la modificación CRISPR de la placenta podría traducirse en una gama de diferentes aplicaciones biomédicas. Los estudios que identifican cómo la expresión génica específica en la placenta puede afectar el desarrollo fetal podrían usarse para crear intervenciones farmacológicas dirigidas a la placenta que podrían tratar estas anomalías. Los tratamientos dirigidos directamente al feto pueden ser difíciles y peligrosos40,41. La placenta es un objetivo más accesible para el tratamiento. En el caso de problemas de desarrollo en el corazón o el cerebro que pueden ser modificables prenatalmente, la manipulación directa del corazón o el cerebro es de alto riesgo. Tal riesgo podría evitarse con la intervención placentaria, que es más plausible y podría conducir a estrategias preventivas para trastornos del neurodesarrollo para los cuales el ambiente molecular, que es en parte proporcionado por la placenta, puede ser crítico5. Esta técnica también podría ser utilizada para tratar enfermedades como la cardiopatía congénita, que ha sido relacionada con trastornos placentarios9. Como la cardiopatía congénita es un defecto congénito común, la posibilidad de un tratamiento de intervención placentaria podría tener un impacto significativo8. Como la placenta tiene muchas funciones, esta técnica podría usarse para avanzar en el desarrollo de intervenciones para múltiples enfermedades. En general, esta técnica dirigida placentaria podría usarse para mejorar la comprensión de la influencia de la genética placentaria y la función en múltiples áreas del desarrollo fetal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen las siguientes fuentes de financiamiento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 y NIH T32GM145441. Los autores agradecen a los laboratorios del Dr. Val Sheffield y el Dr. Calvin Carter en la Universidad de Iowa por el uso de su sala de cirugía y equipo, así como al Dr. Eric Van Otterloo, el Dr. Nandakumar Narayanan y el Dr. Matthew Weber por su ayuda con la microscopía. Sara Maurer, Maya Evans y Sreelekha Kundu por su ayuda con las cirugías piloto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899.AP | |
| 96 Well plate | Cornings | 3598 | For BCA kit |
| Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Activation Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Dnase-free water provided for dilution |
| AMV Reverse Transcriptase | New England Biolabs | M0277L | Use for cDNA synthesis |
| Anesthetic Gas Vaporizor | Vetamac | VAD-601TT | VAD-compact vaporizer |
| Artifical Tear Gel | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein quantification |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Hand-held tissue homogenizer |
| CellSens Software | Olympus | V4.1.1 | Image processing to FISH images. |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plate centrifuge |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA isolation |
| Cotton Tipped Applicators | ProAdvantage | 77100 | Sterilize before use |
| CRISPR/Cas9 Control Plasmid | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Dnase-free water provided for dilution |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Dissection Microscope | Leica | M125 C | Used for post-necroscopy imaging |
| Dissolvable Sutures | Med Vet International | J385H | |
| Distilled Water | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcium; (-) Magnesium |
| ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Generator only |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Electroporation paddles/Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | 3 mm diameter paddles; wires included |
| Embedding Cassette: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Placenta embedding cassettes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Excess isoflurane filter |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light |
| Filter-based microplate photometer (plate reader) | Fisher Scientific | 14377576 | Can be used for BCA and ELISA |
| Forceps | VWR | 82027-386 | Fine tips, straight, serrated |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette) | Sutter Instrument | B150-86-10 | O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length |
| Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homogenization buffer |
| Heating Pad | Thermotech | S766D | Digitial Moist Heating Pad |
| Hemostats | VWR | 10806-188 | Fully surrated jaw; curved |
| Hot Water Bath | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmid (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Dnase-free water provided for dilution |
| Induction Chamber | Vetamac | 941443 | No specific liter size required |
| Isoflurane | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA isolation |
| Ketamine HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homogenization buffer |
| MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Fisher Scientific | 4309849 | Barcoded plates not required |
| Microcapillary Tip | Eppendorf | 5196082001 | Attached to BTX Microinjector |
| Microinjector | BTX Harvard Apparatus | 45-0766 | Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes |
| Microject 1000A (Injection Machine) | BTX Harvard Apparatus | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Micropipette Puller Model P-97 | Sutter Instrument | P-97 | Flaming/Brown type micropipette puller |
| Microplate Mixer (Plate Shaker) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit | R & D Systems | MG100 | |
| Needles | BD - Becton, Dickson, and Company | 305106 | 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm) |
| Nitrogen Tank | Linde | 7727-37-9 | Any innert gas |
| Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgic such as Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 detection dye | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | Used for FISH |
| Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound | Sakura | 4583 | |
| Oxygen Tank | Linde | 7782 - 44 - 7 | Medical grade oxygen |
| Pestles | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidone-Iodine Solution, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Power SYBR™ Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | Use for qPCR |
| Random Hexamers (Random Primers) | New England Biolabs | S1330S | Use for cDNA synthesis |
| Razor Blade | Grainger | 26X080 | |
| RNA Cleanup Kit & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kit v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately. |
| RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 | Advanced Cells Diagnostics | 528641-C2 | |
| RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Advanced Cells Diagnostics | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Dry oven for in situ hybridization |
| Scissors | VWR | 82027-578 | Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/? |
| Sodium Chloride (Saline) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0.9% |
| Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] | Research Product International | 03-04-6132 | |
| Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Protein homogenization buffer |
| Steamer | Bella | B00DPX8UBA | |
| Sterile Surgical Drape | Busse | 696 | Sterilize before use |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Syringes | BD - Becton, Dickson, and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer | Fisher Scientific | 13-400-525 | This configuration comes with Qubit 4 fluorometer. Qubit quantification not required. |
| Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homogenization buffer |
| TRIzol™ Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation |
| TSA Buffer Pack | Advanced Cells Diagnostics | 322810 | Used to dilute Opal 620 detection dye |
| Universal F-Circuit | Vetamac | 40200 | Attached to vaporizer and vaporizer accessories |
| Upright Compound Fluorescence Microscope | Olympus | BX61VS | Used for FISH imaging |
| Vectorshield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Coverslip mounting media |
| ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | This is for SYBR 384-well block detection. TaqMan and/or smaller blocks available |
| Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color | Amazon | C450B | |
| Xylazine 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
References
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