Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את בידוד התאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט לצורך יישום פוטנציאלי במחקרי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח ביטוי גנים. בהקשר של ויסות גדילת העין וקוצר ראייה, RPE ככל הנראה ממלא תפקיד כממסר תאי לאותות מודולריים לגדילה, שכן הוא ממוקם בין הרשתית לשני קירות העין, כגון כורואיד וסקלרה. בעוד פרוטוקולים לבידוד RPE פותחו הן עבור אפרוחים והן עבור עכברים, פרוטוקולים אלה הוכיחו כי אינם ניתנים לתרגום ישיר לשרקן, שהפך למודל קוצר ראייה חשוב ונפוץ של יונקים. במחקר זה נעשה שימוש בכלים של ביולוגיה מולקולרית כדי לבחון את הביטוי של גנים ספציפיים כדי לאשר שהדגימות היו נקיות מזיהום מהרקמות הסמוכות. הערך של פרוטוקול זה כבר הוכח במחקר RNA-Seq של RPE משרקנים צעירים בעלי פיגמנט שנחשפו לקוצר ראייה אופטי הגורם לקוצר ראייה. מעבר לוויסות גדילת העיניים, לפרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים נוספים במחקרים על מחלות רשתית, כולל מקולאופתיה קוצרת ראייה, אחד הגורמים המובילים לעיוורון במיופים, שבהם RPE היה מעורב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ולאחר שהשתכללה, מניבה דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות ללימודי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח RNA.
Introduction
RPE מורכב משכבה ייחודית של תאים פיגמנטיים הממוקמים בין הרשתית העצבית לבין כורואיד כלי הדם, ול- RPE תפקידים מוכרים היטב בפיתוח ותחזוקה של תפקוד רשתית תקין, כולל פוטוטרנסדוקציה 1,2. לאחרונה, RPE הוקצה תפקיד מפתח נוסף בוויסות צמיחת העין3, ובכך התפתחות קוצר ראייה4. משימה זו מבוססת על המיקום הקריטי של ה-RPE, המשולב בין הרשתית לכורואיד ועל ההסכמה הרחבה כיום שצמיחת העין, ולכן שגיאות שבירה, מווסתות באופן מקומי5. ה-RPE ממלא תפקיד מפתח כממסר אותות, המקשר בין הרשתית, המקור המשוער של אותות מודולריים לגדילה, לכורואיד ולסקלרה, שתי המטרות של האותות המועברים 6,7,8.
העלייה באורך הציר המאפיינת את רוב קוצר הראייה אינה יכולה להיחשב שפירה, כאשר שינויים פתופיזיולוגיים המערבים את הרשתית, כורואיד ו / או סקלרה מייצגים תוצאות בלתי נמנעות וכעת מוכרות היטב של התארכות עיניים מוגזמת 7,9. בהקשר זה, RPE הוא אולי הפגיע ביותר, שכן, בהיותה רקמה לא מיטוטית, היא מסוגלת להכיל רק את חדר הזגוגית המתרחב על ידי מתיחה ודילול של תאים בודדים. בעוד שתפקידו בפתולוגיות הקשורות לקוצר ראייה, כגון ניוון מקולרי קוצר ראייה, עדיין לא הובן במלואו, RPE היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות רשתית אחרות, כולל ניוון גיאוגרפי, אחד הגורמים המובילים לעיוורון, הקשור להפרעות מתועדות ברשתית, RPE, וכורואיד10,11, 12.
הבידוד המוצלח של תאי RPE, ללא זיהום מרקמות עיניים סמוכות, עשוי לפתוח הזדמנויות מחקר רבות להשגת תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מגוון מחלות עיניים/רשתית. עם זאת, הבידוד של RPE הוכח כמאתגר, כאשר מחקרים רבים שפורסמו עשו שימוש בדגימות רשתית / RPE משולבות או RPE / כורואיד מסיבה זו13,14,15. מחקרים הכרוכים בבידוד מוצלח של RPE באיכות המתאימה ללימודי ביולוגיה מולקולרית הוגבלו לעיני אפרוחים ועכבר16,17. לדוגמה, שיטת בידוד RPE וייצוב RNA בו זמנית (SRIRS) שתוארה על ידי וואנג ואחרים 18. כדי לבודד תאי RPE בעכברים לא נראה לעבוד טוב בעיני שרקן. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג חידוד של גישה שבתחילה יוצרה אבטיפוס עם עיני חורש עצים על ידי אחד המחברים (M.F.) והוכחה כמניבה דגימות RPE באיכות גבוהה, המתאימות לניתוח RNA וביולוגיה מולקולרית אחרת, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הטיפול בבעלי חיים והטיפולים ששימשו במחקר זה תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בברקלי.
