Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحديد الحدود الحرارية للعوالق الحيوانية باستخدام كتلة حرارية

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64762
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology Department, Swarthmore College

Summary

يوضح البروتوكول الحالي استخدام المكونات المتاحة تجاريا لتوليد تدرج حراري مستقر وخطي. يمكن بعد ذلك استخدام هذا التدرج لتحديد الحد الحراري الأعلى للكائنات العوالق ، وخاصة يرقات اللافقاريات.

Abstract

تم استخدام الحدود الحرارية والعرض على نطاق واسع للتنبؤ بتوزيع الأنواع. مع استمرار ارتفاع درجة الحرارة العالمية ، فإن فهم كيفية تغير الحد الحراري مع التأقلم وكيف يختلف بين مراحل الحياة والسكان أمر حيوي لتحديد مدى تعرض الأنواع للاحترار في المستقبل. معظم الكائنات البحرية لها دورات حياة معقدة تشمل مراحل العوالق المبكرة. في حين أن تحديد الحد الحراري لهذه المراحل التنموية المبكرة الصغيرة (عشرات إلى مئات الميكرونات) يساعد في تحديد الاختناقات التنموية ، يمكن أن تكون هذه العملية صعبة بسبب صغر حجم الكائنات الحية المستهدفة ، ومتطلبات مساحة مقاعد البدلاء الكبيرة ، وارتفاع تكلفة التصنيع الأولية. هنا ، يتم تقديم إعداد موجه نحو أحجام صغيرة (مل إلى عشرات مل). يجمع هذا الإعداد بين المكونات المتاحة تجاريا لتوليد تدرج حراري مستقر وخطي. كما يتم عرض مواصفات الإنتاج الخاصة بالإعداد ، بالإضافة إلى إجراءات إدخال وتعداد الأفراد الأحياء مقابل الأفراد الأموات وحساب درجة الحرارة المميتة.

Introduction

التسامح الحراري هو مفتاح بقاء الكائنات الحية ووظيفتها 1,2. مع استمرار ارتفاع درجة حرارة الكوكب بسبب انبعاثات الكربون البشرية المنشأ ، يتم إيلاء اهتمام متزايد لتحديد وتطبيق الحدود الحرارية3. تم استخدام نقاط نهاية مختلفة ، مثل الوفيات والفشل في التطور وفقدان الحركة ، لتحديد الحدود الحرارية العليا والسفلى4. غالبا ما تعتبر هذه الحدود الحرارية بديلا عن المكانة الحرارية للكائن الحي. تستخدم هذه المعلومات بدورها لتحديد الأنواع الأكثر عرضة للاحترار العالمي ، وكذلك التنبؤ بتوزيع الأنواع في المستقبل وتفاعلات الأنواع الناتجة3،5،6،7. ومع ذلك ، فإن تحديد الحدود الحرارية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الصغيرة العوالق ، يمكن أن يكون صعبا.

بالنسبة للكائنات العوالق ، وخاصة المراحل اليرقية لللافقاريات البحرية ، يمكن تحديد الحد الحراري من خلال التعرض المزمن. يتم تحقيق التعرض المزمن عن طريق تربية اليرقات في درجات حرارة متعددة على مدى أيام إلى أسابيع وتحديد درجة الحرارة التي ينخفض عندها بقاء اليرقات و / أو معدل نموها8،9،10. ومع ذلك، فإن هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ويتطلب حاضنات كبيرة وخبرة في تربية اليرقات (انظر المرجع11 للحصول على مقدمة جيدة لاستزراع يرقات اللافقاريات البحرية).

بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التعرض الحاد للإجهاد الحراري لتحديد الحدود الحرارية. في كثير من الأحيان ، يتضمن نهج التحديد هذا وضع قوارير صغيرة مع اليرقات في الحمامات الجافة التي يتم التحكم في درجة حرارتها 12،13،14 ، والاستفادة من وظائف التدرج الحراري في أجهزة التدوير الحراري PCR 15،16 ، أو وضع قوارير زجاجية / أنابيب طرد مركزي دقيقة على طول التدرج الحراري الناتج عن التسخين والتبريد المطبقين على نهايات كتل الألمنيوم الكبيرة مع ثقوب تتناسب فيها القوارير بشكل مريح 17 ، 18,19. الحمامات الجافة النموذجية تولد درجة حرارة واحدة. وبالتالي ، يجب تشغيل وحدات متعددة في وقت واحد لتقييم الأداء عبر مجموعة من درجات الحرارة. تولد أجهزة التدوير الحراري تدرجا ولكنها تستوعب فقط حجم عينة صغير (120 ميكرولتر) وتتطلب معالجات دقيقة. على غرار الدراجات الحرارية ، تخلق كتل الألمنيوم الكبيرة تدرجات حرارية خطية ومستقرة. يمكن أن يقترن كلا النهجين بالانحدار اللوجستي أو المحتمل لحساب درجة الحرارة المميتة ل 50٪ من السكان (LT50) 12،20،21. ومع ذلك ، كانت كتل الألمنيوم المستخدمة ~ 100 سم. يتطلب هذا الحجم مساحة معملية كبيرة وإمكانية الوصول إلى آلات طحن التحكم العددي المتخصصة بالكمبيوتر لحفر الثقوب. جنبا إلى جنب مع استخدام حمامين مائيين من الدرجة البحثية للحفاظ على درجة الحرارة المستهدفة ، فإن التكلفة المالية لتجميع الإعداد مرتفعة.

لذلك ، يهدف هذا العمل إلى تطوير وسيلة بديلة لتوليد تدرج درجة حرارة خطي مستقر مع الأجزاء المتاحة تجاريا. يجب أن يكون لمثل هذا المنتج بصمة صغيرة ويجب أن يكون قابلا للاستخدام بسهولة في تجارب التعرض للإجهاد الحراري الحاد للكائنات العوالق. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام العوالق الحيوانية التي يبلغ حجمها <1 مم ككائنات مستهدفة ، وبالتالي ، تم تحسينها لاستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 أو 2 مل. ستتطلب الكائنات الحية الأكبر حجما حاويات أكبر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المستخدمة والثقوب المتضخمة في كتل الألومنيوم.

بالإضافة إلى جعل الجهاز التجريبي أكثر سهولة ، يهدف هذا العمل إلى تبسيط خط أنابيب معالجة البيانات. بينما توفر البرامج الإحصائية التجارية إجراءات روتينية لحساب LT50 باستخدام الانحدار اللوجستي أو المحتمل ، فإن تكلفة الترخيص ليست تافهة. لذلك ، فإن البرنامج النصي سهل الاستخدام الذي يعتمد على البرنامج الإحصائي مفتوح المصدر R22 سيجعل تحليل البيانات أكثر سهولة.

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن تصنيع كتلة حرارية مدمجة بأجزاء متاحة تجاريا وتطبيقها على تعريض العوالق الحيوانية (يرقات الدولار الرملي Dendraster excentricus) للإجهاد الحراري الحاد لتحديد الحد الحراري الأعلى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع كتلة الحرارة

  1. قم بتوصيل سخان الشريط 120 فولت ، 100 واط بمقاومة متغيرة (انظر جدول المواد).
  2. قم بإعداد كتلة 20.3 سم × 15.2 سم × 5 سم (8 بوصات × 5 بوصات × 2 بوصة) من الألومنيوم عن طريق حفر 60 ثقبا في شبكة 6 × 10 (انظر جدول المواد). تأكد من أن الثقوب متباعدة 2 سم من المركز إلى المركز في كلا الاتجاهين. يجب أن يكون قطر كل منها 1.1 سم وعمقها 4.2 سم (الشكل 1).
    ملاحظة: قم بإجراء الحفر على آلة طحن أو مكبس حفر باستخدام لقم حفر فولاذية عالية السرعة. تم اختيار كل من عنصر التسخين وعنصر التبريد لتغطية أكبر قدر ممكن من سطح التلامس للأسطح 15.2 سم × 5 سم.
  3. قم بحفر فتحتين إضافيتين على أحد الأسطح مقاس 20.3 سم × 5 سمبين العمود 1 و 2 والعمود9 و 10 ، بما يتوافق مع حجم مجسات التحكم في درجة الحرارة (انظر جدول المواد).
  4. قم ببناء علبة من ألواح الأكريليك الشفافة مقاس 1.2 سم (0.5 بوصة) (انظر جدول المواد) لتثبيت العناصر في مكانها وعزل الكتلة الحرارية المكتملة. استخدم طبقتين من الأكريليك لعزل الجانب الخلفي من عنصر التسخين (الشكل 1).
  5. في التجميع النهائي ، ضع عجينة حرارية (انظر جدول المواد) لزيادة التوصيل الحراري من عنصر التسخين إلى الكتلة ومن الكتلة إلى عنصر التبريد.

