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भ्रूण और यकृत जेब्राफिश सेल लाइनों के स्फेरॉइड की एक 3 डी संस्कृति विधि

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64859
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 2, 4
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

Summary

यहां, हम दो ज़ेबराफ़िश (डेनियो रेरियो) सेल लाइनों के स्फेरॉइड के गठन के लिए एक प्रभावी, आसान और तेज़ 3 डी संस्कृति प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: जेडईएम 2 एस (भ्रूण) और जेडएफएल (सामान्य हेपेटोसाइट)।

Abstract

मछली सेल लाइनें इकोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए इन विट्रो मॉडल का वादा कर रही हैं; हालांकि, पारंपरिक मोनोलेयर संस्कृति प्रणालियों (2 डी संस्कृति) में प्रसिद्ध सीमाएं हैं (उदाहरण के लिए, संस्कृति दीर्घायु और विवो सेलुलर कार्यों में कुछ का रखरखाव)। इस प्रकार, 3 डी संस्कृतियों, जैसे कि स्फेरॉइड, प्रस्तावित किए गए हैं, क्योंकि ये मॉडल ऊतक जैसी संरचनाओं को पुन: उत्पन्न कर सकते हैं, विवो स्थितियों में बेहतर पुन: कैप्चर कर सकते हैं। यह लेख दो ज़ेबराफ़िश (डेनियो रेरियो) सेल लाइनों के साथ स्फेरॉइड के गठन के लिए एक प्रभावी, आसान और तेज़ 3 डी संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है: जेडईएम 2 एस (भ्रूण) और जेडएफएल (सामान्य हेपेटोसाइट)। प्रोटोकॉल में कोशिकाओं को एक गोल-नीचे, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट, 96-वेल प्लेट में चढ़ाना शामिल है। कक्षीय झटकों (70 आरपीएम) के तहत 5 दिनों के बाद, प्रति कुएं में एक एकल स्फेरॉइड बनता है। गठित स्फेरॉइड स्थिर आकार और आकार पेश करते हैं, और यह विधि एक कुएं में कई स्फेरॉइड के गठन से बचती है; इस प्रकार, समान आकार के स्फेरॉइड को हाथ से चुनना आवश्यक नहीं है। इस स्फेरॉइड विधि की आसानी, गति और प्रजनन क्षमता इसे विट्रो परीक्षणों में उच्च-थ्रूपुट के लिए उपयोगी बनाती है।

Introduction

स्फेरॉइड कोशिकाओं के छोटे गोले होते हैं जो तब बनते हैं जब कोशिकाओं को 3 डी संस्कृति में निकट सेल-टू-सेल संपर्क में सुसंस्कृत किया जाता है। विवो ऊतक वातावरण में नकल करने के लिए स्फेरॉइड की क्षमता का अध्ययन पहले से ही विभिन्न सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं 1,2 में किया गया है। हालांकि, हालांकि स्तनधारी विषाक्तता अध्ययन के लिए स्फेरॉइड अच्छी तरह से विकसित किए गए हैं, गैर-स्तनधारी कशेरुक (जैसे, मछली) के साथ विषाक्तता अध्ययन के लिए स्फेरॉइड का विकास अभीभी प्रगति पर है। मछली सेल लाइनों के लिए, स्फेरॉइड को विभिन्न तरीकों से विकसित किया गया है, जैसे कि विभिन्न प्रकार की वेल-प्लेटों 3,4,5,6,7 का उपयोग करके कक्षीय झटकों (ओएस), और चुंबकीय नैनोकणों का उपयोग करके चुंबकीय उत्तोलन की विधि 8। हालांकि, स्फेरॉइड के लिए इन संस्कृति विधियों में से कुछ में दूसरों की तुलना में अधिक नुकसान हो सकते हैं।