1. חינוך עין השרקן
- המתת חסד של שרקן עם הזרקה תוך לבבית של נתרן pentobarbital מועבר תחת הרדמה (5% isoflurane בחמצן).
- לחנך את העיניים בעזרת מלקחיים ומספריים, ומיד להעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס"מ עם מלח סטרילי פוספט חוצץ (PBS) לשטיפה. העבירו את העיניים לתמיסת PBS טרייה.
הערה: צלחת 6 בארות המכילה 4 מ"ל תמיסה לכל באר מומלצת.
2. בידוד של העין האחורית העין וקומפלקס RPE/כורואיד/סקלרה
- בעזרת מיקרוסקופ מנתח, השתמשו במחט 18G כדי לבצע חתך קטן ראשוני בסקלרה, בערך 1.0 מ"מ מאחורי גבול הגפיים (כלומר, בין הקרנית לסקלרה) (איור 1A); לאחר מכן השתמש במספריים כדי להסיר את החלק הקדמי, כולל הקרנית, הקשתית, הגוף הריסי והעדשה הגבישית.
- לאחר מכן, בעבודה עם העין הנותרת של מקטע העין האחורי, לנתק את הרשתית מקומפלקס RPE/choroid/sclera; השתמשו במלקחיים כדי לתפוס תחילה ואז למשוך בעדינות בזונולה של, ואז לקלף בהדרגה את הרשתית ללא פיצול (איור 1B).
הערה: אין לתפוס את הרשתית ישירות כדי למנוע פיצול רשתית ובידוד רקמת רשתית חלקי. השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב דיסקציה זה.
3. בידוד RPE מהכורואיד
- לאחר הסרת הרשתית לחלוטין, טבלו את העין האחורית הנותרת, הכוללת את RPE, כורויד וסקלרה, בריאגנט אחסון רקמות למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
הערה: השתמש בצלחת של 12 בארות עם בארות מזוהות, שכל אחת מהן מלאה ב- 2 מ"ל של מגיב אחסון הרקמות. - מעבירים את העין לבאר אחרת מלאה ב-4 מ"ל PBS למשך 10 שניות לפני שמעבירים אותה לבאר שלישית מלאה ב-2 מ"ל PBS.
- חבר מחט 30 גרם למזרק 1 מ"ל מלא PBS לשלב הבידוד הסופי של RPE. לדחוף בעדינות על המזרק כדי ליצור זרם סילון של PBS; ראשית, כוונו את הזרם הזה אל ה-RPE כדי ליצור בו קרע קטן או חור, ואז כוונו את זרם PBS לתוך הפתח שנוצר כדי לנתק את ה-RPE כיריעה מהכורואיד (איור 1C).
הערה: הניתוק של RPE כגיליון מניב את מדגם RPE הגדול ביותר. שוב, השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב זה. - לאחר ניתוק ה-RPE מהכורואיד (איור 1D), אספו את רקמת ה-RPE במזרק 1 מ"ל ללא מחט, ולאחר מכן העבירו את הדגימה שנאספה לצינור של 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם RPE שנאסף ב-8,000 × גרם למשך דקה אחת כדי לקבל גלולת RPE (איור 2A).
- השליכו את תמיסת PBS והחליפו אותה ב-350 מ"ל של חיץ ליזיס, כפי שנכלל בערכות בידוד RNA (ראו טבלת חומרים); פיפטה 20x לערבב, ובכך לשמור על איכות המדגם. לאחסון ושימור לטווח ארוך יותר, העבירו את הדגימות למקפיא בטמפרטורה של 80°C-.
