Summary
在这里,我们提出了一种有效,简单和快速的3D培养方案,用于形成两种斑马鱼(Danio rerio)细胞系的球状体:ZEM2S(胚胎)和ZFL(正常肝细胞)。
Abstract
鱼细胞系是有希望的 体外 生态毒性评估模型;然而,传统的单层培养系统(2D培养)具有众所周知的局限性(例如,培养寿命和维持某些 体内 细胞功能)。因此,已经提出了3D培养物,例如球状体,因为这些模型可以复制组织样结构,更好地重新捕获 体内 条件。本文介绍了一种有效、简单且快速的 3D 培养方案,用于用两种斑马鱼 (Danio rerio) 细胞系形成球状体:ZEM2S(胚胎)和 ZFL(正常肝细胞)。该方案包括将细胞接种在圆底、超低附着的 96 孔板中。在轨道振荡(70rpm)下5天后,每孔形成单个球体。形成的球体呈现稳定的尺寸和形状,该方法避免了在井中形成多个球体;因此,没有必要手工挑选相似大小的球体。这种球状体方法的简便性、速度和重现性使其可用于高通量 体外 测试。
Introduction
球状体是在3D培养中以紧密的细胞间接触培养细胞时形成的小细胞球体。球状体模拟体内组织环境的能力已经在各种细胞系和原代细胞中进行了研究1,2。然而,尽管用于哺乳动物毒性研究的球状体已经发展得很好,但用于非哺乳动物脊椎动物(例如鱼类)毒性研究的球体的开发仍在进行中3。对于鱼细胞系,球状体已经通过各种不同的方法开发,例如使用不同类型的孔板3,4,5,6,7的轨道振荡(OS)和使用磁性纳米颗粒8的磁悬浮方法。然而,其中一些球状体培养方法可能比其他方法具有更多的缺点。
例如,大微孔板(24孔板)中的回转方法可能会产生大量大小和形状不同的球体;事实上,已经证明了多球体结构的形成7。这需要付出巨大的努力来手工挑选具有相似大小和形状的球体进行实验。悬挂液滴3D培养方法通常用于生成哺乳动物细胞系1,2,9,10,11的球状体,从而每滴可以生成单个球状体,避免了上述问题。然而,尽管改进的悬挂液滴法(悬滴+轨道振荡)能够使用廉价的方法生成ZFL球体,但它有其缺点12。形成的细胞聚集体不能在液滴中长时间维持;因此,它们需要转移到孔板中。该过程需要密集的处理和在层流罩中长时间的工作,因为它是使用微量移液器12滴加进行的。此外,该方法需要10天才能完全形成ZFL球体(悬挂液滴5天+OS5天)12。这些缺点可能会限制3D鱼球体在毒性测试中的应用,特别是考虑到化学优先级和产品可持续性的潜在应用。
因此,本文描述了一种 3D 培养方案,该方案能够基于结合使用 96 孔、超低附着板(ULA 板)和轨道振荡器(22 mm 旋转直径)生成 ZFL(D. rerio 正常肝细胞)和 ZEM2S(D. rerio 胚泡期胚胎)细胞系的单个球状体。所应用的方法简单且可重复,并且可以在短时间内(5天)生成大量大小和形状相似的微球。该方法的优点可以支持鱼类三维模型在工业界和学术界的水生毒性研究中的应用,以及实施生态毒性测试替代方法的进展。
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Protocol
在圆底96孔板中生成ZFL和ZEM2S细胞系的3D球状体的关键步骤如图 1所示。
注意:有关本协议中使用的所有材料的详细信息,请参阅 材料 表,有关本协议中使用的溶液和培养基,请参阅 表1 。
1. 细胞培养基和单层培养
- 在28°C的培养箱中以单层形式生长两种细胞系(ZFL,ZEM2S)没有CO2,并在它们达到~80%汇合时以1:3的传代培养比传代培养它们。
- 从~80%汇合的斑马鱼细胞T75烧瓶开始,如上所述培养。
- 取出完整的培养基,并借助移液器向培养瓶中加入1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.01M)来洗涤细胞。
