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폐 선암종에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 작용 메커니즘의 네트워크 약리학 예측 및 실험적 검증

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64847
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

Summary

이 연구는 네트워크 약리학 및 실험적 검증을 기반으로 폐 선암종 치료에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 메커니즘을 보여줍니다. 이 연구는 또한 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 폐 선암 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 작용에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

Abstract

우리는 네트워크 약리학 및 실험적 검증을 기반으로 폐 선암종(LUAD) 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 메커니즘을 연구하는 것을 목표로 했습니다. Trichosanthis 및 Fritillaria thunbergii의 유효 성분 및 잠재적 표적은 중국 전통 의학의 고처리량 실험 및 참조 유도(HERB) 데이터베이스와 유사성 앙상블 접근법(SEA) 데이터베이스에 의해 수집되었으며, LUAD 관련 표적은 GeneCards 및 Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM) 데이터베이스. 약물-성분-질병-표적 네트워크는 Cytoscape 소프트웨어에 의해 구축되었습니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크, 유전자 온톨로지(GO) 기능, 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 농축 분석을 수행하여 핵심 표적과 주요 경로를 얻었습니다. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 및 A549 세포의 수성 추출물을 후속 실험 검증에 사용했습니다. HERB 데이터베이스와 문헌 검색을 통해 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 31개의 효과적인 화합물과 157개의 잠재적 표적 유전자를 스크리닝했으며, 그 중 144개는 폐 선암 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 조절 표적이었습니다. GO 기능적 농축 분석은 폐 선암에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 작용 메커니즘이 주로 단백질 인산화임을 보여주었습니다. KEGG 경로 농축 분석은 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii에 의한 폐 선암종의 치료가 주로 PI3K/AKT 신호 전달 경로를 포함한다는 것을 시사했습니다. 실험적 검증은 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 수성 추출물이 A549 세포의 증식과 AKT의 인산화를 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 네트워크 약리학 및 실험적 검증을 통해 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 폐 선암 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 작용에 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었습니다.

Introduction

폐암은 편평세포암, 선암, 대세포암 및 소세포암을 포함하는 폐 기관지 점막에서 유래하는 악성 종양을 말한다1. 폐 선암종(Lung adenocarcinoma, LUAD)은 가장 흔한 유형의 폐암으로, 전체 폐암 사례의 약 40%를 차지한다2. 대부분의 환자는 진행된 단계에서 진단을 받거나 원격 전이가 있어 수술의 기회를 잃는다3. 현재 임상 치료에서 동시 화학방사선 요법은 LUAD를 치료하는 가장 일반적인 전략이지만, 심각한 부작용으로 인해 적용이 제한된다4.

중국 전통 의학(TCM)은 LUAD 환자의 임상 증상을 효과적으로 완화하고 방사선 요법 및 화학 요법으로 인한 부작용을 줄일 수 있으므로 연구 핫스팟이 되었습니다 5,6,7. 중국 전통 의학에서 폐암은 "폐 축적"과 "폐 암석"의 범주에 속합니다. 기의 결핍과 가래, 정체 및 독의 상호 작용은 폐암의 발병에 중요합니다. 따라서 Qi를 강화하고 가래와 혈액 정체를 제거하는 것이 TCM 이론9에 따른 폐암의 주요 임상 치료 8 방법입니다. 트리코산테스 키릴로위 Maxim(Gualou)과 Fritillaria thunbergii Miq(Zhebeimu)는 폐암 치료에 일반적인 약물 쌍을 나타내며, 이 조합은 열을 제거하고 가래를 감소시키는 효과가 있습니다10,11,12. 그러나 그 작용 메커니즘은 여전히 불분명하며 추가 연구가 필요합니다.

네트워크 약리학은 여러 약물과 질병 사이의 복잡한 네트워크 관계를 밝히는 것을 목표로 하는 시스템 생물학 및 다방향 약리학 이론에 기반한 포괄적인 방법입니다13. 중국 전통 처방은 다중 성분 및 다중 표적이라는 특성을 가지고 있으며, 이는 네트워크 약리학 연구에 매우 적합하다는 것을 의미합니다14,15. 최근 네트워크 약리학은 TCM 공식 연구에서 강력한 접근 방식으로 부상했으며 연구 핫스팟이 되었습니다16,17.