הערה: מאגר הליזה הוא רכיב קנייני של ערכת בידוד RNA עבור ליזה של תאים ורקמות לפני בידוד RNA ובידוד RNA/DNA/חלבון בו זמנית. כדי להשבית את הרנ"א בליזט, הקפד להוסיף β-מרקפטואתנול למאגר הליזיס (10 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול לכל 1 מ"ל של חיץ ליזיס).
4. מיצוי RPE-RNA
- השתמש בערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) כדי לבודד ולאסוף את הרנ"א מדגימות RPE בהתאם להוראות היצרן שסופקו. להעריך את איכות הדגימה באמצעות אלקטרופורזה.
הערה: הפרוטוקול המתואר הניב מוצר באיכות טובה (כלומר, מספר שלמות RNA [RIN] מעל 8.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח דגימות RPE שנאספו באמצעות הפרוטוקול לעיל הראה רנ"א שמור היטב (RIN >8.0, איור 2B), עם 240.2 ננוגרם ± 35.1 ננוגרם לעין (n = 8, NanoDrop, איור 2B). כדי להעריך עוד יותר את איכות דגימות ה-RPE המבודדות, ובמיוחד את היעדר המזהמים הכורואידיים והסקלרליים, בחנו את ביטוי הגנים המייצגים של כל אחת מהרקמות האחרונות בדגימות RPE19. דגימות RPE הדגימו ביטוי גבוה משמעותית של Rpe65 (גן ספציפי ל-RPE) בהשוואה לרמות הביטוי של Rpe65 בכורואיד ובסקלרה (טבלה 1 ואיור 2C). לעומת זאת, דגימות RPE הראו ביטוי מינימלי של Col1a1, הגן הספציפי לכורויד-סקלרה שנבחר (איור 2D).
איור 1: נוהל איסוף יריעות RPE . (A) עין שרקן בת שבועיים עם חתך ראשון. (B) המקטע הקדמי (הקרנית, הקשתית והעדשה), הזגוגית והרשתית מופרדים מגביע העין האחורי (RPE, כורואיד וסקלרה). (C) זרם סילון של PBS, המועבר באמצעות מחט 30 G, משמש לנתק את RPE (D) כיריעה (חיצים שחורים) מהכורואיד. ההליך מהחתך הראשון ועד לאיסוף RPE אורך 5-7 דקות. קיצור: RPE = אפיתל פיגמנט ברשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נוהל הערכת האיכות של דגימות RPE מבודדות. (A) תמונה מייצגת של דגימת RPE בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לאחר שסובבה אותה כלפי מטה. (B) פלט ביואנלייזר מייצג עבור RNA המופק מדגימות RPE שנאספו. (ג,ד) רמות ביטוי הגנים של Rpe65, גן ספציפי ל-RPE, ו-Col1a1, שאינו מבוטא או מבוטא באופן מינימלי ב-RPE, נמדדו על ידי RT-qPCR בדגימות RPE, כורואיד וסקלרל מ-n = 3 בעלי חיים לא מטופלים; שני מערכי הנתונים נורמלו ל-β-actin. ** P < 0.01; P < 0.001. נתון זה שונה מ- Goto et al.19. קיצורים: RPE = אפיתל פיגמנט ברשתית; β-אקטין = בטא-אקטין ; Col1a1 = שרשרת קולגן מסוג I אלפא-1; Rpe65 = isomerohydrolase רטינואידי; RT-qPCR = תגובת שרשרת כמותית פולימראז בשעתוק הפוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| גן | פריימר קדמי (5' עד 3') | פריימר הפוך (5' עד 3') | ||||
| צרפת | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| צרפת | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-אקטין | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
טבלה 1: רצפי נוקלאוטידים של הפריימרים המשמשים להגברת PCR בניתוח איכות המדגם. קיצורים: β-אקטין = בטא-אקטין ; Col1a1 = קולגן סוג I אלפא 1 שרשרת; Rpe65 = רטינואיד איזומרוהידרולאז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה נתאר שיטה לבידוד RPE, המתאימה לניתוח ביטוי גנים של RPE, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנטים. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא מניב דגימות RPE באיכות גבוהה שהן יחסית חופשיות מזיהום, עם RNA שנשמר כראוי לניתוחים ספציפיים ל-RNA, ועם זאת, הוא פשוט ויעיל יחסית. בעוד שבדוגמה המובאת כאן, דגימות RPE נאספו מעיניו של שפן ניסיונות צעיר (בן שבועיים), הפרוטוקול שימש בהצלחה גם לאיסוף דגימות RPE מבעלי חיים מבוגרים (בוגרים צעירים).