- 借助移液器,向培养瓶中加入3mL的1x胰蛋白酶-0.5mM EDTA(0.05%[v / v]),并在28°C下孵育3分钟以从烧瓶中分离细胞。
- 轻轻敲击烧瓶以释放细胞,然后通过向烧瓶中加入 3 mL 完全培养基来停止胰蛋白酶消化。
- 使用移液器将细胞悬液转移到 15 mL 锥形离心管中,并以 100 × g 离心 5 分钟。
- 沉淀形成后,小心地除去上清液,为使用的相应细胞系(ZFL或ZEM2S)加入1mL的完整培养基,并使用微量移液器重悬。取等分试样进行细胞计数。
2. 台盼蓝染料排阻试验细胞计数
- 向微管中加入 10 μL 细胞悬液和 10 μL 台盼蓝染料,以计数细胞并评估其活力。使用移液管混合细胞悬液和染料。
- 然后,将 10 μL 该混合物(细胞悬液 + 台盼蓝)转移到 Neubauer 腔室中,并计数放置在室角落的四个大方块(象限:Q)中的细胞,认为不吸收台盼蓝的细胞是可行的。使用公式(1)计算活细胞的数量:
(1) - 要计算细胞悬液中的最终细胞数,请将使用公式(1)确定的细胞数乘以2(由于使用台盼蓝而产生的稀释因子)。
注意:或者,可以使用自动细胞计数系统。
3. ULA板中的电池镀层
- 计算细胞数后,将细胞悬液调整为每孔200μL该悬浮液的96孔圆底ULA板,每个细胞系所需的细胞数,如下所示:
- 板7,000个活 的ZFL 细胞/孔;因此,对于整个ULA板,在20 mL完全培养基中使用700,000个细胞。
- 板3,500活的 ZEM2S 细胞/孔;因此,对于整个ULA板,在20 mL完全培养基中使用350,000个细胞。
- 在培养基储液槽中用调节后的细胞浓度制备细胞悬液,并使用多通道微量移液器混合,注意不要形成泡沫或气泡。使用多通道微量移液器,向ULA板的每个孔中加入200μL调整后的细胞悬液。
注意:板必须用封口膜或粘合剂密封箔密封,以避免培养基从96孔板蒸发。
4. 球体形成
- 将ULA板在28°C培养箱中以70rpm的轨道振荡器孵育5天。让球体形成超过5天的轨道振荡(图2),达到直径~225μm(ZFL微球)和~226μm直径(ZEM2S微球)的平均尺寸12。
注意:孵育5天(最大圆度)后,球状体即可使用。 - 要将球状体在培养物中保持 5 天以上,每 5 天去除 100 μL 用过的培养基,并使用多通道微量移液器加入 100 μL 新鲜的完整培养基。
注意:在此过程中注意不要吸出球体。
5. 测量球体的尺寸(直径)和形状(圆度指数)
- 获取图像。
- 在带有成像捕获系统的倒置光学显微镜下,获得定义比例的图像。
注意:使用显微镜载物台校准载玻片或Neubauer载玻片(其中象限尺寸已知)获得刻度。 - 在显微镜下,使用与获取秤图像相同的物镜,获得完全形成的球体(即5天大的球体)的图像。
注意:所有图像必须使用相同的成像捕获系统拍摄,因为图像分辨率对于确定球体的大小和形状非常重要,并且可能因系统类型而异。
- 在带有成像捕获系统的倒置光学显微镜下,获得定义比例的图像。
- 设置比例。
- 使用 ImageJ 软件,打开定义比例的图像(单击 “文件”|“打开”)。
- 从工具栏中选择 直线选择器 ,然后使用鼠标在图像中定义比例的延伸线上拖出一条线。
- 通过选择 “分析”|”设置比例,然后等待 “设置比例” 窗口打开。
- 在“设置比例”窗口中,用与直线对应的已知距离(μm)填充已知距离的空白;用 um 填充长度单位表示 μm。单击“确定”。
注意:以像素/μm 为单位的比例显示在窗口底部。
- 设置测量参数。
- 在 ImageJ 软件中,选择 “分析”|”设置 测量以打开 设置测量 窗口。
- 在“ 设置度量 ”窗口中,选中所需测量值的框(即“ 面积 ”和 “形状 ”描述符)。单击“ 确定”。
- 获得球体的直径和圆度。