그러나 우리가 아는 한, 네트워크 약리학에 대한 모든 연구는 텍스트로 제공됩니다. 비디오를 통해 이 기술을 제시하면 학습 임계값이 크게 줄어들고 이 기술의 홍보가 용이해지며 이는 이 기사의 장점 중 하나입니다. 본 연구에서는 폐 선암에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 를 예로 들어 네트워크 약리학 예측 및 실험적 검증을 수행했습니다.

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Protocol

모든 네트워크 약리학 절차는 네트워크 약리학 평가 방법18에 대한 가이드라인에 따라 수행되었다. 모든 실험 절차는 베이징 중의과 대학의 실험실 관리 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 네트워크 약리학적 예측

  1. 활성 구성 요소 선택
    1. HERB 데이터베이스(http://herb.ac.cn)19를 열고 "Gualou"( Trichosanthes kirilowii Maxim의 중국 이름)와 "Zhebeimu"(Bulbus Fritillariae thunbergii의 중국 이름)를 키워드로 사용하여 두 약물의 구성 요소를 얻습니다. 두 약물의 관련 구성 요소에 대한 목록과 표준 SMILES 구조를 다운로드하십시오.
    2. 가져온 구성 요소가 활성 구성 요소인지 여부를 확인합니다.
      1. HERB 그룹 데이터베이스에 경구 생체이용률(OB) 및 약물 유사(DL) 값이 있는 성분(즉, OB ≥ 30% 및 DL ≥ 0.18인 성분)을 활성 성분으로 포함합니다.20,21.
      2. 부품에 OB 및 DL 값이 없는 경우 부품을 Swiss ADME 데이터베이스(http://www.swissadme.ch/index.php)22에 입력하여 각 부품에 대한 정보를 얻습니다. "높은" GI 흡수와 최소 2개의 "예" DL 값을 가진 구성 요소를 활성 구성 요소로 포함합니다.
  2. 활성 성분의 목표 예측
    1. HERB 데이터베이스(http://herb.ac.cn)를 엽니다. 활성 구성 요소의 표준 SMILES 구조를 검색하고 복사합니다.
    2. SEA(Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org) 데이터베이스23을 연다. 활성 구성 요소의 표준 SMILES 구조를 검색 상자에 붙여넣고 SEA 시도 를 클릭하여 각 활성 구성 요소의 대상 키, 대상 이름, P-값 및 MaxTC를 가져옵니다.
    3. 데이터를 스프레드시트에 복사하고 스프레드시트 파일의 필터링 기능을 사용하여 대상 키(사람, P < 0.05 및 MaxTC > 0.5)로 활성 구성 요소의 대상을 필터링합니다.
    4. 모든 표적을 스프레드시트에 복사하고 중복을 제거하여 약물 표적을 얻습니다.
  3. 질병 표적 예측
    1. GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org)24 및 Online Mendelian Inheritance in Man 데이터베이스(OMIM, https://www.omim.org)25를 열고 Lung Adenocarcinoma 를 키워드로 사용하여 폐 선암의 질병 표적을 얻습니다.
    2. 질병 대상의 스프레드시트를 다운로드합니다. 반복되는 대상을 삭제하여 LUAD 대상을 가져옵니다.
  4. 약물-성분-질병-표적 네트워크 구축
    1. LUAD 관련 표적 및 약물 표적을 새 스프레드시트의 동일한 열에 복사합니다. 도구 모음의 데이터 - 중복 식별 기능을 사용하여 LUAD 관련 대상과 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 활성 구성 요소 관련 대상의 교차 대상을 얻습니다.
    2. Cytoscape 3.8.0을 엽니다. 메뉴 표시줄에서 File( 파일 )을 클릭한 다음 Import > Network from File(파일에서 네트워크 가져오기 )을 선택하여 스프레드시트 파일을 가져옵니다. 왼쪽 제어판의 스타일 막대를 통해 네트워크 노드의 크기와 색상을 최적화합니다.
    3. 신경망 토폴로지 분석에 신경망 분석 기능을 사용합니다. 메뉴 모음에서 Tools(도구 )를 클릭한 다음 Analyze Network(네트워크 분석)를 선택합니다. Table( 테이블 ) 패널에서 제목 표시줄의 Degree(학위 )를 클릭하여 내림차순으로 각도별로 구성 요소를 정렬합니다. 상위 10개 구성 요소와 목표를 주요 활성 구성 요소 및 핵심 목표로 삼습니다.
  5. PPI 네트워크 구축 및 핵심 단백질 스크리닝
    1. STRING 데이터베이스(https://cn.string-db.org/)26를 엽니다. LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 잠재적 대상에 대한 텍스트 형식 목록을 이름 목록 대화 상자에 붙여 넣습니다. 유기체의 호모 사피엔스를 선택하고 검색 > 계속 버튼을 클릭합니다.
    2. 결과가 나오면 설정을 클릭하고 기본 설정 > 최소 필수 상호 작용 점수에서 높은 신뢰도(0.700)를 선택합니다. Advanced Settings(고급 설정)에서 Hide Disconnected Nodes in the Network(네트워크에서 연결이 끊긴 노드 숨기기)를 선택한 다음 UPDATE(업데이트) 버튼을 클릭합니다.
    3. 제목 표시줄에서 내보내기 를 클릭하고 PPI 관계의 짧은 테이블 형식 텍스트를 TSV 형식으로 다운로드합니다.
    4. Cytoscape 3.8.0을 엽니다. 파일(File) > 파일에서 네트워크 가져오기(Import > Network from File) 를 클릭하여 시각적 분석을 위해 TSV 형식 파일을 가져옵니다.
    5. 신경망 분석기 함수를 사용하여 위상 분석을 수행합니다. 왼쪽 제어판의 스타일 막대를 통해 네트워크 노드의 크기와 색상을 최적화합니다.
  6. KEGG 농축 분석
    1. Metascape (https://metascape.org/)27 플랫폼을 엽니다. 잠재적인 치료 대상의 텍스트 형식 목록을 대화 상자에 붙여넣은 다음 제출 버튼을 클릭합니다. Input as Species(종으로 입력) 및 Analysis as Species(종으로 분석)에서 H. sapiens를 선택한 다음 Custom Analysis(사용자 지정 분석) 버튼을 클릭합니다. 보강을 선택하고 KEGG 경로만 선택한 다음 보강 분석을 클릭합니다. 진행률 표시줄이 100%에 도달하면 보강 결과를 보려면 분석 보고서 페이지 주황색 단추를 클릭합니다.
    2. 하나의 Zip 파일에서 모두를 클릭하여 보강 결과를 다운로드 한 다음 Enrichment_GO 폴더에서 _ FINAL_GO.csv 파일을 열어 결과를 얻습니다.
    3. R 소프트웨어(https://cran.r-project.org/)를 엽니다. ggplot2 R 패키지 설치를 위해 R에 install.package("ggplot2") 및 라이브러리(ggplot2) 를 입력합니다. Enter 키를 눌러 KEGG 시각화 프로그램을 실행합니다.

