Summary
Vi beskriver en enkel och effektiv metod för att isolera celler i retinala pigmentepitelceller (RPE) från ögonen på unga pigmenterade marsvin. Denna procedur möjliggör uppföljande molekylärbiologiska studier på den isolerade RPE, inklusive genuttrycksanalyser.
Abstract
Detta protokoll beskriver isoleringen av celler i retinalt pigmentepitel (RPE) från ögonen på unga pigmenterade marsvin för potentiell tillämpning i molekylärbiologiska studier, inklusive genuttrycksanalyser. I samband med ögontillväxtreglering och myopi spelar RPE sannolikt en roll som ett cellulärt relä för tillväxtmodulerande signaler, eftersom det ligger mellan näthinnan och de två väggarna i ögat, såsom choroid och sclera. Medan protokoll för isolering av RPE har utvecklats för både kycklingar och möss, har dessa protokoll visat sig inte vara direkt översättbara till marsvinet, vilket har blivit en viktig och allmänt använd däggdjursmyopimodell. I denna studie användes molekylärbiologiska verktyg för att undersöka uttrycket av specifika gener för att bekräfta att proverna var fria från kontaminering från de intilliggande vävnaderna. Värdet av detta protokoll har redan visats i en RNA-Seq-studie av RPE från unga pigmenterade marsvin som exponerats för myopiinducerande optisk oskärpa. Utöver reglering av ögontillväxt har detta protokoll andra potentiella tillämpningar i studier av näthinnesjukdomar, inklusive myopisk makulopati, en av de främsta orsakerna till blindhet hos myopes, där RPE har varit inblandad. Den största fördelen med denna teknik är att den är relativt enkel och när den är perfekt, ger högkvalitativa RPE-prover som är lämpliga för molekylärbiologiska studier, inklusive RNA-analys.
Introduction
RPE består av ett unikt monolager av pigmenterade celler som ligger mellan den neurala näthinnan och den vaskulära koroiden, och RPE har välkända roller i utvecklingen och upprätthållandet av normal retinal funktion, inklusive fototransduktion 1,2. På senare tid har RPE tilldelats en ytterligare nyckelroll i ögontillväxtreglering3 och därmed utvecklingen av närsynthet4. Denna uppgift är baserad på RPE: s kritiska plats, placerad mellan näthinnan och choroid och den nu breda acceptansen att ögontillväxt och därmed brytningsfel regleras lokalt5. RPE tros spela en nyckelroll som ett signalrelä, som förbinder näthinnan, den antagna källan till tillväxtmodulerande signaler, till choroid och sclera, de två målen för de vidarebefordrade signalerna 6,7,8.
Den ökning av axiell längd som kännetecknar de flesta närsyntheter kan inte betraktas som godartad, med patofysiologiska förändringar som involverar näthinnan, åderhinnan och/eller sclera som representerar oundvikliga och nu välkända konsekvenser av överdriven okulär förlängning 7,9. I detta sammanhang är RPE kanske den mest sårbara, eftersom den är en icke-mitotisk vävnad och endast kan rymma den expanderande glaskroppen genom sträckning och gallring av enskilda celler. Medan dess roll i myopirelaterade patologier, såsom myopisk makuladegeneration, ännu inte är helt förstådd, har RPE varit inblandad i patogenesen av ett antal andra näthinnesjukdomar, inklusive geografisk atrofi, en av de främsta orsakerna till blindhet, som är förknippad med dokumenterade abnormiteter i näthinnan, RPE och choroid10,11, 12.
Den framgångsrika isoleringen av RPE-celler, fria från kontaminering från intilliggande ögonvävnader, öppnar potentiellt många forskningsmöjligheter för att få nya insikter om mekanismerna bakom en mängd olika ögon- / näthinnesjukdomar. Isoleringen av RPE har dock visat sig vara utmanande, med många publicerade studier som använder kombinerade retina / RPE eller RPE / choroidprover av denna anledning13,14,15. Studier som involverar framgångsrik isolering av RPE av en kvalitet som lämpar sig för molekylärbiologiska studier har begränsats till kyckling- och musögon16,17. Till exempel metoden för samtidig RPE-isolering och RNA-stabilisering (SRIRS) som beskrivs av Wang et al.18. Att isolera RPE-celler hos möss verkar inte fungera bra i marsvinsögon. Protokollet som beskrivs här representerar en förfining av ett tillvägagångssätt som ursprungligen prototypades med trädnäbbögon av en av författarna (MF) och har visat sig ge högkvalitativa RPE-prover, lämpliga för RNA och andra molekylärbiologiska analyser, från ögonen på unga pigmenterade marsvin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All djurvård och behandlingar som användes i denna studie överensstämde med ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. De experimentella protokollen godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of California, Berkeley.
1. Enukleation av marsvinsögat
- Avliva ett marsvin med en intrakardiell injektion av natriumpentobarbital levererad under anestesi (5% isofluran i syre).
- Enukleera ögonen med hjälp av pincett och sax och överför dem omedelbart till en 10 cm petriskål med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för tvättning. Överför ögonen till färsk PBS-lösning.