उदाहरण के लिए, बड़े माइक्रोप्लेट्स (24-वेल प्लेटों) में गाइरेटरी विधियां आकार और आकार में भिन्न गोलाकार की एक उच्च संख्या उत्पन्न कर सकती हैं; दरअसल, बहु-स्फेरॉइड संरचना गठन का प्रदर्शन किया गयाहै। इसके लिए एक प्रयोग के लिए समान आकार और आकार वाले स्फेरॉइड को हाथ से चुनने के लिए गहन प्रयासों की आवश्यकता होती है। हैंगिंग ड्रॉप 3 डी कल्चर विधि का उपयोग आमतौर पर स्तनधारी सेल लाइनों 1,2,9,10,11 के स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए किया जाता है, जिससे ऊपर वर्णित समस्याओं से बचने के लिए प्रति बूंद एकल स्फेरॉइड उत्पन्न किया जा सकता है। हालांकि, हालांकि एक संशोधित हैंगिंग ड्रॉप विधि (हैंगिंग ड्रॉप + ऑर्बिटल शेकिंग) एक सस्ती विधि का उपयोग करके जेडएफएल स्फेरॉइड उत्पन्न करने में सक्षम है, लेकिन इसके नुकसान12 हैं। गठित सेलुलर समुच्चय को बूंदों में लंबे समय तक बनाए नहीं रखा जा सकता है; इस प्रकार, उन्हें अच्छी तरह से प्लेटों में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया के लिए एक लामिनर फ्लो हुड में गहन हैंडलिंग और लंबे समय तक काम करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह माइक्रोपिपेट12 का उपयोग करके ड्रॉपवाइज किया जाता है। इसके अलावा, इस विधि को पूरी तरह से जेडएफएल स्फेरॉइड बनाने के लिए 10 दिनों की आवश्यकता होती है (हैंगिंग ड्रॉप में 5 दिन + ओएस में 5 दिन)12। ये नुकसान विषाक्तता परीक्षण के लिए 3 डी मछली स्फेरॉइड के आवेदन को सीमित कर सकते हैं, विशेष रूप से रासायनिक प्राथमिकता और उत्पाद स्थिरता के लिए संभावित अनुप्रयोगों पर विचार करते हुए।

इस प्रकार, यह लेख एक 3 डी संस्कृति प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो 96-वेल, अल्ट्रा-लो अटैचमेंट प्लेट्स (यूएलए-प्लेट) और ऑर्बिटल शेकर (22 मिमी घूर्णी व्यास) के संयुक्त उपयोग के आधार पर जेडएफएल (डी रेरियो सामान्य हेपेटोसाइट) और जेडईएम 2 एस (डी रेरियो ब्लास्टुला चरण भ्रूण) सेल लाइनों के एकल स्फेरॉइड उत्पन्न करने में सक्षम है। लागू विधि सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और छोटी अवधि (5 दिनों) में समान आकार और आकार के उच्च संख्या में स्फेरॉइड उत्पन्न कर सकती है। इस पद्धति के फायदे उद्योग और शिक्षा दोनों में जलीय विषाक्तता अध्ययन के लिए मछली 3 डी मॉडल के आवेदन का समर्थन कर सकते हैं, साथ ही इकोटॉक्सिसिटी परीक्षण के लिए वैकल्पिक तरीकों को लागू करने की प्रगति भी कर सकते हैं।

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Protocol

एक राउंड-बॉटम 96-वेल प्लेट में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के 3 डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण कदम चित्रा 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और संस्कृति मीडिया के लिए तालिका 1 देखें।

1. सेल संस्कृति माध्यम और मोनोलेयर संस्कृतियां

  1. दोनों सेल लाइनों (जेडएफएल, जेडईएम 2 एस) को सीओ2 के बिना 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में मोनोलेयर के रूप में विकसित करें, और जब वे ~ 80% संगम तक पहुंचते हैं तो उन्हें 1: 3 के उप-खेती अनुपात में उपसंस्कृति करें।
    1. ~ 80% संगम पर ज़ेब्राफिश कोशिकाओं के टी 75 फ्लास्क से शुरू करें, जैसा कि ऊपर वर्णित है।
    2. पूर्ण माध्यम को हटा दें और पिपेट की सहायता से कल्चर फ्लास्क में 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (0.01 एम) जोड़कर कोशिकाओं को धो लें।
    3. एक पिपेट की सहायता से, कल्चर फ्लास्क में 1x ट्रिप्सिन-0.5 mM EDTA (0.05% [v/v]) के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और फ्लास्क से कोशिकाओं की टुकड़ी के लिए 3 मिनट के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. कोशिकाओं को छोड़ने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप करें, और फिर फ्लास्क में 3 एमएल पूर्ण कल्चर माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन पाचन को रोकें।
    5. एक पिपेट का उपयोग करके, सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 100 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. गोली के गठन के बाद, सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, उपयोग में संबंधित सेल लाइन (जेडएफएल या जेडईएम 2 एस) के लिए पूर्ण माध्यम का 1 एमएल जोड़ें, और माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पुन: निलंबित करें। सेल गिनती के लिए एक एलिकोट लें।