2. 실험적 검증

  1. 약물 준비
    참고: Fritillaria thunbergii Miq 및 Trichosanthes kirilowii Maxim은 베이징 중의과 대학 부속 Dongzhimen 병원에서 구입했습니다.
    1. Fritillaria thunbergii Miq 50g과 Trichosanthes kirilowii Maxim 50g을 함께 섞습니다. 혼합물을 증류수 1L에 20분 동안 담근 다음 상압하에 100°C에서 1시간 동안 혼합물을 달입니다.
    2. 달인을 여과하여 멸균 의료용 거즈의 이중층으로 여과액을 얻은 다음 80μm 여과지를 사용하여 추출물을 추가로 여과합니다. 위의 작업을 세 번 반복하십시오.
    3. 여과액을 함께 혼합하여 약 1.2 L 달인을 얻는다. 용액을 회전 증발기의 플라스크에 넣습니다. 온도 37°C에서 회전 속도를 50rpm으로 설정합니다. 6시간 동안 회전 증발기에서 추출물로 달인을 혼합하고 응축하여 점성 액체를 생성합니다.
    4. 진공 동결 건조 메커니즘을 켜서 온도를 -40°C로 예냉각합니다. 얻은 추출물을 재료 트레이에 넣고 냉동을 위해 콜드 트랩에 넣습니다.
    5. 콜드 트랩 온도가 -50°C에 도달하고 재료가 2시간 동안 동결되면 냉동된 재료를 콜드 트랩에 있는 건조 랙으로 옮깁니다. 진공 펌프를 켜서 동결건조 공정을 시작합니다. 동결 건조 분말을 꺼내 나중에 사용할 수 있도록 -20 °C의 냉장고에 보관하십시오.
  2. 세포 배양
    1. DMEM complete 배지를 89% DMEM 염기성 배지, 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 구성합니다.
    2. A549 세포를 액체 질소로부터 제거한 후, 세포를 37°C 수조에서 인큐베이션하고, 바이알 내의 배지가 녹을 때까지 교반한다.
    3. 4배 부피의 DMEM 완전 배지를 용융된 셀에 추가합니다. 세포를 원심분리(4°C, 679 x g, 5분)하고, 상층액을 버린다.
    4. 침전된 세포를 6 mL의 DMEM 완전 배지로 재현탁시키고, T25 배양 플라스크에 플레이트하고, 플라스크를 37°C, 5%CO2의 세포 배양기에서 배양한다.
  3. 세포 생존율 검출
    1. 37°C에서 1분 동안 0.25% 트립신 1mL로 대수 성장기 A549 세포를 분해합니다. DMEM 완전 배지 1mL를 첨가하여 트립신을 중화하고 부드럽게 불어 세포 흘림을 촉진합니다. 이 혼합물을 원심분리하여 세포 펠릿을 얻었다(4°C, 192 x g, 5분). DMEM 완전 배지를 사용하여 수득한 세포를 재현탁한다.
    2. 세포 현탁액을 혈구계에 추가하고 자동 세포 계수기를 사용하여 계산합니다. DMEM 완전 배지를 사용하여 5 x 104 cells/mL로 희석합니다.
    3. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물 1g을 PBS 용액 10mL에 녹이고 0.22μm 필터를 통해 필터 멸균합니다. PBS를 사용하여 혼합물을 90mg/mL, 80mg/ml, 70mg/mL, 60mg/mL, 50mg/mL, 40mg/mL, 30mg/mL, 20mg/mL 및 10mg/mL로 희석합니다.
    4. 희석된 세포를 웰당 100μL로 96웰 플레이트에 플레이트합니다. 세포 부착 후 각 웰의 농도를 900μg/mL, 800μg/mL, 700μg/mL, 600μg/mL, 500μg/mL, 400μg/mL, 300μg/mL, 200μg/mL 및 100μg/mL로 조정하기 위해 다양한 농도의 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물 1μL를 추가합니다.
    5. 24시간 배양 후 본래의 배지를 버리고, 37°C, 5%CO2에서 2시간 동안 추가 배양을 위해 100 μL의 DMEM 염기성 배지를 첨가한다.
    6. 상기 처리 후, 20 μL의 MTS 용액 (물질표)을 첨가하고, 세포를 37°C, 5%CO2에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션한다.
    7. 배양된 혼합물을 다른 플레이트로 옮깁니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 490nm 파장에서 흡광도(OD)를 측정합니다. 다음 공식을 사용하여 세포 생존율을 계산합니다.