OBS: En 6-brunnsplatta innehållande 4 ml lösning per brunn rekommenderas.
2. Isolering av den okulära bakre ögonkoppen och RPE / choroid / sclera komplex
- Med hjälp av ett dissekeringsmikroskop, använd en 18 G nål för att göra ett första litet snitt i sclera, ungefär 1,0 mm bakom den limbala gränsen (dvs mellan hornhinnan och sclera) (figur 1A); Använd sedan sax för att ta bort det främre segmentet, inklusive hornhinnan, iris, ciliarkroppen och kristallina linsen.
- Arbeta sedan med den återstående bakre okulära segmentögonkoppen, lossa näthinnan från RPE / choroid / sclera-komplexet; använd pincett för att först ta tag i och sedan försiktigt dra i Zinns zonule och sedan gradvis dra bort näthinnan utan fragmentering (figur 1B).
OBS: Näthinnan får inte greppas direkt för att undvika fragmentering av näthinnan och ofullständig isolering av näthinnans vävnad. Användningen av ett mikroskop är viktigt för detta dissektionssteg.
3. Isolering av RPE från choroid
- När näthinnan har tagits bort helt, sänk ner den återstående bakre ögonkoppen, som inkluderar RPE, choroid och sclera, i vävnadslagringsreagens i 5 minuter (se materialtabellen).
OBS: Använd en platta med 12 brunnar med identifierade brunnar, var och en fylld med 2 ml vävnadslagringsreagens. - Överför ögonkoppen till en annan brunn fylld med 4 ml PBS i 10 s innan du flyttar den till en tredje brunn fylld med 2 ml PBS.
- Sätt fast en 30 G nål på en 1 ml spruta fylld med PBS för det sista RPE-isoleringssteget. Tryck försiktigt på sprutan för att skapa en jetström av PBS; rikta först denna ström mot RPE för att göra en liten tår eller ett hål i den och rikta sedan strömmen av PBS in i den skapade öppningen för att lossa RPE som ett ark från choroid (figur 1C).
OBS: Frigörelsen av RPE som ett ark ger det största RPE-provet. Återigen är användningen av ett mikroskop viktigt för detta steg. - När RPE har lossats från åderhinnan (figur 1D), samla upp RPE-vävnaden i en nållös 1 ml spruta och överför sedan det uppsamlade provet till ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera 1,5 ml röret med uppsamlat RPE vid 8 000 × g i 1 minut för att erhålla en RPE-pellet (figur 2A).
- Kassera PBS-lösningen och ersätt den med 350 ml lysbuffert, som ingår i RNA-isoleringssatser (se materialtabellen); Pipett 20x för att blanda och därmed bevara provets kvalitet. För långvarig lagring och konservering, överför proverna till en frys på −80 °C.
OBS: Lysbufferten är en proprietär komponent i RNA-isoleringssatsen för cell- och vävnadslys före RNA-isolering och samtidig RNA / DNA / proteinisolering. För att inaktivera RNA i lysatet, var noga med att tillsätta β-merkaptoetanol till lysbufferten (10 μL β-merkaptoetanol per 1 ml lysbuffert).
4. RPE-RNA-extraktion
- Använd ett RNA-isoleringskit (se materialtabellen) för att isolera och samla RNA från RPE-proverna enligt tillverkarens instruktioner. Utvärdera provets kvalitet via elektrofores.
OBS: Det beskrivna protokollet gav en produkt av god kvalitet (dvs. RNA-integritetsnummer [RIN] över 8,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av RPE-proverna som samlats in med ovanstående protokoll visade välbevarat RNA (RIN >8.0, figur 2B), med 240,2 ng ± 35,1 ng per öga (n = 8, NanoDrop, figur 2B). För att ytterligare utvärdera kvaliteten på de isolerade RPE-proverna, särskilt frånvaron av koroidala och sklerala föroreningar, undersökte vi uttrycket av representativa gener för var och en av de senare vävnaderna i RPE-proverna19. RPE-proverna visade ett signifikant högre uttryck av Rpe65 (en RPE-specifik gen) jämfört med Rpe65-uttrycksnivåerna i choroid och sclera (tabell 1 och figur 2C). Däremot visade RPE-proverna minimalt uttryck av Col1a1, den valda choroid-sclera-specifika genen (figur 2D).