2. ट्राइपैन ब्लू डाई बहिष्करण परीक्षण के साथ सेल गिनती।

  1. कोशिकाओं की गिनती करने और उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए एक माइक्रोट्यूब में सेल सस्पेंशन के 10 μL और ट्राइपैन ब्लू डाई के 10 μL जोड़ें। एक पिपेट का उपयोग करके सेल निलंबन और डाई मिलाएं।
  2. फिर, इस मिश्रण के 10 μL (सेल सस्पेंशन + ट्राइपैन ब्लू) को एक न्यूबॉयर कक्ष में स्थानांतरित करें और कक्ष के कोनों पर रखे गए चार बड़े वर्गों (क्वाड्रंट: क्यू) में कोशिकाओं की गणना करें, उन कोशिकाओं को देखते हुए जो ट्राइपैन ब्लू को व्यवहार्य नहीं मानते हैं। समीकरण (1) का उपयोग करके व्यवहार्य कक्षों की संख्या की गणना करें:
    Equation 1(1)
  3. सेल निलंबन में अंतिम सेल संख्या की गणना करने के लिए, समीकरण (1) का उपयोग करके निर्धारित सेल संख्या को 2 से गुणा करें (ट्राइपैन ब्लू के उपयोग के कारण कमजोर पड़ने वाला कारक)।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित सेल गिनती प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है।

3. यूएलए-प्लेटों में सेल प्लेटिंग

  1. सेल संख्या की गणना करने के बाद, सेल निलंबन को प्रत्येक सेल लाइन के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या के साथ 96-वेल राउंड-बॉटम यूएलए-प्लेट के प्रति वेल 200 μL प्लेट पर प्लेट 200 μL में समायोजित करें, जैसा कि नीचे बताया गया है:
    1. प्लेट 7,000 व्यवहार्य जेडएफएल कोशिकाओं / इस प्रकार, पूरे यूएलए-प्लेट के लिए, पूर्ण माध्यम के 20 एमएल में 700,000 कोशिकाओं का उपयोग करें।
    2. प्लेट 3,500 व्यवहार्य ZEM2S कोशिकाओं / इस प्रकार, पूरे यूएलए-प्लेट के लिए, पूर्ण माध्यम के 20 एमएल में 350,000 कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. एक मध्यम जलाशय में कोशिकाओं की समायोजित एकाग्रता के साथ सेल निलंबन तैयार करें और इसे मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मिलाएं, ध्यान रखें कि फोम या बुलबुले न बनें। मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, यूएलए-प्लेट के प्रत्येक कुएं में समायोजित सेल निलंबन के 200 μL जोड़ें।
    नोट: प्लेट को पैराफिल्म या चिपकने वाली सीलिंग पन्नी के साथ सील किया जाना चाहिए ताकि 96-वेल प्लेट से संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण से बचा जा सके।

4. स्फेरॉइड गठन

  1. 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5 दिनों के लिए 70 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर यूएलए-प्लेट को इनक्यूबेट करें। स्फेरॉइड को कक्षीय झटकों के 5 दिनों में बनने दें (चित्रा 2), व्यास में ~ 225 μm (ZFL स्फेरॉइड) और व्यास में ~ 226 μm (ZEM2S स्फेरॉइड) 12 के औसत आकार तक पहुंचता है।
    नोट: इनक्यूबेशन के 5 दिनों (अधिकतम परिपत्रता) के बाद, स्फेरॉइड उपयोग करने के लिए तैयार हैं।
  2. 5 दिनों से अधिक समय तक संस्कृति में स्फेरॉइड को बनाए रखने के लिए, हर 5 दिनों में खर्च किए गए माध्यम के 100 μL को हटा दें, और मल्टीचैनल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके 100 μL ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम जोड़ें।
    नोट: इस प्रक्रिया के दौरान स्फेरॉइड को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें।