      생존율 (%) = 100 × (처리 된 샘플의 OD - 배지의 OD) / (대조군 샘플의 OD − 배지의 OD).
      참고: IC50에 가까운 최소 농도는 고용량으로 정의됩니다. 세포 증식이 억제되기 시작하는 농도는 저용량 농도로 정의하고, 중간 값은 후속 실험 연구를 위해 중간 용량 농도로 정의한다. 이 연구에서는 400μg/mL, 600μg/mL 및 800μg/mL를 저용량, 중용량 및 고용량으로 사용했습니다.
  4. 약물 개입 및 샘플 수집
    참고: 로그 단계를 결정하기 위해 시간에 대해 세포 성장을 표시했습니다.
    1. 로그 성장기 A549 세포를 5 x 105 cells/mL로 희석합니다. 2mL의 세포 현탁액을 6웰 플레이트에 넣고 12시간 동안 성장시킵니다.
    2. 2.3.3단계를 반복하여 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물의 80mg/mL, 60mg/mL 및 40mg/mL PBS 희석액을 얻습니다. PBS 용액 20μL, 40mg/mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물 20μL, 60mg/mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물 20μL, 80mg/mL Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물 20μL를 블랭크 대조군 , 저농도군, 중농도군 및 고농도군에 추가하고, 각각. 개입 24시간 후 상청액을 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다.
      참고: Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 물 추출물의 블랭크 대조군, 저농도군, 중농도군 및 고농도군의 농도는 각각 0μg/mL, 400μg/mL, 600μg/mL 및 800μg/mL였습니다.
    3. 250 μL의 RIPA 완충액(1% PMSF 및 1% 포스파타제 억제제 함유)을 각 웰에 추가하고, 세포를 30분 동안 용해시킨다. 원심분리를 위해 용해물을 수집하고(4°C, 6,714 x g, 10분), 상청액을 얻었다.
  5. 웨스턴 블로팅
    1. 제조자의 지시에 따라 BCA 방법에 의하여 s의 단백질 농도를 검출하십시오. RIPA 버퍼를 사용하여 각 샘플의 농도를 일정하게 조정합니다.
    2. 단백질 시료 40μL를 5배 로딩 완충액 10μL와 혼합하고 100°C에서 5분간 끓입니다. 이 혼합물을 원심분리(4°C, 6,714 x g, 10분)하여 후속 실험을 위한 상층액을 얻었다.
    3. 120 V 수직 전기영동을 이용한 겔 전기영동으로 단백질을 분리한다.
    4. 전기 "샌드위치"(스폰지 - 여과지 - 젤 - PVDF 멤브레인 - 여과지 - 스폰지)를 준비하십시오. 이송 장치를 얼음 수조에 담그고 단백질을 70V에서 60분 동안 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다.
    5. 100mL의 TBST 용액(0.05%[v/v] Tween-20, 10mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.5)과 5g의 탈지분유를 사용하여 5% 우유를 구성합니다. AKT 및 p-AKT 항체를 항체 희석제로 1:1,000의 비율로 미리 희석합니다.
    6. PVDF 멤브레인을 5% 탈지분유에 넣고 진탕하면서 1시간 동안 차단합니다. 블로킹 후, 블로킹 밀크를 버리고, 희석된 1차 항체를 첨가하여 4°C에서 밤새 인큐베이션하였다.
    7. 1차 항체를 제거한 후 TBST 용액을 사용하여 PVDF 멤브레인을 각각 5분씩 5회 세척합니다.
    8. 2차 항체를 항체 희석제로 1:5,000의 비율로 미리 희석합니다. 2차 항체를 첨가하고, 실온(RT)에서 1.5시간 동안 배양한다. 2차 항체를 제거한 후 TBST 용액을 사용하여 PVDF 멤브레인을 각각 5분씩 5회 세척합니다.
    9. 화학발광 검출 시스템을 이용하여 단백질을 검출한다.