2. تحديد إعدادات التدرج الحراري

  1. قم بتوصيل حمام الماء / مبرد الحوض بأنابيب Tygon (انظر جدول المواد). اعزل الأنبوب بعزل الأنابيب الرغوية حسب الحاجة.
  2. أدخل مسبار الترموستات في الثقوب الموجودة على جانب كتلة الألومنيوم. تأكد من وضع المسبار 1 بالقرب من عنصر التسخين.
  3. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المملوءة حتى أسنانها (1.5 مل) بماء الصنبور في جميع الثقوب المطحونة (إجمالي 60 أنبوبا).
  4. قم بتشغيل جهاز التحكم في درجة الحرارة واضبط درجة حرارة إيقاف التسخين للمسبار من 1 إلى 35-37 درجة مئوية والتحقيق من 2 إلى 21.5-22.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: يحتوي منظم الحرارة المقترح على منفذين يعملان بشكل مستقل ؛ يتم استخدام المسبار 1 فقط لتنظيم درجة الحرارة الدافئة في حالة الاستخدام هذه. لذلك ، اضبط درجة حرارة المسبار 2 على درجة حرارة النهاية المنخفضة.
  5. قم بتدوير مقاومة متغيرة لتشغيل عنصر التسخين واضبطه على متوسط.
  6. قم بتشغيل مبرد الحمام المائي / حوض السمك واضبط درجة حرارة المبرد على 15 درجة مئوية.
  7. تأكد من أن الكتلة دافئة من أحد طرفيها وتبرد من الطرف الآخر بعد 10 دقائق.
    تنبيه: يمكن أن تكون الأطراف المكشوفة لعنصر التسخين ساخنة ؛ لا تلمسهم.
  8. تحقق من درجة الحرارة داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام مزدوج حراري مع قطب كهربائي من النوع K (انظر جدول المواد) كل 10 دقائق بعد ذلك. سوف تستقر درجة الحرارة بعد ~ 60 دقيقة وتظهر خطية (الشكل 2).
  9. اضبط قيم نقاط النهاية عن طريق تغيير إعدادات وحدة التحكم في درجة الحرارة والحمام المائي حسب الحاجة.

3. التعرض الحراري والعيش: التعداد الميت

ملاحظة: يمكن حذف الخطوة 2 بمجرد تحديد الإعدادات المطلوبة لتدرج درجة الحرارة.