- 打开椭球体的图片(文件 |打开)。
- 在工具栏中选择 手绘选择工具 ,然后使用鼠标选择椭球体的外侧,如图 3A 所示。
注意:要放大或缩小图像,请按 Ctrl 键并使用鼠标向下或向上滚动,或按 Ctrl 键并使用键盘上的向上或向下箭头键。 - 选择 “分析”|” 测量以打开 结果 窗口,其中显示测量值。
- 使用 面积 值,使用公式 (2) 计算椭球体的大小(直径):
(二) - 循环指数在“结果”窗口中以“Circ.”给出,并由软件使用公式(3)自动计算:
(三)
注意:圆度指数 1.0 表示完美的球形,而接近 0.0 的值表示细长形状13。
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Representative Results
通过该方法形成每孔具有稳定尺寸和形状的单个球体。图2说明了ZFL和ZEM2S细胞的单个球体在轨道振荡(70rpm)下的ULA板孔中的形成过程。ZFL和ZEM2S细胞系在3D培养中具有不同的行为。ZEM2S细胞系具有自眼眶振荡第一天起就易于形成球状体形状的能力的特征(图2E),而ZFL细胞系需要5天才能达到所需的球状体形状(图2A-C)。该方法生成的微球在较长的培养时间(周期>5天)中也显示出形状稳定性,如图2D(16天大的ZFL球体)和图2H(10天大的ZEM2S球体)所示。通过使用用于处理和分析科学图像的软件测量其所获得图像中的投影面积来确定球体的直径和圆度13(图3)。 材料表指出了用于图像处理和分析的软件。ZFL细胞倾向于在眼眶振荡的第一天形成大的细胞聚集体(平均大小319±23.33μm),随着时间的推移而减少,直到第5天(225.62±19.20μm)(图4A),随着时间的推移增强培养中的循环度(图4B)。与ZFL细胞不同,ZEM2S细胞系从第一天(202.64±5.78μm)开始形成小球状体,直到第5天(226.63±4.80μm)逐渐增加(图4C)。图4E显示了3D培养中ZFL和ZEM2S细胞系中的不同生长模式。我们建议在第五天使用 ZFL 和 ZEM2S 球体,因为它们达到更高的球体形状(圆度指数分别为 0.80 ± 0.01 和 0.83 ± 0.00)(图 4B,D),这表明该 3D 模型的稳定性更高。
图 1:在圆底 96 孔板中生成 ZFL 和 ZEM2S 细胞系 3D 球状体的关键步骤。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:在轨道振荡下在圆底 96 孔 ULA 板中形成的 ZFL 和 ZEM2S 细胞系的单个球体。 ZFL细胞聚集体在OS(A)的第一天形成。细胞聚集体在第三天(B)增加其圆度,并在第5天(C)达到足够的球状体形状。(D)ULA板中16天大的ZFL球体。ZEM2S细胞系从OS(E)的第一天开始形成球状体。ZEM2S球体在第三天(F)保持其形状并增加尺寸,并在第5天(G)达到其最大圆度。(H) ULA 板中 10 天大的 ZEM2S 球体。比例尺 = 100 μm。缩写:OS = 眼眶震动;ULA = 超低附着力。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:使用用于处理和分析科学图像的软件确定微球的大小和圆度。 将软件设置为根据已知比例测量所选区域后,选择椭球体的外侧以确定其面积和圆度 (A)。通过计算直径 d 来确定球体的面积,软件通过使用所选面积和周长 (B) 的公式提供椭球体的圆度。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:3D 椭球体方法的重现性,通过均匀大小的球体(直径)和圆度(球体形状)显示。 ZFL(A)和ZEM2S(B)细胞系的球状体的测量大小。