3. 분자 도킹

  1. UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org)28를 엽니다. 검색 상자에 대상 기호를 입력하고 SEARCH 버튼을 클릭합니다. Structure( 구조 ) 부제목에서 Download(다운로드 )를 클릭하여 단백질 표적의 3D 구조를 확인합니다.
  2. RCSB PDB 데이터베이스(https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29를 엽니다. 검색 상자에 단백질 거대분자의 이름을 입력합니다. 단백질 거대분자 구조를 PDB 형식으로 다운로드하십시오.
  3. UCSF Chimera 1.16 소프트웨어(https://vina.scripps.edu/) 및 AutoDock Vina(https://vina.scripps.edu/)의 설치 패키지를 다운로드합니다. UCSF Chimera 1.16 소프트웨어를 설치하고 엽니다. File > Open(파일 열기 )을 클릭하여 수용체 단백질을 표시합니다.
  4. Dock Prep> Tools > Structure Editing을 클릭하고 팝오버에서 용매 삭제, 수소 추가 및 전하 추가를 선택하여 물을 제거하고 수소화 및 균형 전하를 추가합니다. Mol2 파일 쓰기를 클릭하여 수용체 단백질을 mol2 형식으로 저장합니다. 리간드에 대해 동일한 단계를 수행합니다.
  5. 파일 > 열기를 클릭하여 UCSF Chimera 1.16 소프트웨어에서 mol2 형식 리간드를 표시합니다. AutoDock Vina> 도구> 표면/결합 분석에서 수용체 막대를 수용체 단백질의 이름으로 설정하고 리간드 막대를 리간드의 이름으로 설정합니다. Center(중심) 및 Size(크기) 뒤에 있는 상자에 값을 입력하여 새로 개발된 공간을 조정하여 리간드와 수용체를 완전히 둘러쌀 수 있도록 합니다.
  6. 분자 도킹 가상 스크리닝을 위해 OK 를 클릭하여 수용체에 대한 리간드 결합을 위한 최적의 위치를 얻습니다. 최적의 위치에서 결합 에너지 값을 기록합니다.