  1. قم بتشغيل حمام الماء والسخان المعاد تدويرهما واضبطهما على 15 درجة مئوية و 37 درجة مئوية ، على التوالي ، لتوليد تدرج درجة الحرارة من 19.5 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية.
  2. للتأكد من أن التدرج الحراري خطي ، ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المملوءة حتى أسنانها (1.5 مل) بماء الصنبور في جميع الثقوب المطحونة (إجمالي 60 أنبوبا).
  3. دع كتلة الحرارة تصل إلى درجة الحرارة المحددة بالانتظار 45-60 دقيقة. تحقق من درجة الحرارة داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام مزدوج حراري مع قطب كهربائي من النوع K لمعرفة ما إذا كان قد وصل إلى درجة الحرارة المتوقعة. لاحظ درجات الحرارة هذه.
  4. إذا كان حجم الكائنات الحية التي خضعت للدراسة >500 ميكرومتر ويمكن نقلها بسهولة من حاوية إلى أخرى (على سبيل المثال ، مجدافيات الأرجل) ، املأ أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ب 750 ميكرولتر من مياه البحر المفلترة 0.45 ميكرومتر. بدلا من ذلك ، إذا كانت الكائنات الحية التي خضعت للدراسة صغيرة ، فقم بملء أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ب 250 ميكرولتر من مياه البحر المفلترة 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية ، تم استخدام يرقات الدولار الرملي Dendraster excentrics ، والتي هي 2 و 4 و 6 أيام بعد الإخصاب (انظر جدول المواد). كان متوسط حجم هؤلاء الأفراد (± S.D. ، ن = 15 لكل عمر) 152 ± 7 ميكرومتر و 260 ± 17 ميكرومتر و 292 ± 14 ميكرومتر على التوالي. بالنظر إلى أن هذه اليرقات يمكن أن تتركز بسهولة (الخطوة 3.5) ، تم ملء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ب 750 ميكرولتر من مياه البحر المفلترة.
  5. تركيز ثقافة الكائنات الحية للدراسة مع الترشيح العكسي (أي وضع الشبكة في الحاوية التي تحمل الكائنات الحية للدراسة وإزالة الماء من خلال الجزء العلوي من الشبكة) ، بحيث تبقى الكائنات الحية للدراسة في الجزء السفلي من الدورق11.
    ملاحظة: تم استخدام شبكة نايلون 30 ميكرومتر لدولارات رمل اليرقات المدروسة (انظر جدول المواد).
  6. شطف عينة الحيوانات المركزة بمياه البحر المفلترة (على سبيل المثال ، عند الزراعة بمواد غذائية طحالبية أو مواد كيميائية أخرى). كرر الترشيح العكسي مرة أخرى لتركيز عينة الحيوان.
  7. ضع عددا معروفا من الكائنات الحية الفردية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة نصف المملوءة. عد الكائنات العوالق الصغيرة تحت مجهر تشريح (انظر جدول المواد) وانقلها باستخدام ماصات باستور الزجاجية.
    ملاحظة: يعتمد عدد الكائنات الحية التي يجب وضعها على الحجم. بالنسبة لدولارات رمل اليرقات التي كان حجمها ~ 200 ميكرومتر ، كان 20 فردا لكل أنبوب طرد مركزي دقيقا مناسبا.
    تنبيه: الماصات الزجاجية مرغوبة أكثر من الماصات البلاستيكية لأن بعض الكائنات الحية العوالق كارهة للماء وستلتصق بالأسطح البلاستيكية.
  8. أضف 0.45 ميكرومتر من مياه البحر المفلترة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على حتى يصبح الحجم النهائي 1 مل.
  9. للسماح للكائنات الحية بالتسخين تدريجيا إلى درجة الحرارة التجريبية المطلوبة ، ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع الحيوانات ، المعدة في الخطوة 3.7 ، في كتلة الحرارة بدءا من النهاية الباردة. ضع أزواجا من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة على كل صف (إجمالي 12 أنبوبا).
  10. انتظر 10 دقائق.
  11. انقل أزواج أنابيب الطرد المركزي الدقيقة التي تم إدخالها في الخطوة 3.9 إلى الثقوب المحفورة المجاورة ذات درجات الحرارة الأكثر دفئا. ضع أزواجا إضافية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في كل صف في الطرف البارد. سيحتوي كل صف الآن على أربعة أنابيب. انتظر 10 دقائق أخرى.
  12. استمر في إضافة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع الحيوانات عن طريق تحويل مواقعها من الطرف الأكثر برودة إلى الطرف الأكثر دفئا في أزواج. انتظر 10 دقائق بين كل وردية حتى تمتلئ كتلة الحرارة تماما.
    ملاحظة: تعتبر الخطوات 3.9-3.12 مرحلة تكثيف لزيادة درجة الحرارة التي تعاني منها الكائنات الحية الخاضعة للدراسة تدريجيا.
  13. دع الحيوانات تحضن عند درجة الحرارة المحددة لمدة 2 ساعة. هذه الخطوة هي مرحلة التعرض لدرجة حرارة ثابتة من التجربة.
    1. تحقق من درجة حرارة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع الحرارية كل ساعة إذا تجاوزت فترة الحضانة 2 ساعة.
      ملاحظة: اضبط وقت الحضانة بناء على الاحتياجات التجريبية. إذا كانت الحضانة أطول من 2 ساعة ، فتحقق من درجة حرارة الأنابيب على فترات زمنية منتظمة مع المزدوجة الحرارية في حالة حدوث عطل غير متوقع في المعدات. لتقليل إزعاج الكائنات الحية الخاضعة للدراسة ، ضع بشكل عشوائي ستة أو أكثر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المملوءة فقط بمياه البحر المفلترة في الكتلة لمراقبة درجة الحرارة.
  14. في نهاية فترة الحضانة ، قم بقياس درجة الحرارة داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام مزدوج حراري مع قطب كهربائي من النوع K. لاحظ درجات الحرارة هذه.
  15. قم بإزالة جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة البالغ عددها 60 أنبوبا مع الحيوانات وضعها في حوامل ملصقة مسبقا.
  16. احتضان الأنابيب (الخطوة 3.14) عند درجة حرارة محددة مسبقا ، مثل درجة حرارة التربية ، لمدة 1 ساعة ، وهي فترة الاسترداد.
    ملاحظة: يمكن أن تكون فترة الاسترداد خاصة بالأنواع. بالنسبة لدولار رمل اليرقات ، كانت درجة حرارة التربية 18 درجة مئوية ، وبالتالي تم وضع العينة في غرفة بيئية. استشر الأدبيات ذات الصلة و / أو قم بإجراء تجربة تجريبية للتأكد من أن عدد الموتى الأحياء لم يتأثر بطول فترة التعافي. في البيانات التمثيلية ، كان عدد الحيوانات على قيد الحياة بعد 1 ساعة هو نفسه بعد 12 أو 24 ساعة من الشفاء.
  17. لتعداد نسبة كائن الدراسة الذي يبقى على قيد الحياة بعد التعرض الحراري ، انقل محتويات أنبوب طرد مركزي دقيق فردي إلى طبق بتري 35 مم باستخدام ماصة زجاجية.
  18. لاحظ ولاحظ العدد النسبي للأفراد الذين ما زالوا نشطين (على قيد الحياة) وأولئك الذين استولوا على السباحة أو ذابوا (ميتين) تحت مجهر التشريح. تأكد من أن العدد الإجمالي للأفراد الذين تمت ملاحظتهم يساوي عدد الأفراد الموضوعين في الأنابيب في الخطوة 3.7. تحقق من جانب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وطبق بتري للأفراد إذا كانت الأرقام غير متطابقة.