ZFL(C)和ZEM2S(D)球体的测量圆度指数。ZFL和ZEM2S球体的生长模式(E).数据代表来自不同细胞批次的三个技术重复。每个点上方的数字表示第 1、3 和 5 天一式三份的平均值。数据显示为平均±标准差(n = 10)。这个数字是从Souza等人12修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:在两种转速(70 和 100 rpm)下进行的 ZFL 和 ZEM2S 球体形成的比较。 ZFL球体(A)和ZEM2S球体(B)在以100rpm的轨道振荡5天后形成(比例尺代表100μm)。ZFL球体(C)和ZEM2S球体(D)的生长模式在70和100 rpm时形成。ZFL球体(E)和ZEM2S球体(F)的圆度指数在70和100 rpm时形成。数据显示为平均值±标准差 (n = 10)。 *表示统计学意义(p < 0.05)。NS:在第5天以70和100 rpm形成的微球之间的无显着差异(t检验)。这个数字是从Souza等人12修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图 6:在圆底超低附着孔板中通过轨道振荡形成的 ZFL 和 ZEM2S 球体(5 天龄)的细胞完整性和活力。凝集素Alexa Fluor 594(红色)细胞膜染色和DAPI(蓝色)细胞核染色证明了ZEM2S球体(A)和ZFL球体(B)核心的细胞完整性。由Alamarblue还原形成的试卤灵(红色)的荧光显示ZEM2S(C)和ZFL(D)球状体核心中的活细胞。这些图像代表使用共聚焦显微镜捕获的正交平面。ZEM2S (E) 和 ZFL 细胞系 (F) 的 3D 培养物(球状体)和 2D 培养中的 MTT 活力测定。数据显示在570nm处测量的吸光度平均值±标准偏差。ns:韦尔奇t检验的无显著差异。该数字已从Souza等人(2021)12修改而来。请点击此处查看此图的大图。
表1:ZFL和ZEM2S培养的解决方案。请按此下载此表格。
表 2:用于形成单个 ZFL 椭球体的 3D 椭球体方法的比较。 * 测试参数的最佳结果。 一个 从最佳结果中选择的参数验证了传统吊滴法。 b 从Baron等人3 中选择的参数,用于形成具有轨道振荡的鱼球体。 c 同样适合测试参数的变化。缩写:HD = 悬挂下降;OS = 眼眶震动;ULA = 超低附着力;聚HEMA = 聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)。此表已从 Souza 等人 12 修改而来。请按此下载此表格。
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Discussion
这是一种简单、简单且快速的生成斑马鱼肝脏和胚胎细胞系球状体的方法。该方法由该小组基于对现有3D球体方法的修改而开发,以克服与微球形成相关的科学研究中报告的问题,以及3D球体测定的数据准确性的不确定性。例如,报告的问题在于处理困难,生成微球的耗时性,选择相似尺寸和形状的微球进行测定的必要性,以及在悬挂液滴法3,7,12中将微球从液滴转移到微孔板的过程中的困难。此外,该协议建议在无CO2条件下培养ZFL和ZEM2S细胞系。该协议中提出的两种细胞系的培养基组成和无CO2环境在文献中广泛报道。ZFL细胞系通常在L-15和RPMI培养基中培养,添加或不添加碳酸氢钠,不添加CO214,15,16,17,18,19,20。ZEM2S细胞系根据生物资源中心的说明进行培养,其培养基配制用于无CO2培养物;因此,当使用这种类型的培养基21时,CO2和空气混合物可能对细胞有害。