4. 통계 분석

  1. SPSS 26.0 통계 소프트웨어를 엽니다. 데이터 로드 를 위해 File(파일) > Import Data(데이터 가져오기 )를 클릭합니다.
  2. 실험 데이터를 평균 ± 표준 편차로 표시합니다.
  3. 일원 분산 분석을 사용하여 여러 그룹을 비교합니다.
    참고: P < 0.05는 이 작업에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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Representative Results

총 31 개의 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 관련 활성 성분이 확인되었으며, 여기에는 21 개의 Trichosanthes 및 10 개의 Fritillaria thunbergia 성분과 144 개의 해당 표적이 포함됩니다. 전체적으로, 9,049 및 67 LUAD-관련 유전자는 각각 GeneCards 데이터베이스와 OMIM 데이터베이스에서 추출되었다. 중복된 유전자를 삭제한 후 LUAD와 관련된 9,057개의 유전자를 동정하였다. 잠재적인 치료 표적을 얻기 위해 LUAD 관련 유전자와 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 활성 성분 관련 표적의 교역을 수행했습니다. LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 약물 성분 질병 표적 상호 작용 네트워크는 그림 1A에 나와 있습니다. 상호작용 네트워크에서 상위 10개 활성 성분은 캠페롤, 하이드록시겐콰닌, 제니스테인, 디오스메틴 및 β-시토스테롤, 팔미톨레산, 만데놀, 헥사데칸산, 카르프로산 및 카프르산이었으며, 이는 LUAD 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 작용의 주요 활성 성분으로 확인되었습니다(그림 1B). PPI 네트워크에는 122개의 기능성 단백질과 210개의 상호작용 관계가 포함되어 있으며 시각화 결과는 그림 2A에 나와 있습니다. 내림차순으로 나타낸 상위 10개 핵심 단백질은 ESR1, VEGFA, PPARA, CYP3A4, AR, APP, FGF2, CREB1 및 CYP1A1을 포함하며, 주로 혈관신생, 세포 증식, 세포자멸사및 세포막 수송에 관여합니다 30,31,32,33,34,35,36,37 ,38,39(그림 2B). KEGG가 순위를 매긴 상위 20개 경로 중 PI3K/AKT 신호 전달 경로40, Rap1 신호 전달 경로 41, 포스포리파제 D 신호 전달 경로42 및 MAPK1 신호 전달 경로43은 폐암과 밀접한 관련이 있으며, 그 중 PI3K/AKT 경로가 1위를 차지하여 후속 검증에 사용되었습니다(그림 3).

실험은 400μg/mL 이상의 농도에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물이 세포 증식을 억제할 수 있고 최대 800μg/mL 농도에서 A549 세포에 대한 억제 효과가 절반 억제 농도(IC50)에 가깝다는 것을 나타냅니다(그림 4). 따라서 후속 실험에서는 400μg/mL, 600μg/mL 및 800μg/mL를 저용량, 중용량 및 고용량으로 사용했습니다. Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물의 개입은 각 그룹에서 AKT 단백질 발현에 유의미한 변화를 일으키지 않았습니다. 그러나, p-AKT(Ser473)의 발현은 억제되었고, 용량 의존적 효과를 나타내었다(도 5). LUAD 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 주요 구성 요소는 PI3K/AKT 경로의 핵심 단백질과 분자적으로 도킹되었으며, 결과는 AKT1과 디오스메틴 및 캠페롤의 결합 에너지가 -7 미만임을 시사하여 강력한 결합 활성을 나타냅니다44 (그림 6).