4. حساب LT50

  1. قم بإنشاء جدول بيانات بتنسيق CSV مع الرؤوس التالية على الأقل: تجميع متغير الاهتمام ، ودرجة حرارة الأنبوب في درجة مئوية ، وعدد الأفراد على قيد الحياة ، وعدد الأفراد القتلى.
    ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية ، يتم استبدال متغير التجميع محل الاهتمام بالعمر لأن الهدف هو المقارنة بين الفئات العمرية.
  2. لملاءمة البيانات مع الانحدار اللوجستي ، استخدم نموذجا خطيا معمما بتوزيع ذو حدين. يعرض ملف الترميز التكميلي 1 مثالا على نموذج برنامج نصي باستخدام البرنامج مفتوح المصدر R22.
  3. لتحديد الحد الحراري الأعلى المتوسط (LT 50) ، احسب قيمة المتنبئ (أي درجة الحرارة) التي نجا عندها50٪ من الأفراد. يعرض ملف الترميز التكميلي 2 مثالا على البرنامج النصي باستخدام الدالة dose.p من MASS23 في R22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد الحد الحراري الأعلى للعوالق الحيوانية. للقيام بذلك ، هناك حاجة إلى تدرج حراري مستقر وخطي. كان الإعداد المقترح قادرا على توليد تدرج حراري يتراوح من 14 درجة مئوية إلى 40 درجة مئوية عن طريق ضبط درجة حرارة حمام الماء على 8 درجات مئوية والسخان على 39 درجة مئوية (الشكل 2 أ). يمكن تضييق تدرج درجة الحرارة وإزاحته عن طريق تغيير قيم نقطة النهاية. كما تم إنشاء تدرج حراري بنطاق أضيق (19 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية) عن طريق ضبط السخان على 37 درجة مئوية والحمام المائي على 15 درجة مئوية. تستقر درجة الحرارة في الكتلة في غضون 45 دقيقة إلى 1 ساعة من الإعداد (الشكل 2 ب).

لتوضيح تطبيق هذا البروتوكول على العوالق الحيوانية ، تم فحص التغيير في الحد الحراري الأعلى ، المشار إليه بواسطة LT50 ، من خلال تطور الجنين في يرقات دولارات الرمال (Dendraster excentricus). تم الحصول على دولارات رملية جرافيد تجاريا (انظر جدول المواد). تم تحفيز إطلاق الجاميتات عن طريق حقن 0.5-1 مل من 0.35 M كلوريد البوتاسيوم. تم شطف البيض الذي تم جمعه من خلال شبكة نايلون 63 ميكرومتر مع 0.45 ميكرومتر من مياه البحر المفلترة. تم جمع الحيوانات المنوية جافة وحفظها على الجليد. تم تخصيب البويضات في ~ 104 الحيوانات المنوية لكل مل. تم إنشاء مزارع الحدائق الشائعة باستخدام الأمشاج من ثلاثة ذكور وثلاث إناث بمعدل خمسة أفراد لكل مل. تم الاحتفاظ بهذه المزارع اليرقية في مياه البحر المفلترة بملوحة 32 psu عند 18 درجة مئوية تحت دورة 12:12 للضوء المظلم مع تغير كامل للمياه كل يومين.