目前的鱼球体方案是在评估几个参数(即不同的细胞密度、轨道振荡速度 [70 或 100 rpm] 以及使用不同的 96 孔板 [平底或圆底])后开发的,以确定形成 ZFL 球状体的最佳参数。此外,还与其他3D培养方法(即吊滴法和吊滴法结合轨道振荡法)进行了比较,表明圆底ULA板的轨道振荡具有最佳性能(即简单,快速和可重复的方法)。 表2 显示了评估形成ZFL球状体的其他3D培养方法的参数和性能。
据报道,圆底ULA板形成人体细胞的单个球状体,然后离心22 或眼眶振荡23,24。在该协议中,我们建议使用相同的板,除了在轨道振荡下产生斑马鱼细胞系的单个球体(即,96孔板的每孔一个球体)。这是特别有利的,因为它可以容易和快速地形成大量的球状体,并且形成的球体可以保持在同一板上的培养物中。因此,可以直接在ULA板上进行化学暴露,以执行不同类型的毒性测定。
为了确定形成ZFL和ZEM2S球体的适当轨道振荡速度,我们比较了球体在70和100 rpm下的形成。结果表明,该方法在70 rpm时表现更好,更高的转速可以显着影响ZEM2S球体的大小和形状(图5D,F)。在这些转速下,ZFL球体在尺寸和形状上没有表现出显着差异;然而,在100 rpm下获得较低的圆度指数,在较高的转速下显示出球体形状的负面影响(图5C,E)。
3,500个ZEM2S细胞和7,000个ZFL细胞的初始细胞密度在培养的第五天产生具有相似大小的球状体(分别为226.63和225.62μm)。鉴于氧和营养物质通过微球25中的扩散运输,它们的直径可能会强烈影响球体核心的营养和细胞完整性;通常,建议使用最大100μm的微球以避免坏死核心26。为了验证球状体核心中的细胞完整性,我们通过共聚焦显微镜用DAPI和凝集素Alexa Fluor 594进行免疫染色来评估细胞核和膜的完整性(图6A,B),并证明了球体的完整性。通过将它们暴露于刃天青(Alamarblue)并通过共聚焦显微镜分析试卤灵的荧光,也验证了球状体核心中的细胞活力(图6C,D)。当细胞存活时,刃天青通过细胞代谢功能还原为试卤灵(荧光物质)。MTT测定的性能也表明,将ZFL和ZEM2S球状体与单层培养(2D培养)进行比较,细胞活力没有显着差异(图6E,F)。尽管球状体大于100μm,但结果表明,该方案产生ZFL和ZEM2S细胞系的活球体,即使在其内部也具有足够的营养。
ZFL和ZEM2S细胞的细胞密度以及该协议中应用的轨道振荡速度允许形成尺寸和形状非常稳定的球体,孔之间的变异性低(图4),避免了选择足够的球体作为执行测定的先前步骤。如果测定程序需要将球状体转移到其他板或管/微管上,则可以使用微量移液器轻松转移它们,而不会发生解聚问题。
在这里,我们展示了一种基于最佳参数开发的协议,以形成可行的ZFL和ZEM2S球体。ZFL和ZEM2S细胞系可用于水生毒性测试,以估计对鱼类的化学影响23,24,27,28,29,30。此外,还可以使用鱼类胚胎细胞系研究发育终点,例如ZEM2S细胞系(胚泡期的成纤维细胞),其保留一定程度的多能性28。这些使得这些斑马鱼球状体可能可用于鱼类毒性测试。此外,作为一种简单的鱼球状体方法,它可以用于高通量生态毒性测试,支持其在工业界和学术界的应用。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
为了纪念这部作品的合著者Márcio Lorencini博士,他是化妆品领域的优秀研究人员,致力于促进巴西的化妆品研究。作者感谢生理学系(UFPR)的多用户实验室提供设备,并感谢高等教育人员改进协调组织(CAPES,巴西)(财务代码001)和Grupo Boticário的财政支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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