Figure 1
그림 1: 약물-성분-질병-표적 네트워크의 다이어그램 . (a) 파란색은 질병을 나타냅니다. 노란색은 약물을 나타냅니다. 빨간색은 구성 요소를 나타냅니다. 녹색은 대상을 나타냅니다. 약어: GL = Trichosanthes; ZBM = 프리틸라리아 툰베리아; LUAD = 폐 선암종. (B) 네트워크의 상위 10개 활성 성분은 내림차순으로 정도별로 정렬됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: LUAD 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 PPI 네트워크. (A) PPI 네트워크의 시각화 결과. 노드가 어두울수록 단백질이 네트워크에서 더 중심에 있습니다. (B) 정도별로 네트워크의 상위 10개 목표. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 표적의 KEGG 경로 강화. (A) 상위 20개 KEGG 경로는 P-값에 따라 오름차순으로 순위가 매겨집니다. (B) PI3K/AKT 신호 전달 경로의 지도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 다양한 농도의 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물이 A549 세포 증식에 미치는 영향(n=3). 400μg/mL 이상의 농도에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물은 세포 증식을 억제할 수 있습니다. 최대 800 μg/mL의 농도에서 A549 세포에 대한 억제 효과는 절반 억제 농도(IC50)에 가까웠다. 약어: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 다양한 농도의 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물이 AKT 단백질 발현 및 인산화 수준에 미치는 영향(n=3). 각 군에서 AKT 단백질 발현에는 유의한 변화가 없었으며, 중용량 및 고용량 군에서 p-AKT(Ser473)의 단백질 발현은 유의하게 하향 조절되었으며, 대조군과 비교했을 때 그 차이가 통계적으로 유의하였다(*P < 0.05 대 대조군). 약어: GL-ZBM = Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 핵심 단백질과 관련 구성 요소의 분자 도킹. (A) PI3K/AKT 경로의 핵심 단백질과 분자적으로 도킹된 LUAD 처리를 위한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 주요 구성 요소의 결합 에너지에 대한 히트맵. (B) 디오스메틴 및 AKT1 단백질의 분자 도킹 다이어그램. (C) 캠페롤과 AKT1 단백질의 분자 도킹 다이어그램. 분홍색 선은 수소 결합을 나타내고, 회색 구조는 약물 조성을 나타내며, 착색된 구조는 AKT1을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

일반적으로 완전한 네트워크 약리학 연구에는 데이터베이스에서 활성 성분 식별, 활성 성분 및 질병에 해당하는 표적 획득, 약물 성분 질병 표적 네트워크 구축, 핵심 표적 및 경로 예측이 포함됩니다. 활성 성분과 핵심 단백질 간의 연관성(분자 도킹)은 컴퓨터 기술에 의해 예비적으로 예측되며 최종 검증은 실험을 사용하여 수행됩니다.

관련 데이터베이스의 선택은 연구의 질을 결정하기 때문에 네트워크 약리학에서 가장 중요한 부분입니다. HERB 데이터베이스는 Syμmap, TCMID, TCMSP 및 TCM-ID와 같은 여러 TCM 데이터베이스의 정보를 통합하며 현재 가장 포괄적인 TCM 및 성분 데이터베이스입니다. 따라서, 본 연구에서는 활성 성분19의 스크리닝을 위해 HERB 데이터베이스를 사용하였다.

이 연구에서는 관련 데이터베이스를 통해 LUAD를 치료하는 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 31개 활성 성분과 144개의 교차 표적을 확인했습니다. 약물-성분-질병-표적 네트워크를 구축하여 토폴로지 분석을 통해 10가지 핵심 활성 성분을 탐색했습니다. LUAD 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 핵심 표적은 PPI 분석을 통해 선별되었습니다.

KEGG 결과의 상위 20개 경로 중 PI3K/AKT 신호 전달 경로, MAPK1 신호 전달 경로, Rap1 신호 전달 경로 및 PPAR 신호 전달 경로는 문헌40,41,42에 따라 종양과 밀접한 관련이 있습니다. 전형적인 암 관련 신호 전달 경로인 MAPK1은 세포 성장 및 분화의 중요한 조절자입니다. 활성화되면, 이 신호전달 경로는 조절되지 않는 세포 증식, 세포 주기 연장, 종양 발생 및 발달을 유도한다45. Rap1 신호전달 경로는 NF-κB 신호전달 경로 및 MAPK1 신호전달 경로의 중요한 조절자이며 폐암의 세포 부착과 밀접한 관련이 있습니다46. 또한, Rap1 신호전달 경로를 억제하면 폐암47에서 종양 전이를 개선할 수 있음이 확인되었습니다. PPAR 신호전달 경로는 세포 증식, 에너지 항상성, 종양 형성 및 대사 장애와 관련이 있다48. 연구에 따르면 종양 혈관신생 및 종양 성장을 촉진하는 기능이 확인되었습니다49.

PI3K/AKT 신호 전달 경로는 주로 AKT의 인산화 및 활성화를 통해 종양의 대사, 증식, 세포자멸사 및 혈관화에 영향을 미칩니다. 이전 연구에서는 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 MAPK1 신호 전달 경로, Rap1 신호 전달 경로 및 PPAR 신호 전달 경로50,51,52에서 조절 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 또한, KEGG 예측 결과, PI3K/AKT 신호전달 경로가 LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii의 작용과 가장 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났기 때문에 후속 실험 검증을 위해 선택되었습니다.

PPI 예측 핵심 표적인 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 VEGFA 및 CREB1과 PI3K/AKT 신호 전달 경로의 핵심 단백질 PI3K 및 AKT1이 분자 도킹에 포함되었습니다. 이전 연구에서는 -7 미만의 도킹 결합 에너지가 유의한 것으로 간주되었다44. 이 연구의 결과는 KAT1과 kaempferol 및 diosmetin의 결합 에너지가 이 임계값을 초과했음을 시사했으며, 이는 AKT에 대한 이 두 성분의 영향이 LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 작용의 핵심일 수 있음을 시사합니다.

추가 실험적 검증에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물이 AKT의 인산화 수준에 미치는 영향을 조사했습니다. 결과는 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물의 농도가 다르면 AKT 단백질의 발현에 큰 영향을 미치지 않지만 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 추출물은 용량 의존적 방식으로 AKT 단백질의 인산화를 유의하게 억제할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 PI3K/AKT 경로의 억제가 LUAD에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 주요 작용 메커니즘임을 시사합니다.

결론적으로, 네트워크 약리학 및 실험적 검증을 통해 본 연구는 PI3K/AKT 신호 전달 경로가 LUAD 치료에서 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 작용에 중요한 역할을 한다는 것을 확인했습니다.

이 연구에는 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 이 연구는 결장, 장 세포 및 간에서 활성 분자의 가능한 생체 변형에 대해 논의하지 않고 생체 이용률이 높은 활성 성분만을 포함했으며, 이는 충분히 포괄적이지 않습니다. 또한, 폐 선암 세포의 증식 및 PI3K/AKT 경로에 대한 Trichosanthes-Fritillaria thunbergii 의 효과는 시험관 내에서만 실험적으로 검증되었습니다. 이 연구는 신약 개발 및 임상 적용 확대를 위한 이론적 근거를 제공합니다. 앞으로 잠재적인 임상 적용에 대한 평가를 지원하기 위해 이러한 예측 결과에 대한 추가 실험적 검증이 수행될 것입니다.

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Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 Beijing University of Chinese Medicine의 혁신 교육 프로그램(No: 202110026036)의 지원을 받았습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco R001100
A549 cell line Procell CL-0016
AKT antibody CST 4691S
BCA Protein Assay Kit Solarbio PC0020
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Solarbio 11995
Enhanced chemiluminescence (ECL) kit  ABclonal RM00021
Fetal bovine serum ScienCell 0025
HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) ABclonal AS014
MTS assay kit Promega G3580
p-AKT antibody CST 6040S
Penicillin streptomycin Gibco C14-15070-063
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Solarbio P0100
Phosphatase inhibitor Beyotime P1081
Phosphate buffered saline (PBS) Solarbio P1020
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
RIPA lysis solution Solarbio R0010
Rotary evaporator Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory RE52CS-1
Vacuum freeze-drying mechanism Ningbo Scientz Biotechnology SCIENTZ-10
β-Actin antibody ABclonal AC026

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References

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폐 선암종에 대한 <em>Trichosanthes-Fritillaria</em> <em>thunbergii</em> 작용 메커니즘의 네트워크 약리학 예측 및 실험적 검증
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Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J.… More

Zhao, X. y., Yang, Y. y., Feng, J. l., Feng, C. l. Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma. J. Vis. Exp. (193), e64847, doi:10.3791/64847 (2023).

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