مع تطور دولارات رمل اليرقات ، زاد الحد الحراري الأعلى من 28.6 درجة مئوية (± 0.02 درجة مئوية شرقا) في يومين بعد الإخصاب إلى 28.8 درجة مئوية (± 0.02 درجة مئوية جنوبا شرقيا) في 4 أيام بعد الإخصاب و 29.3 درجة مئوية (± 0.02 درجة مئوية جنوبا شرقيا) في 6 أيام بعد الإخصاب (الشكل 3). تشير هذه الحدود الحرارية العليا إلى أن الدولارات الرملية تعيش ضمن حدودها الحرارية خلال متوسط درجة حرارة سطح البحر في الصيف ~ 20 درجة مئوية أو أقل على طول ساحل المحيط الهادئ. ومع ذلك ، مع زيادة تواتر وشدة موجات الحر البحرية ، تستمر درجة الحرارة القصوى في الارتفاع. تم تسجيل درجة حرارة ذروة بلغت 26.4 درجة مئوية في جنوب كاليفورنيا بايت في أغسطس 2018 (Fumo et al.24). بالنظر إلى أن هذا النوع يتكاثر في فصلي الربيع والصيف ، فمن المرجح أن يتضاءل بقاء مرحلة حياته المبكرة خلال هذه الأحداث المتطرفة. سينخفض معدل البقاء على قيد الحياة المتوقع بنسبة 10٪ عندما تصل درجة الحرارة إلى 26.5 درجة مئوية.

تشير المقارنات الزوجية باستخدام اختبار النسبة الذي طوره Wheeler et al.25 إلى أن متوسط درجة الحرارة المميتة كان مختلفا بشكل كبير بين الفئات العمرية الثلاث (p < 0.001). كانت المراحل المبكرة (المعدة والمنشورات المبكرة التي كانت عمرها 2 أيام) أكثر حساسية للإجهاد الحراري من اليرقات القديمة. تشير هذه الملاحظة إلى أن الحد الحراري المستنبط من نقطة زمنية واحدة من التطور لا يمثل هذا النوع طوال تاريخ حياته.

Figure 1
الشكل 1: الشكل المسمى للكتلة الحرارية. (أ) منظر علوي للإعداد مع توصيل جميع المكونات. (ب، د) وضع ووصلات لأطراف السخان. (ج، هاء) وضع المبادل الحراري (التبريد elemenet) والأنابيب المرتبطة به إلى حمام مائي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تغيرات درجة الحرارة في الكتلة الحرارية خلال 1 ساعة مع ضبط نقطتي النهاية على 15 و 37 درجة مئوية . (أ) تحقق تدرج خطي خلال 1 ساعة. يؤدي التغيير في إعدادات نقطة النهاية إلى تغيير نطاق درجة الحرارة ، وكان النطاق الأكبر من 14 درجة مئوية إلى 40 درجة مئوية. (ب) كان الفرق في درجة الحرارة بين الصفوف المكررة ضئيلا (<0.8 درجة مئوية)؛ تم رسم البيانات من صفين متماثلين لكل إعداد في (B). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: بقاء اليرقات الرملية على قيد الحياة (Dendraster excentricus) عبر نطاق درجة حرارة من 19 إلى 37 درجة مئوية من خلال تطور الجنين (2 و 4 و 6 أيام بعد الإخصاب [dpf]). يمثل كل مسند نسبة اليرقات التي نجت من حضانة 2 ساعة عند درجة حرارة محددة تليها فترة نقاهة 1 ساعة. تم إجراء انحدار لوجستي باستخدام النموذج الخطي المعمم مع التوزيع ذي الحدين في البرنامج الإحصائي R. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ملف الترميز التكميلي 1: برنامج نصي R لإنشاء منحنيات لوجستية لمجموعة البيانات مع مثال خطوة بخطوة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