עבור חוקרים עם ניסיון קודם מינימלי עם ניתוח עיניים או דיסקציה, פרוטוקול שלב 2.1 ושלב 2.2 יכול להיות מאתגר. הפרט הקריטי בשלב 2.1 הוא מיקום החתך הראשוני בסקלרה, אשר צריך להיות ממוקם במדויק 1.0 מ"מ מאחורי הלימבוס, כך הקשתית והעדשה יוסרו יחד עם הקרנית בעת ניתוק הקטע הקדמי. אם, במקום זאת, הקשתית נשארת מחוברת למקטע העין האחורי, זה מאתגר למצוא את הזונולה של, שהיא המפתח לניתוק מוצלח של הרשתית בשלב הבא. כפי שצוין בפרוטוקול, לניתוק מוצלח של הרשתית, חשוב גם שהרשתית לא תיתפס ישירות עם המלקחיים כדי למנוע את פיצולה. רשתית השרקן נראית שברירית יותר מרשתית העכבר, ככל הנראה בגלל טבעה האווסקולרי20. באופן אידיאלי, העין האחורית המבודדת, הכוללת את RPE, choroid ו- sclera, צריכה להיות שקועה בריאגנט אחסון רקמות תוך 5 דקות מרגע שאיבת העין כדי להבטיח שימור נאות של RNA בדגימת RPE שנאספת.
נראה כי שיטת SRIRS, שפותחה למטרה ספציפית של איסוף דגימות איכותיות של RPE מעיניהם של עכברים, השיגה מטרה זו עבור עיני עכבר; הוא מדווח כיעיל ואפקטיבי18. טכניקה זו שימשה בהצלחה גם לאיסוף RPE מעיני תורם אנושי בריא21. עם זאת, בהתבסס על ניסיונם של המחברים, שיטת SRIRS זו אינה מתאימה לאיסוף RPE מעיניהם של השרקן, העצים והאופוסום, אם כי הסיבות הבסיסיות לכך אינן ברורות. על ידי דיווח על הטכניקה המתוארת כאן כדי לבודד ולאסוף RPE מעיניהם של שרקנים צעירים, אנו מקווים לענות על צורך חשוב שלא נענה בתחום מחקר קוצר ראייה.
מבחינת מגבלות הפרוטוקול המתואר, העיקרי שבהם הוא הצורך בתקופה של הכשרה מעשית כדי להבטיח איסוף יעיל של דגימות, שכן הזמן לסיום הוא המפתח, בנוסף לטוהר דגימות RPE שנאספו. חוקרים שאין להם ניסיון עם מיקרודיסקציה או ניתוח עיניים יהיו זקוקים ביותר להכשרה. למרות שדווחו מספר שיטות בידוד RPE22,23, השיטה כמתואר כאן אינה מתאימה לתרביות תאי RPE או לניתוח חלבונים עקב שימוש בריאגנט מייצב RNA.
RPE כבר זמן רב מוכר לשחק תפקידים קריטיים לא רק בשמירה על הבריאות והתפקוד של הרשתית, אלא גם במחלות הקשורות. העובדה שה-RPE מוכר כיום גם כממלא תפקיד מפתח בוויסות גדילת העין ובהתפתחות קוצר ראייה הרחיבה במידה ניכרת את היקף שאלות המחקר, שעבורן היכולת לאסוף דגימות RPE באיכות גבוהה מעיניהם של שרקנים, כפי שמתואר כאן, או מיונקים אחרים המשמשים כמודלים של בעלי חיים עשויה להיות המפתח למתן תובנות חדשות. מחקרים כאלה עשויים גם להציע תובנות חדשות על הסיבוכים הפתולוגיים של קוצר ראייה, כולל מקולופתיה קוצר ראייה, אשר נתוני השכיחות שלה צפויים לעלות במקביל לנתוני השכיחות של קוצר ראייה כשלעצמם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל (S.G.), חוקר פוסט-דוקטורט ע"ש לוריס ודייוויד ריץ' (S.G.), ומענק מהמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY012392; סי' פ"ו).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