5. स्फेरॉइड के आकार (व्यास) और आकार (परिपत्रता सूचकांक) को मापना

  1. छवियों को प्राप्त करें।
    1. एक इमेजिंग कैप्चर सिस्टम के साथ एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, एक परिभाषित पैमाने की छवि प्राप्त करें।
      नोट: स्केल प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप चरण अंशांकन स्लाइड या न्यूबॉयर स्लाइड (जिसमें क्वाड्रंट आकार ज्ञात हैं) का उपयोग करें।
    2. माइक्रोस्कोप के नीचे और स्केल की तस्वीर प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही उद्देश्य लेंस का उपयोग करके, पूरी तरह से गठित स्फेरॉइड (यानी, 5-दिन पुराने स्फेरॉइड) की छवियां प्राप्त करें।
      नोट: सभी छवियों को एक ही इमेजिंग कैप्चर सिस्टम का उपयोग करके लिया जाना चाहिए, क्योंकि स्फेरॉइड के आकार और आकार को निर्धारित करने के लिए छवि रिज़ॉल्यूशन महत्वपूर्ण है, और यह सिस्टम के प्रकारों के बीच भिन्न हो सकता है।
  2. स्केल सेट करें.
    1. ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, परिभाषित पैमाने की छवि खोलें ( फ़ाइल | खोलें पर क्लिक करें)।
    2. टूलबार से सीधी-रेखा चयनकर्ता का चयन करें और माउस का उपयोग करके, छवि में परिभाषित स्केल के विस्तार में एक पंक्ति खींचें।
    3. विश्लेषण का चयन करके स्केल सेट करें | स्केल सेट करें, और सेट स्केल विंडो खुलने की प्रतीक्षा करें।
    4. सेट स्केल विंडो में, ज्ञात दूरी के रिक्त स्थान को सीधी रेखा के अनुरूप ज्ञात दूरी (μm) से भरें; लंबाई की इकाई को μm के लिए um से भरें। OK क्लिक करें.
      नोट: पिक्सेल /μm में स्केल विंडो के नीचे प्रदर्शित होता है।
  3. माप पैरामीटर सेट करें।
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर में, विश्लेषण का चयन करें | माप सेट विंडो खोलने के लिए माप सेट करें।
    2. माप सेट करें विंडो में, वांछित माप (यानी, क्षेत्र और आकृति वर्णनकर्ता) के लिए बक्से का चयन करें। क्लिक करें OK.
  4. स्फेरॉइड का व्यास और गोलाकारता प्राप्त करें।
    1. एक स्फेरॉइड की तस्वीर खोलें (फाइल | खुला)।
    2. उपकरण पट्टी में फ्रीहैंड चयन उपकरण का चयन करें और, माउस का उपयोग करके, गोलाकार के बाहरी पक्ष का चयन करें, जैसा कि चित्रा 3 ए में दिखाया गया है।
      नोट: छवि पर ज़ूम इन या आउट करने के लिए, Ctrl कुंजी दबाएँ और नीचे या ऊपर स्क्रॉल करने के लिए माउस का उपयोग करें, या Ctrl कुंजी दबाएँ और कुंजीपटल पर ऊपर या नीचे तीर कुंजियों का उपयोग करें।
    3. विश्लेषण का चयन करें | परिणाम विंडो खोलने के लिए मापन करें, जिसमें मापा मान प्रदर्शित होते हैं।
    4. क्षेत्र मान का उपयोग करके, समीकरण (2) का उपयोग करके स्फेरॉइड के आकार (व्यास) की गणना करें:
      Equation 2(2)
    5. परिपत्रता सूचकांक परिणाम विंडो में "सिर" के रूप में दिया गया है, और समीकरण (3) का उपयोग करके सॉफ़्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से गणना की जाती है:
      Equation 3(3)
      नोट: 1.0 का वृत्ताकार सूचकांक एक आदर्श गोलाकार आकार का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि 0.0 के करीब एक मान एक लम्बी आकृति13 को इंगित करता है।