ملف الترميز التكميلي 2: برنامج نصي R لإنشاء تقديرات LT50 . الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهجا يمكن الوصول إليه وقابل للتخصيص لتحديد الحدود الحرارية لكائنات العوالق الصغيرة من خلال التعرض الحراري الحاد. يتيح التصميم المكون من 10 ثقوب ونقاط نهاية درجة الحرارة المرنة ، التي يتم التحكم فيها بواسطة حمام مائي في الطرف السفلي والسخان في الطرف العلوي ، تحديد LT50 بدقة. باستخدام هذا النهج ، يمكن اكتشاف اختلاف في الحد الحراري الذي يبلغ <1 درجة مئوية (الشكل 3). يوفر هذا النهج تحديدا سريعا للحدود الحرارية (بالساعات) لمجموعة متنوعة من الأنواع ، وقد تم تطبيق القيم الناتجة على نماذج توزيع الأنواع المتعددة 2,21. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن التعرض الحاد من المحتمل أن يوفر تقديرا مختلفا للتحمل الحراري عند مقارنته بالتعرض المزمن 8,26.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية للتصميم الحالي في تضمين 10 معالجات حرارية وستة مكررات ضمن مساحة صغيرة (20.3 سم × 15.2 سم × 5 سم). استخدمت المنشورات السابقة باستخدام نهج التدرج الحراري المماثل لتحديد الحدود الحرارية قضبان الألمنيوم الأكبر (180 سم × 10 سم × 6 سم في 27 ، 91 سم × 25 سم × 15 سم في 10 ، و 60 سم ×20 سم في 17). في حين أن الحمامات الجافة التي تحمل درجة حرارة واحدة أصغر (على سبيل المثال ، 18.5 سم × 18.5 سم × 2.5 سم) وتقدم تكرارات متعددة ، هناك حاجة إلى عدة وحدات (أكثر من أربعة) لإنشاء منحنى أداء يتضمن درجات حرارة متعددة ، أو تحتاج التجارب إلى تكرارها بمرور الوقت مما قد يؤدي إلى عوامل مربكة. يقلل تصميم الكتلة الحرارية من تكلفة التصنيع ومتطلبات المساحة. يمكن إكمال التصنيع باستخدام مكبس حفر ، أو يمكن للباحثين الذين ليس لديهم وصول فوري إلى آلة الطحن اختيار خدمات التصنيع باستخدام الحاسب الآلي التجارية. استخدام الأجزاء المتاحة تجاريا يتحكم بشكل أكبر في تكلفة التصنيع. إذا كان بإمكان المرء استخدام حمام مائي للتدفئة / التبريد أو مبردات أحواض السمك ، فإن التكلفة المتبقية للأجزاء تصل إلى أقل من 350 دولارا. خلاف ذلك ، يمكن شراء مبردات أحواض السمك لحوض أسماك سعة 10 جالون (~ 35 لترا) مقابل 150 دولارا <.

يمكن تعديل التصميم الحالي ليناسب احتياجات الباحث. إذا كانت الكائنات المستهدفة أكبر حجما ، فإن قوارير التلألؤ هي حاويات بديلة جيدة ، وستكون هناك حاجة إلى ثقوب أكبر. ومع ذلك ، فإن كتلة الألومنيوم قابلة للإزالة في التصميم الحالي ، لذلك يمكن صنع كتل متعددة وتبديلها لتناسب الاحتياجات التجريبية. إذا كان الهدف من التجربة هو تحديد حد حراري أقل أو التركيز على الكائنات القطبية ، فإن وضع كتل مائية مبردة على طرفي كتلة الألومنيوم الرئيسية يكون أكثر ملاءمة.

على غرار الدراسات الأخرى حول العوالق الحيوانية ، لا يتضمن البروتوكول الحالي مرحلة تبريد تدريجية20,27. يمكن للباحثين التفكير في إزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في أزواج وتحويلها إلى أسفل تدرج درجة الحرارة (أي عكس الخطوات 3.9-3.12) لتحقيق التبريد التدريجي إذا كانت الكائنات الحية التي درسوها حساسة لانخفاض مفاجئ في درجة الحرارة.

يمكن أن تتضاءل فائدة هذا الإعداد من خلال عدة عوامل ، وهي اختيار (1) إعدادات درجة حرارة نقطة النهاية ، (2) مدة التعرض والاسترداد ، و 3) المقياس المستخدم لتحديد الحالة ذات الحدين (حي مقابل ميت ؛ متطور مقابل غير مطور). لمعالجة هذه القيود المحتملة ، يوصى بشدة بإجراء اختبار أولي.