Figur 1: Förfarande för uppsamling av RPE-bladen . (A) Ett 2 veckor gammalt marsvinsöga med det första snittet. (B) Det främre segmentet (hornhinna, iris och lins), glaskroppen och näthinnan separeras sedan från den bakre ögonkoppen (RPE, choroid och sclera). (C) En strålström av PBS, som levereras via en 30 G nål, används för att lossa RPE (D) som ett ark (svarta pilar) från åderhinnan. Proceduren från det första snittet till RPE-samlingen tar 5-7 min. Förkortning: RPE = retinal pigmentepitel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Förfarande för bedömning av kvaliteten på isolerade RPE-prover. (A) Representativ bild av ett RPE-prov i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör efter att ha spunnits ner. (B) Representativ bioanalysatorutgång för RNA extraherad från de insamlade RPE-proverna. (C,D) Genuttrycksnivåerna för Rpe65, en RPE-specifik gen, och Col1a1, som inte uttrycks eller uttrycks minimalt i RPE, mätt med RT-qPCR i RPE-, koroid- och sklerala prover från n = 3 obehandlade djur. Båda datauppsättningarna normaliserades till β-aktin. ** P < 0,01; P < 0,001. Denna siffra har modifierats från Goto et al.19. Förkortningar: RPE = retinalt pigmentepitel; β-aktin = beta-aktin; Col1a1 = kollagen typ I alfa-1-kedja; Rpe65 = retinoid isomerohydrolas; RT-qPCR = kvantitativ polymeraskedjereaktion med omvänd transkription. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Gen | Främre primer (5' till 3') | Omvänd primer (5' till 3') | ||||
| Kol1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| Rpe65 | GCCCTTCTGCAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-aktin | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabell 1: Nukleotidsekvenser för de primrar som används för PCR-amplifiering i provkvalitetsanalysen. Förkortningar: β-aktin = Beta-aktin; Col1a1 = kollagen typ I alfa 1-kedja; Rpe65 = retinoid isomerohydrolas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln beskriver vi en metod för att isolera RPE, lämplig för RPE-genuttrycksanalyser, från ögonen på unga, pigmenterade marsvin. Fördelarna med detta protokoll är att det ger högkvalitativa RPE-prover som är relativt fria från kontaminering, med RNA lämpligt bevarat för RNA-specifika analyser och ändå är relativt enkelt och effektivt. Medan i exemplet som ges här samlades RPE-proverna från ögonen på ett ungt (2 veckor gammalt) marsvin, har protokollet också använts framgångsrikt för att samla RPE-prover från äldre (unga vuxna) djur.
För forskare med minimal tidigare erfarenhet av okulär kirurgi eller dissektion kan protokoll steg 2.1 och steg 2.2 vara utmanande. Den kritiska detaljen i steg 2.1 är placeringen av det initiala snittet i sklera, som ska placeras exakt 1,0 mm bakom limbus så att iris och lins avlägsnas tillsammans med hornhinnan när det främre segmentet lossnar. Om irisen istället förblir fäst vid det bakre okulära segmentet är det utmanande att hitta zonulen av Zinn, vilket är nyckeln till att framgångsrikt lossa näthinnan i nästa steg. Som noterat i protokollet är det också viktigt att näthinnan inte greppas direkt med pincetten för att undvika fragmentering för att undvika fragmentering. Marsvinets näthinna verkar mer ömtålig än musnäthinnan, troligen på grund av dess avaskulära natur20. Helst bör den isolerade bakre ögonkoppen, bestående av RPE, choroid och sclera, nedsänkas i vävnadslagringsreagens inom 5 minuter efter ögonenukleation för att säkerställa adekvat bevarande av RNA i det uppsamlade RPE-provet.
SRIRS-metoden, som har utvecklats i det specifika syftet att samla in högkvalitativa prover av RPE från mössens ögon, förefaller ha uppnått detta mål för musögon. Det rapporteras vara både effektivt och effektivt18. Denna teknik har också framgångsrikt använts för att samla RPE från friska mänskliga donatorögon21. Baserat på författarnas erfarenhet är denna SRIRS-metod dock inte lämplig för att samla RPE från ögonen på marsvin, trädnäbbmus och opossum, även om de bakomliggande orsakerna till detta inte är tydliga. Genom att rapportera tekniken som beskrivs här för att isolera och samla RPE från ögonen på unga marsvin hoppas vi kunna ta itu med ett viktigt ouppfyllt behov inom myopiforskningsområdet.
När det gäller begränsningarna i det beskrivna protokollet är det viktigaste behovet av en period av praktisk utbildning för att säkerställa effektiv insamling av prover, eftersom tiden till slutförande är nyckeln, förutom renheten hos de insamlade RPE-proverna. Forskare som inte har någon erfarenhet av okulär mikrodissektion eller kirurgi kommer att vara mest i behov av utbildning. Även om flera RPE-isoleringsmetoder har rapporterats22,23, är metoden som beskrivs här inte lämplig för RPE-cellkulturer eller proteinanalyser på grund av användningen av ett RNA-stabiliserande reagens.
RPE har länge erkänts spela kritiska roller inte bara för att upprätthålla näthinnans hälsa och funktion utan också i relaterade sjukdomar. Det faktum att RPE nu också erkänns spela en nyckelroll i okulär tillväxtreglering och myopiutveckling har avsevärt breddat omfattningen av forskningsfrågor, för vilka förmågan att samla högkvalitativa RPE-prover från antingen marsvins ögon, som beskrivs här, eller andra däggdjur som används som djurmodeller kan vara nyckeln till att ge nya insikter. Sådana studier kan också ge nya insikter om de patologiska komplikationerna av närsynthet, inklusive myopisk makulopati, för vilka prevalenssiffrorna kan förväntas stiga parallellt med myopiprevalenssiffrorna i sig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöds av Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (SG), en Loris och David Rich Postdoctoral Scholar (SG) och ett bidrag från National Eye Institute of National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