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Representative Results

स्थिर आकार और आकार के साथ प्रति कुएं एकल स्फेरॉइड इस विधि द्वारा बनते हैं। चित्र 2 कक्षीय झटकों (70 आरपीएम) के तहत यूएलए-प्लेट के कुएं में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस कोशिकाओं के एकल स्फेरॉइड की गठन प्रक्रिया को दर्शाता है। जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों में 3 डी संस्कृति में अलग-अलग व्यवहार हैं। जेडईएम 2 एस सेल लाइन ऐसी विशेषताएं प्रस्तुत करती है जो कक्षीय झटकों (चित्रा 2 ई) के पहले दिन से आसानी से एक गोलाकार आकार बनाने की क्षमता प्रदान करती हैं, जबकि जेडएफएल सेल लाइन को वांछनीय गोलाकार आकार (चित्रा 2 ए-सी) तक पहुंचने के लिए 5 दिनों की आवश्यकता होती है। इस विधि द्वारा उत्पन्न स्फेरॉइड ने संस्कृति की लंबी अवधि (अवधि >5 दिन) में आकार के संदर्भ में स्थिरता भी दिखाई, जैसा कि चित्रा 2 डी (16 दिन पुराना जेडएफएल स्फेरॉइड) और चित्रा 2 एच (10 दिन पुराना-जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड) में दिखाया गया है। स्फेरॉइड के व्यास और परिपत्रता को वैज्ञानिक छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त छवियों में उनके अनुमानित क्षेत्र को मापकर निर्धारित किया गया था13 (चित्रा 3)। सामग्री की तालिका छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर को इंगित करती है। जेडएफएल कोशिकाएं कक्षीय झटकों के पहले दिन बड़े सेल समुच्चय (औसत आकार 319 ± 23.33 μm) बनाती हैं, जो समय के साथ दिन 5 (225.62 ± 19.20 μm) तक घट जाती हैं (चित्रा 4 ए), संस्कृति में समय के साथ परिपत्रता को बढ़ाती हैं (चित्रा 4 बी)। जेडएफएल कोशिकाओं के विपरीत, जेडईएम 2 एस सेल लाइन पहले दिन (202.64 ± 5.78 μm) से छोटे स्फेरॉइड बनाती है, जो दिन 5 (226.63 ± 4.80 μm) तक उत्तरोत्तर बढ़ती है (चित्रा 4सी)। चित्रा 4 ई 3 डी संस्कृति में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों में विभिन्न विकास पैटर्न दिखाता है। हम पांचवें दिन ZFL और ZEM2S स्फेरॉइड का उपयोग करने की सलाह देते हैं क्योंकि वे एक उच्च गोलाकार आकार (क्रमशः 0.80 ± 0.01 और 0.83 ± 0.00 का परिपत्र सूचकांक) तक पहुंचते हैं (चित्रा 4 बी, डी), जो इस 3 डी मॉडल की अधिक स्थिरता को इंगित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एक राउंड-बॉटम 96-वेल प्लेट में जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के 3 डी स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनों के एकल स्फेरॉइड कक्षीय झटकों के तहत गोल-नीचे 96-वेल यूएलए-प्लेटों में बनते हैं। ओएस (ए) के पहले दिन एक जेडएफएल सेल एग्रीगेट बनता है। सेल एग्रीगेट तीसरे दिन (बी) पर अपनी गोलाकारता बढ़ाता है और दिन 5 (सी) पर पर्याप्त गोलाकार आकार तक पहुंच जाता है। (डी) यूएलए-प्लेट में एक 16 दिन पुराना जेडएफएल स्फेरॉइड। जेडईएम 2 एस सेल लाइन ओएस (ई) के पहले दिन से स्फेरॉइड बनाती है। ZEM2S स्फेरॉइड अपने आकार को बनाए रखता है और तीसरे दिन (F) आकार में बढ़ता है, और इसकी अधिकतम परिपत्रता दिन 5 (G) पर पहुंच जाती है। (एच) यूएलए-प्लेट में एक 10 दिन पुराना जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षेप: ओएस = कक्षीय झटके; यूएलए = अल्ट्रा-लो अटैचमेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: वैज्ञानिक छवियों के प्रसंस्करण और विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्फेरॉइड के आकार और परिपत्रता का निर्धारण करना। ज्ञात पैमाने के आधार पर चयनित क्षेत्र को मापने के लिए सॉफ़्टवेयर सेट करने के बाद, इसके क्षेत्र और परिपत्रता (ए) को निर्धारित करने के लिए स्फेरॉइड के बाहरी पक्ष का चयन करें। स्फेरॉइड के क्षेत्र का उपयोग व्यास डी की गणना करके इसके आकार को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, और सॉफ्टवेयर एक सूत्र द्वारा स्फेरॉइड की परिपत्रता प्रदान करता है जो चयनित क्षेत्र और परिधि (बी) का उपयोग करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 3 डी स्फेरॉइड विधि की प्रजनन क्षमता समान आकार के स्फेरॉइड (व्यास) और परिपत्रता (गोलाकार आकार) द्वारा दिखाई गई है। जेडएफएल (ए) और जेडईएम 2 एस (बी) सेल लाइनों के स्फेरॉइड का मापा आकार। जेडएफएल (सी) और जेडईएम 2 एस (डी) स्फेरॉइड का मापा परिपत्र सूचकांक। जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (ई) का विकास पैटर्न। डेटा विभिन्न सेल बैचों से तीन तकनीकी प्रतिकृतियों का प्रतिनिधि है। प्रत्येक बिंदु के ऊपर की संख्याएं दिन 1, 3 और 5 के लिए तीन प्रतियों के माध्य को इंगित करती हैं। डेटा को मानक विचलन (एन = 10) ± रूप में दिखाया गया है। इस आंकड़े को सूजा एट अल.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड के गठन के बीच तुलना दो घूर्णी गति (70 और 100 आरपीएम) पर की जाती है। एक जेडएफएल स्फेरॉइड (ए) और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (बी) 100 आरपीएम पर कक्षीय झटकों के 5 दिनों के बाद बनता है (स्केल बार 100 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं)। जेडएफएल स्फेरॉइड (सी) और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (डी) का विकास पैटर्न 70 और 100 आरपीएम पर बनता है। जेडएफएल स्फेरॉइड (ई) और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (एफ) का परिपत्र सूचकांक 70 और 100 आरपीएम पर बनता है। डेटा को मानक विचलन (एन = 10) ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। * सांख्यिकीय महत्व को इंगित करता है (पी < 0.05)। एन.एस.: 70 और 100 आरपीएम पर 5 वें दिन गठित स्फेरॉइड के बीच गैर-महत्वपूर्ण अंतर (टी-टेस्ट)। इस आंकड़े को सूजा एट अल.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (5 दिन पुराना) की सेलुलर अखंडता और व्यवहार्यता गोल-नीचे अल्ट्रा-लो अटैचमेंट वेल-प्लेट में कक्षीय झटकों से बनती है। लेक्टिन एलेक्सा फ्लुर 594 (लाल) द्वारा कोशिका झिल्ली का धुंधला होना और डीएपीआई (नीला) द्वारा नाभिक जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड (ए) और जेडएफएल स्फेरॉइड (बी) के मूल में सेलुलर अखंडता को प्रदर्शित करता है। अलामारब्लू की कमी से गठित रेसोरुफिन (लाल) की प्रतिदीप्ति जेडईएम 2 एस (सी) और जेडएफएल (डी) स्फेरॉइड दोनों के मूल में व्यवहार्य कोशिकाओं को प्रदर्शित करती है। चित्र एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कैप्चर किए गए ऑर्थोगोनल विमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं। जेडईएम 2 एस (ई) और जेडएफएल सेल लाइन (एफ) की 3 डी संस्कृति (स्फेरॉइड) और 2 डी संस्कृति में एमटीटी व्यवहार्यता परख। डेटा ने मानक विचलन के ± 570 एनएम पर मापा अवशोषण के औसत के रूप में दिखाया। एनएस: वेल्च के टी-टेस्ट द्वारा गैर-महत्वपूर्ण अंतर। इस आंकड़े को सूजा एट अल (2021)12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: जेडएफएल और जेडईएम 2 एस खेती के लिए समाधान। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: एकल जेडएफएल स्फेरॉइड बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली 3 डी स्फेरॉइड विधियों की तुलना। * एक परीक्षण पैरामीटर के लिए सबसे अच्छा परिणाम। एक पारंपरिक हैंगिंग ड्रॉप विधि में सत्यापित सर्वोत्तम परिणामों से चयनित पैरामीटर। ख कक्षीय झटकों के साथ मछली स्फेरॉइड बनाने के लिए बैरन एट अल.3 से चयनित पैरामीटर। सी विविधताएं एक परीक्षण पैरामीटर के लिए समान रूप से उपयुक्त हैं। संक्षेप: एचडी = हैंगिंग ड्रॉप; ओएस = कक्षीय झटके; यूएलए = अल्ट्रा-कम लगाव; पॉली-हेमा = पॉली (2-हाइड्रॉक्सीथाइल मेथैक्रिलेट)। इस तालिका को सूजा एट अल.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

यह ज़ेबराफ़िश यकृत और भ्रूण कोशिका लाइनों के स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए एक सरल, आसान और तेज़ विधि है। इस विधि को इस समूह द्वारा स्फेरॉइड गठन से संबंधित वैज्ञानिक अध्ययनों में रिपोर्ट की गई समस्याओं को दूर करने के लिए मौजूदा 3 डी स्फेरॉइड विधियों के संशोधनों के आधार पर विकसित किया गया था, साथ ही 3 डी स्फेरॉइड परख से डेटा सटीकता में अनिश्चितताएं भी थीं। उदाहरण के लिए, रिपोर्ट की गई समस्याएं हैंडलिंग की कठिनाइयों, स्फेरॉइड उत्पन्न करने की समय लेने वाली प्रकृति, परख करने के लिए एक समान आकार और आकार के स्फेरॉइड का चयन करने की आवश्यकता के साथ-साथ हैंगिंग ड्रॉप विधि 3,7,12 में बूंदों से माइक्रोप्लेट्स में स्फेरॉइड को स्थानांतरित करने की प्रक्रिया में कठिनाइयों में निहित हैं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सीओ 2-मुक्त स्थिति में जेडएफएल और जेडईएम2 एस सेल लाइनों की संस्कृति की सिफारिश करता है। दोनों सेल लाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल में प्रस्तावित संस्कृति माध्यम संरचना और सीओ2-मुक्त वातावरण साहित्य में व्यापक रूप से रिपोर्ट किए गए हैं। जेडएफएल सेल लाइन आमतौर पर एल -15 और आरपीएमआई मीडिया में सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ या बिना और सीओ2 14,15,16,17,18,19,20 के बिना सुसंस्कृत होती है। जेडईएम 2 एस सेल लाइन को बायोरिसोर्स सेंटर के निर्देशों के अनुसार सुसंस्कृत किया गया है, और इसकी संस्कृति मीडिया सीओ2-मुक्त संस्कृतियों के लिए तैयार की गई थी; इस प्रकार, इस प्रकार के कल्चर मीडिया21 का उपयोग करते समय सीओ2 और वायु मिश्रण कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है।

वर्तमान मछली स्फेरॉइड प्रोटोकॉल को कई मापदंडों (यानी, विभिन्न सेल घनत्व, कक्षीय झटकों की गति [70 या 100 आरपीएम], और विभिन्न 96-वेल प्लेटों [फ्लैट बॉटम या राउंड-बॉटम]) के उपयोग का मूल्यांकन करने के बाद विकसित किया गया था ताकि जेडएफएल स्फेरॉइड बनाने के लिए सर्वोत्तम पैरामीटर निर्धारित किए जा सकें। इसके अतिरिक्त, अन्य 3 डी संस्कृति विधियों (यानी, हैंगिंग ड्रॉप विधि और कक्षीय हिलाने की विधि के साथ संयुक्त हैंगिंग ड्रॉप विधि) के साथ तुलना की गई थी, यह दर्शाता है कि गोल-तल यूएलए-प्लेटों के कक्षीय झटकों में सबसे अच्छा प्रदर्शन था (यानी, आसान, तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि)। तालिका 2 जेडएफएल स्फेरॉइड बनाने के लिए मूल्यांकन किए गए अन्य 3 डी संस्कृति विधियों के मापदंडों और प्रदर्शन को दर्शाती है।

गोल-तल यूएलए-प्लेटों को पहले से ही मानव कोशिकाओं के एकल स्फेरॉइड बनाने के लिए सूचित किया गया है, इसके बाद सेंट्रीफ्यूजेशन22 या ऑर्बिटल शेकिंग23,24 है। इस प्रोटोकॉल में, हम जेब्राफिश सेल लाइनों के एकल स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए कक्षीय झटकों को छोड़कर एक ही प्लेट के उपयोग का प्रस्ताव कर रहे हैं (यानी, 96-वेल प्लेट के प्रति कुएं में एक स्फेरॉइड)। यह विशेष रूप से लाभप्रद है क्योंकि यह आसानी से और तेजी से अच्छी मात्रा में स्फेरॉइड बना सकता है, और गठित स्फेरॉइड को एक ही प्लेट पर संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। इस प्रकार, विभिन्न प्रकार की विषाक्तता परख करने के लिए रासायनिक जोखिम सीधे यूएलए-प्लेट पर किया जा सकता है।

जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड बनाने के लिए पर्याप्त कक्षीय झटकों की गति निर्धारित करने के लिए, हमने 70 और 100 आरपीएम पर स्फेरॉइड के गठन की तुलना की। परिणाम बताते हैं कि यह विधि 70 आरपीएम पर बेहतर प्रदर्शन करती है, और एक उच्च घूर्णी गति जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड के आकार और आकार को काफी प्रभावित कर सकती है (चित्रा 5 डी, एफ)। जेडएफएल स्फेरॉइड ने इन घूर्णी गति पर आकार और आकार में महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया; हालांकि, कम परिपत्रता सूचकांक 100 आरपीएम पर प्राप्त किए गए थे, जो उच्च घूर्णी गति (चित्रा 5 सी, ई) पर गोलाकार आकार में नकारात्मक प्रभाव दिखाते हैं।

3,500 ZEM2S कोशिकाओं और 7,000 ZFL कोशिकाओं का प्रारंभिक सेल घनत्व संस्कृति में पांचवें दिन समान आकार के साथ स्फेरॉइड उत्पन्न करता है (क्रमशः 226.63 और 225.62 μm)। यह देखते हुए कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को स्फेरॉइड25 में प्रसार द्वारा ले जाया जाता है, उनका व्यास स्फेरॉइड के कोर में पोषण और सेलुलर अखंडता को दृढ़ता से प्रभावित कर सकता है; आम तौर पर, नेक्रोटिक कोर26 से बचने के लिए 100 μm तक स्फेरॉइड की सिफारिश की जाती है। स्फेरॉइड के कोर में सेलुलर अखंडता को सत्यापित करने के लिए, हमने कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6 ए, बी) द्वारा डीएपीआई और लेक्टिन एलेक्सा फ्लुर 594 के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा परमाणु और झिल्ली अखंडता का मूल्यांकन किया, और स्फेरॉइड की अखंडता का प्रदर्शन किया गया। स्फेरॉइड के कोर में सेलुलर व्यवहार्यता को भी रेसाज़ुरिन (अलामारब्लू) को उजागर करके और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्रा 6 सी, डी) द्वारा रेसोरुफिन की प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करके सत्यापित किया गया था। जब कोशिकाएं व्यवहार्य होती हैं, तो सेलुलर चयापचय समारोह द्वारा रेसाज़ुरिन को रेसोरुफिन (फ्लोरोसेंट पदार्थ) में कम कर दिया जाता है। एमटीटी परख के प्रदर्शन ने मोनोलेयर कल्चर (2 डी संस्कृति) (चित्रा 6 ई, एफ) के साथ जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड की तुलना में सेल व्यवहार्यता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। यद्यपि स्फेरॉइड 100 μm से अधिक हैं, परिणाम बताते हैं कि यह प्रोटोकॉल उनके आंतरिक भाग में भी पर्याप्त पोषण के साथ ZFL और ZEM2S सेल लाइनों के व्यवहार्य स्फेरॉइड उत्पन्न करता है।

जेडएफएल और जेडईएम 2 एस कोशिकाओं की कोशिका घनत्व और इस प्रोटोकॉल में लागू कक्षीय झटकों की गति ने कुओं के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ आकार और आकार में बहुत स्थिर स्फेरॉइड के गठन की अनुमति दी (चित्रा 4), परख करने के पिछले चरण के रूप में पर्याप्त स्फेरॉइड का चयन करने की आवश्यकता से बचने के लिए। यदि परख प्रक्रिया के लिए स्फेरॉइड को अन्य प्लेटों या ट्यूब / माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, तो उन्हें आसानी से एक माइक्रोपिपेट के साथ बिना विघटन समस्याओं के स्थानांतरित किया जा सकता है।

यहां, हमने व्यवहार्य जेडएफएल और जेडईएम 2 एस स्फेरॉइड बनाने के लिए सर्वोत्तम मापदंडों के आधार पर विकसित एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। जेडएफएल और जेडईएम 2 एस सेल लाइनें मछली23,24,27,28,29,30 पर रासायनिक प्रभावों का अनुमान लगाने के लिए जलीय विषाक्तता परीक्षण में उपयोगी हो सकती हैं। इसके अतिरिक्त, मछली भ्रूण सेल लाइनों का उपयोग करके विकासात्मक समापन बिंदुओं का भी अध्ययन किया जा सकता है, जैसे कि जेडईएम 2 एस सेल लाइन (ब्लास्टुला चरण की फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं), जो प्लूरिपोटेंसी28 की डिग्री को बनाए रखती हैं। ये इन ज़ेब्राफिश स्फेरॉइड को मछली विषाक्तता परीक्षण के लिए संभावित रूप से उपयोगी बनाते हैं। इसके अलावा, एक आसान मछली स्फेरॉइड विधि के रूप में, इसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट इकोटॉक्सिसिटी परीक्षण में किया जा सकता है, जो उद्योग और शिक्षा में इसके आवेदन का समर्थन करता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

मार्सियो लोरेंसिनी की याद में, इस काम के सह-लेखक, सौंदर्य प्रसाधन के क्षेत्र में एक उत्कृष्ट शोधकर्ता और ब्राजील में कॉस्मेटिक अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए समर्पित हैं। लेखक उपकरण की उपलब्धता के लिए फिजियोलॉजी विभाग (यूएफपीआर) में बहु-उपयोगकर्ता प्रयोगशाला के आभारी हैं और उच्च शिक्षा कर्मियों (सीएपीएस, ब्राजील) (वित्त कोड 001) और ग्रुपो बोटिकारियो के सुधार के लिए समन्वय के वित्तीय समर्थन के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile Corning 7007
DMEM, powder, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder Gibco 21700026
HEPES (1M) Gibco 15630080
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software  National
Institutes of Health, USA		 Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, powder Gibco 41300021
Orbital shaker  Warmnest KLD-350-BI 22 mm rotation diameter
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium Invitrogen 14080055
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
RPMI 1640 Medium Gibco 31800-014
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions Gibco 12657-029
Sodium bicarbonate, powder,  bioreagent for molecular biology Sigma-Aldrich S5761
Trypan blue stain (0,4%) Gibco 15250-061
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
ZEM2S cell line ATCC CRL-2147 This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
ZFL cell line BCRJ 256

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References

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वापसी अंक 191
भ्रूण और यकृत जेब्राफिश सेल लाइनों के स्फेरॉइड की एक 3 डी संस्कृति विधि
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de Souza, I. R., Micali Canavez, A.… More

de Souza, I. R., Micali Canavez, A. D. P., Schuck, D. C., Costa Gagosian, V. S., de Souza, I. R., de Albuquerque Vita, N., da Silva Trindade, E., Cestari, M. M., Lorencini, M., Leme, D. M. A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines. J. Vis. Exp. (191), e64859, doi:10.3791/64859 (2023).

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