نظرا لأن الانحدار اللوجستي يفترض توزيعا ذا حدين ، يفضل نقاط النهاية مع البقاء على قيد الحياة والوفيات بنسبة 100٪. وبالنسبة للكائنات البحرية، سيكون نطاق البداية المعقول هو متوسط درجة حرارة سطح البحر السنوية لموقع الجمع زائد 10-15 درجة مئوية. يمكن للمرء بعد ذلك تضييق نطاق درجة الحرارة الذي تم فحصه بعد هذه التجربة الأولية ، حيث أنه كلما كان الفرق في درجة الحرارة بين الثقوب أصغر ، كلما كان تقدير LT50 أكثر دقة.

مدة التعرض والانتعاش خاصة بالأنواع. على سبيل المثال ، سمح Kuo et al.27 للصغار (Nucella canaliculata) بالتعافي لمدة 24 ساعة ، بينما سمح Hammond et al.28 للقنافذ الأرجوانية اليرقية (Stronglylocentrotus purprtaus) 1 ساعة للتعافي. يمكن للمرء إجراء تجربة قصيرة لتحديد ما إذا كان عدد الأحياء والموتى يختلف بين فترات التعافي. اعتمادا على تعريف الحالة ذات الحدين المختارة (على سبيل المثال ، الأحياء مقابل الأموات) ، قد لا يكون وقت التعافي ضروريا. إذا كان الهدف من التجربة هو اختبار ما إذا كانت العمليات التنموية ، مثل الانقسام والمعدة ، تحدث عبر نطاق من درجات الحرارة. بمعنى آخر ، سيتم تطوير الحالة ذات الحدين المستخدمة في النموذج مقابل عدم تطويرها8،19،21. يجب إضافة مثبتات مثل 4٪ بارافورمالدهيد إلى العينات في فترة التعرض الحراري دون أي وقت استرداد.

لضمان العد الدقيق وتحديد الحالة ذات الحدين (الحي مقابل الميت ؛ المتقدمة مقابل غير المطورة) ، ينصح بحساب العينات بعد وقت الاسترداد بترتيب عشوائي لتجنب تحيزات المراقب المحتملة. إذا كان هناك عدد كاف من الموظفين ، يمكن للباحثين المختلفين حساب الصفوف المكررة ومقارنة نتائجهم. بدلا من ذلك ، يمكن للأفراد عد مجموعة فرعية صغيرة من العينات بشكل متكرر والتحقق مما إذا كانت الأرقام متسقة.

هناك قيد محتمل آخر يتمثل في عدم وجود تقدير للخطأ في LT50 من عينات مستقلة29. توفر طريقة تحليل البيانات الحالية فاصل ثقة بنسبة 95٪ على طول المنحنى اللوجستي المجهز (ملف الترميز التكميلي 1) وخطأ قياسي في LT50 (ملف الترميز التكميلي 2). يتم إنشاء حدود الخطأ هذه من عملية تركيب المنحنى ، وليس من خلال قياسات متعددة للأفراد من مجتمع العينة. نظرا لأن تصميم الكتلة الحرارية الحالي يحتوي على ستة صفوف ، يمكن للمرء أن يلائم البيانات من كل صف لإنشاء ستة تقديرات LT50 والحصول على تقديرات الخطأ القائمة على الملاحظة.

باختصار ، يتم تقديم نهج يمكن الوصول إليه لتحديد الحدود الحرارية الحادة التي يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من العوالق الحيوانية. يمكن استخدام هذا الإعداد لتحديد الحدود الحرارية للكائنات الحية المختلفة وتحديد مراحل التطور المعرضة للخطر. يمكن أن تساعد هذه المعلومات في تحسين التنبؤ بأداء الكائنات الحية والتفاعلات المجتمعية المحتملة في مواجهة تغير المناخ العالمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح يعلنونه.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس في كلية سوارثمور [KC] وزمالة روبرت رينولدز ولوسيندا لويس 70 الصيفية للأبحاث ل BJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W		 McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -w, Li, X. -x, Wang, J., Dong, Y. -w Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , Humana Press. Totowa, NJ. 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. https://www.R-project.org/ (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , Springer. (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).

Tags

علم الأحياء، العدد 189، درجة الحرارة المميتة، الحد الأقصى الحراري الحرج، الحدود الحرارية العليا، الاحترار العالمي، الإجهاد الحراري، يرقات اللافقاريات البحرية
تحديد الحدود الحرارية للعوالق الحيوانية باستخدام كتلة حرارية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K.,… More

Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter