Summary
Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).
Abstract
Viscellijnen zijn veelbelovende in vitro modellen voor ecotoxiciteitsbeoordeling; conventionele monolaagcultuursystemen (2D-cultuur) hebben echter bekende beperkingen (bijv. Levensduur van de cultuur en behoud van sommige in vivo cellulaire functies). Zo zijn 3D-culturen, zoals sferoïden, voorgesteld, omdat deze modellen weefselachtige structuren kunnen reproduceren, waardoor de in vivo omstandigheden beter worden heroverd. Dit artikel beschrijft een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden met twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt). Het protocol bestaat uit het plateren van de cellen in een ronde bodem, ultra-lage aanhechting, 96-well plaat. Na 5 dagen onder orbitaal schudden (70 rpm) wordt een enkele sferoïde per put gevormd. De gevormde sferoïden hebben een stabiele grootte en vorm, en deze methode voorkomt de vorming van meerdere sferoïden in een put; Het is dus niet nodig om sferoïden van vergelijkbare grootte met de hand te selecteren. Het gemak, de snelheid en de reproduceerbaarheid van deze sferoïde methode maken het nuttig voor high-throughput in vitro tests.
Introduction
Sferoïden zijn kleine bolletjes cellen die worden gevormd wanneer cellen worden gekweekt in nauw cel-tot-celcontact in 3D-cultuur. Het vermogen van sferoïden om de in vivo weefselomgeving na te bootsen is al bestudeerd in een verscheidenheid aan cellijnen en primaire cellen 1,2. Hoewel sferoïden goed ontwikkeld zijn voor toxiciteitsstudies bij zoogdieren, is de ontwikkeling van sferoïden voor toxiciteitsstudies met gewervelde dieren van niet-zoogdieren (bijv. vissen) nog steeds aan de gang3. Voor viscellijnen zijn sferoïden ontwikkeld met behulp van verschillende methoden, zoals orbitaal schudden (OS) met behulp van verschillende soorten putplaten 3,4,5,6,7, en de methode van magnetische levitatie met behulp van magnetische nanodeeltjes8. Sommige van deze kweekmethoden voor sferoïden kunnen echter meer nadelen hebben dan andere.
Tolmethoden in grote microplaten (24-putplaten) kunnen bijvoorbeeld een groot aantal sferoïden genereren die verschillen in grootte en vorm; Inderdaad, multi-sferoïde structuurvorming is aangetoond7. Dit vereist intense inspanningen om sferoïden met een vergelijkbare grootte en vorm met de hand te selecteren voor een experiment. De hanging drop 3D-cultuurmethode wordt vaak gebruikt voor het genereren van sferoïden van zoogdiercellijnen 1,2,9,10,11, waarbij enkele sferoïden per druppel kunnen worden gegenereerd, waardoor de hierboven beschreven problemen worden vermeden. Hoewel een aangepaste hangende druppelmethode (hangende druppel + orbitaal schudden) in staat is om ZFL-sferoïden te genereren met behulp van een goedkope methode, heeft het zijn nadelen12. De gevormde cellulaire aggregaten kunnen niet gedurende lange perioden in de druppels worden bewaard; ze moeten dus worden overgebracht naar putplaten. Dit proces vereist intensieve hantering en lange perioden van werk in een laminaire stromingskap, omdat het druppelsgewijs wordt uitgevoerd met behulp van een micropipette12. Bovendien vereist deze methode 10 dagen om de ZFL-sferoïden volledig te vormen (5 dagen in hangende druppel + 5 dagen in OS)12. Deze nadelen kunnen de toepassing van 3D-vissferoïden voor toxiciteitstests beperken, vooral gezien mogelijke toepassingen voor chemische prioritering en productduurzaamheid.
Zo beschrijft dit artikel een 3D-kweekprotocol dat in staat is om enkele sferoïden van ZFL (D. rerio normale hepatocyt) en ZEM2S (D. rerio blastula fase embryo) cellijnen te genereren op basis van het gecombineerde gebruik van 96-well, ultra-lage bevestigingsplaten (ULA-platen) en een orbitale shaker (22 mm rotatiediameter). De toegepaste methode is eenvoudig en reproduceerbaar en kan in een korte periode (5 dagen) grote aantallen sferoïden van vergelijkbare grootte en vorm genereren. De voordelen van deze methode kunnen de toepassing van 3D-modellen voor aquatische toxiciteitsstudies in zowel de industrie als de academische wereld ondersteunen, evenals de voortgang van de implementatie van alternatieve methoden voor ecotoxiciteitstests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De belangrijkste stappen voor het genereren van 3D-sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen in een ronde bodem met 96-putplaat worden weergegeven in figuur 1.
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen die in dit protocol worden gebruikt en Tabel 1 voor oplossingen en kweekmedia die in dit protocol worden gebruikt.
1. Celkweekmedium en monolaagculturen
- Kweek beide cellijnen (ZFL, ZEM2S) als monolagen in een incubator bij 28 °C zonder CO2, en subcultuur ze in een subcultivatieverhouding van 1:3 wanneer ze ~80% samenvloeiing bereiken.
- Begin met een T75-kolf van zebraviscellen bij ~ 80% samenvloeiing, gekweekt zoals hierboven beschreven.
- Verwijder het volledige medium en was de cellen door 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,01 M) toe te voegen aan de kweekkolf met behulp van een pipet.
- Voeg met behulp van een pipet 3 ml 1x trypsine-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) toe aan de kweekkolven en incubeer gedurende 3 minuten bij 28 °C voor het losmaken van cellen uit de kolf.
- Tik zachtjes op de kolf om de cellen vrij te maken en stop vervolgens de trypsinevertering door 3 ml volledig kweekmedium aan de kolf toe te voegen.
- Breng met behulp van een pipet de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 100 × g .
- Verwijder na de pelletvorming voorzichtig het supernatant, voeg 1 ml van het volledige medium toe voor de respectieve cellijn in gebruik (ZFL of ZEM2S) en resuspensie met behulp van een micropipette. Neem een aliquot voor celtelling.
2. Celtelling met trypan blauwe kleurstofuitsluitingstest
- Voeg 10 μL van de celsuspensie en 10 μL trypanblauwe kleurstof toe aan een microbuis om de cellen te tellen en hun levensvatbaarheid te evalueren. Meng de celsuspensie en verf met behulp van een pipet.
- Breng vervolgens 10 μL van dit mengsel (celsuspensie + trypanblauw) over naar een Neubauer-kamer en tel de cellen in de vier grote vierkanten (kwadranten: Q) die op de hoeken van de kamer zijn geplaatst, waarbij cellen die trypanblauw niet opnemen als levensvatbaar worden beschouwd. Bereken het aantal levensvatbare cellen met behulp van vergelijking (1):
(1) - Om het uiteindelijke celnummer in de celsuspensie te berekenen, vermenigvuldigt u het celnummer dat is bepaald met behulp van vergelijking (1) met 2 (de verdunningsfactor als gevolg van het gebruik van trypanblauw).
OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd celtelsysteem worden gebruikt.
(1)3. Celplating in ULA-platen
- Na het berekenen van het celnummer, stel de celsuspensie in op plaat 200 μL van deze suspensie per put van een 96-well round-bottom ULA-plaat met het aantal cellen dat nodig is voor elke cellijn, zoals hieronder aangegeven:
- Plaat 7.000 levensvatbare ZFL-cellen / put; gebruik dus voor de gehele ULA-plaat 700.000 cellen in 20 ml compleet medium.
- Plaat 3.500 levensvatbare ZEM2S-cellen / put; gebruik dus voor de gehele ULA-plaat 350.000 cellen in 20 ml compleet medium.
- Bereid de celsuspensie voor met de aangepaste concentratie van cellen in een mediumreservoir en meng het met behulp van een meerkanaals micropipette, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schuim of bubbels worden gevormd. Voeg met behulp van de meerkanaals micropipet 200 μL van de aangepaste celsuspensie toe aan elk putje van de ULA-plaat.
OPMERKING: De plaat moet worden afgedicht met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van het kweekmedium van de 96-putplaat te voorkomen.
4. Sferoïde vorming
- Incubeer de ULA-plaat op een orbitale shaker bij 70 rpm gedurende 5 dagen in een incubator van 28 °C. Laat de sferoïden zich vormen gedurende 5 dagen orbitaal schudden (figuur 2), met een gemiddelde diameter van ~225 μm (ZFL-sferoïden) en ~226 μm in diameter (ZEM2S-sferoïden)12.
OPMERKING: Na 5 dagen incubatie (maximale circulariteit) zijn de sferoïden klaar voor gebruik. - Om de sferoïden langer dan 5 dagen in cultuur te houden, verwijdert u elke 5 dagen 100 μL van het gebruikte medium en voegt u 100 μL vers compleet kweekmedium toe met behulp van een meerkanaals micropipette.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de sferoïden tijdens dit proces niet opzuigt.
5. Het meten van grootte (diameter) en vorm (circulariteitsindex) van sferoïden
- Verkrijg de afbeeldingen.
- Verkrijg onder een microscoop voor omgekeerd licht met een beeldopnamesysteem een beeld van een gedefinieerde schaal.
OPMERKING: Gebruik een microscoopfasekalibratieplaat of een Neubauer-dia (waarin de kwadrantmaten bekend zijn) om de schaal te verkrijgen. - Onder de microscoop en met behulp van dezelfde objectieve lens die wordt gebruikt om het beeld van de schaal te verkrijgen, verkrijgt u beelden van de volledig gevormde sferoïden (d.w.z. 5 dagen oude sferoïden).
OPMERKING: Alle foto's moeten worden gemaakt met hetzelfde beeldopnamesysteem, omdat de beeldresolutie belangrijk is om de grootte en vorm van de sferoïden te bepalen en dit kan verschillen tussen soorten systemen.
- Verkrijg onder een microscoop voor omgekeerd licht met een beeldopnamesysteem een beeld van een gedefinieerde schaal.
- Stel de schaal in.
- Open met de ImageJ-software de afbeelding van de gedefinieerde schaal (klik op Bestand | openen).
- Selecteer de rechtlijnige kiezer op de werkbalk en sleep met de muis een lijn uit over de extensie van de gedefinieerde schaal in de afbeelding.
- Stel de schaal in door Analyseren | Stel schaal in en wacht tot het venster Schaal instellen wordt geopend.
- Vul in het venster Schaal instellen de lege ruimte van Bekende afstand in met de bekende afstand (μm) die overeenkomt met de rechte lijn; vul de eenheid van lengte met um voor μm. Klik op OK.
OPMERKING: De schaal in pixels/μm wordt onder aan het venster weergegeven.
- Stel de meetparameters in.
- Selecteer in de ImageJ-software de optie Analyseren | Stel metingen in om het venster Metingen instellen te openen.
- Schakel in het venster Metingen instellen de vakjes in voor de gewenste metingen (d.w.z. gebieds- en vormdescriptoren). Klik op OK.
- Verkrijg de diameter en circulariteit van de sferoïden.
- Open de afbeelding van een sferoïde (Bestand | Open).
- Selecteer het selectiegereedschap uit de vrije hand op de werkbalk en selecteer met de muis de buitenzijde van de sferoïde, zoals weergegeven in figuur 3A.
OPMERKING: Als u wilt in- of uitzoomen op de afbeelding, drukt u op de Ctrl-toets en gebruikt u de muis om omlaag of omhoog te scrollen, of drukt u op de Ctrl-toets en gebruikt u de pijltoetsen omhoog of omlaag op het toetsenbord. - Selecteer Analyseren | Meten om het venster Resultaten te openen, waarin de gemeten waarden worden weergegeven.
- Bereken met behulp van de oppervlaktewaarde de grootte (diameter) van de sferoïden met behulp van vergelijking (2):
(2) - De circulariteitsindex wordt in het venster Resultaten gegeven als "Circ.", en wordt automatisch berekend door de software met behulp van vergelijking (3):
(3)
OPMERKING: De circulariteitsindex van 1,0 vertegenwoordigt een perfecte bolvorm, terwijl een waarde in de buurt van 0,0 een langwerpige vorm13 aangeeft.
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enkele sferoïden per put met een stabiele grootte en vorm worden door deze methode gevormd. Figuur 2 illustreert het vormingsproces van enkele sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellen in een put van een ULA-plaat onder orbitaal schudden (70 rpm). De ZFL- en ZEM2S-cellijnen hebben verschillende gedragingen in 3D-cultuur. De ZEM2S-cellijn vertoont kenmerken die het vermogen verlenen om gemakkelijk een bolvorm te vormen sinds de eerste dag van het orbitale schudden (figuur 2E), terwijl de ZFL-cellijn 5 dagen nodig heeft om de gewenste sferoïdale vorm te bereiken (figuur 2A-C). De sferoïden die door deze methode werden gegenereerd, vertoonden ook stabiliteit in termen van vorm in langere perioden van cultuur (perioden >5 dagen), zoals aangetoond in figuur 2D (16 dagen oude ZFL-sferoïde) en figuur 2H (10 dagen oude ZEM2S-sferoïde). De diameter en circulariteit van de sferoïden werden bepaald door hun geprojecteerde gebied in de verkregen beelden te meten met behulp van software voor het verwerken en analyseren van wetenschappelijke beelden13 (figuur 3). De Tabel met materialen geeft de software aan die wordt gebruikt voor beeldverwerking en -analyse. ZFL-cellen hebben de neiging om grote celaggregaten te vormen (gemiddelde grootte 319 ± 23,33 μm) op de eerste dag van orbitaal schudden, die in de loop van de tijd afneemt tot dag 5 (225,62 ± 19,20 μm) (figuur 4A), waardoor de circulariteit in de loop van de tijd in cultuur wordt verbeterd (figuur 4B). In tegenstelling tot ZFL-cellen vormt de ZEM2S-cellijn vanaf de eerste dag (202,64 ± 5,78 μm) kleine sferoïden, die geleidelijk toenemen tot dag 5 (226,63 ± 4,80 μm) (figuur 4C). Figuur 4E toont de verschillende groeipatronen in de ZFL- en ZEM2S-cellijnen in 3D-cultuur. We raden aan om de ZFL- en ZEM2S-sferoïden op de vijfde dag te gebruiken omdat ze een hogere sferoïdale vorm bereiken (circulariteitsindex van respectievelijk 0,80 ± 0,01 en 0,83 ± 0,00) (figuur 4B, D), wat wijst op een grotere stabiliteit van dit 3D-model.
Figuur 1: De belangrijkste stappen om 3D-sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen te genereren in een ronde bodem 96-putplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Enkele sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen gevormd in 96-well ULA-platen met ronde bodem onder orbitaal schudden. Een ZFL-celaggregaat wordt gevormd op de eerste dag van OS (A). Het celaggregaat verhoogt zijn circulariteit op de derde dag (B) en bereikt een adequate sferoïdale vorm op dag 5 (C). (D) Een 16 dagen oude ZFL-sferoïde in ULA-plaat. De ZEM2S-cellijn vormt sferoïden vanaf de eerste dag van OS (E). De ZEM2S-sferoïde behoudt zijn vorm en neemt in omvang toe op de derde dag (F), en zijn maximale circulariteit wordt bereikt op dag 5 (G). (H) Een 10 dagen oude ZEM2S sferoïde in een ULA-plaat. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: OS = orbitaal schudden; ULA = ultralage hechting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het bepalen van de grootte en circulariteit van sferoïden met behulp van software voor het verwerken en analyseren van wetenschappelijke beelden. Nadat u de software hebt ingesteld om een geselecteerd gebied te meten op basis van een bekende schaal, selecteert u de buitenzijde van de sferoïde om het gebied en de circulariteit (A) te bepalen. Het gebied van de sferoïde wordt gebruikt om de grootte te bepalen door de diameter d te berekenen, en de software biedt de circulariteit van de sferoïde door een formule die het geselecteerde gebied en de geselecteerde omtrek (B) gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Reproduceerbaarheid van de 3D-sferoïdemethode aangetoond door sferoïden van uniforme grootte (diameter) en circulariteit (sferoïdale vorm). De gemeten grootte van sferoïden van de ZFL (A) en ZEM2S (B) cellijnen. De gemeten circulariteitsindex van ZFL (C) en ZEM2S (D) sferoïden. Het groeipatroon van ZFL en ZEM2S sferoïden (E). De gegevens zijn representatief voor drie technische replicaties uit verschillende celbatches. De getallen boven elk punt geven het gemiddelde van de drievouden voor dag 1, 3 en 5 aan. De gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 10). Dit cijfer is aangepast van Souza et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking tussen de vorming van ZFL- en ZEM2S-sferoïden uitgevoerd bij twee rotatiesnelheden (70 en 100 tpm). Een ZFL-sferoïde (A) en ZEM2S-sferoïde (B) gevormd na 5 dagen orbitaal schudden bij 100 tpm (schaalstaven vertegenwoordigen 100 μm). Het groeipatroon van ZFL-sferoïden (C) en ZEM2S-sferoïden (D) vormde zich bij 70 en 100 tpm. De circulariteitsindex van ZFL-sferoïden (E) en ZEM2S-sferoïden (F) werd gevormd bij 70 en 100 tpm. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (n = 10). *geeft statistische significantie aan (p < 0,05). N.S.: Niet-significant verschil (T-test) tussen sferoïden gevormd op dag 5 bij 70 en 100 tpm. Dit cijfer is aangepast van Souza et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: De cellulaire integriteit en levensvatbaarheid van ZFL- en ZEM2S-sferoïden (5 dagen oud) gevormd door orbitaal schudden in een ultralage aanhechtingsputplaat met ronde bodem. Kleuring van celmembranen door Lectine Alexa Fluor 594 (rood) en kernen door DAPI (blauw) tonen de cellulaire integriteit in de kern van een ZEM2S-sferoïde (A) en ZFL-sferoïde (B). Fluorescentie van resorufine (rood) gevormd door een reductie van Alamarblue toont levensvatbare cellen in de kern van zowel de ZEM2S (C) als ZFL (D) sferoïden. De beelden stellen orthogonale vlakken voor die zijn vastgelegd met een confocale microscoop. MTT levensvatbaarheidstest in 3D-cultuur (sferoïden) en 2D-cultuur van de ZEM2S (E) en ZFL-cellijn (F). De gegevens werden weergegeven als gemiddelde absorptie gemeten bij 570 nm ± standaardafwijking. ns: niet-significant verschil door Welch's t-test. Dit cijfer is aangepast van Souza et al. (2021)12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Oplossingen voor ZFL en ZEM2S teelt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Vergelijking van de 3D-sferoïdemethoden die worden gebruikt om enkele ZFL-sferoïden te vormen. * Het beste resultaat voor een geteste parameter. een De geselecteerde parameter uit de beste resultaten geverifieerd in de conventionele hangende valmethode. b De geselecteerde parameter van Baron et al.3 voor het vormen van een vissferoïde met orbitaal schudden. c Variaties die even geschikt zijn voor een geteste parameter. Afkortingen: HD = hangende druppel; OS = orbitaal schudden; ULA = ultralage hechting; poly-HEMA = poly(2-hydroxyethylmethacrylaat). Deze tabel is aangepast van Souza et al.12. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is een eenvoudige, gemakkelijke en snelle methode voor het genereren van sferoïden van zebravislever en embryonale cellijnen. Deze methode is ontwikkeld door deze groep op basis van modificaties van bestaande 3D-sferoïdemethoden om problemen te overwinnen die zijn gemeld in wetenschappelijke studies met betrekking tot sferoïdevorming, evenals onzekerheden in de nauwkeurigheid van gegevens van 3D-sferoïde-assays. De gemelde problemen liggen bijvoorbeeld in moeilijkheden bij de hantering, de tijdrovende aard van het genereren van sferoïden, de noodzaak om sferoïden van een vergelijkbare grootte en vorm te selecteren om een test uit te voeren, evenals moeilijkheden bij het overbrengen van sferoïden van de druppels naar microplaten in de hangende druppelmethode 3,7,12. Verder beveelt dit protocol de cultuur van ZFL- en ZEM2S-cellijnen aan in een CO2-vrije toestand. De samenstelling van het kweekmedium en de CO2-vrije omgeving die in dit protocol voor beide cellijnen wordt voorgesteld, worden in de literatuur op grote schaal gerapporteerd. De ZFL-cellijn wordt meestal gekweekt in L-15- en RPMI-media met of zonder toevoeging van natriumbicarbonaat en zonder CO2 14,15,16,17,18,19,20. De ZEM2S-cellijn wordt gekweekt volgens de instructies van het bioresourcecentrum en de kweekmedia zijn geformuleerd voor CO2-vrije culturen; CO2 en luchtmengsel kunnen dus schadelijk zijn voor cellen bij het gebruik van dit type kweekmedia21.
Het huidige vissferoïde protocol werd ontwikkeld na evaluatie van verschillende parameters (d.w.z. verschillende celdichtheden, snelheid van orbitaal schudden [70 of 100 rpm] en het gebruik van verschillende 96-putplaten [platte bodem of ronde bodem]) om de beste parameters te bepalen om ZFL-sferoïden te vormen. Bovendien werd een vergelijking gemaakt met andere 3D-kweekmethoden (d.w.z. de hangende druppelmethode en de hangende druppelmethode in combinatie met de orbitale schudmethode), wat aangeeft dat het orbitale schudden van ULA-platen met ronde bodem de beste prestaties had (d.w.z. eenvoudige, snelle en reproduceerbare methode). Tabel 2 toont de parameters en prestaties van andere 3D-cultuurmethoden die zijn geëvalueerd om ZFL-sferoïden te vormen.
Van ULA-platen met ronde bodem is al gemeld dat ze enkele sferoïden van menselijke cellen vormen, gevolgd door centrifugatie22 of orbitaal schudden23,24. In dit protocol stellen we het gebruik van dezelfde plaat voor, behalve onder orbitaal schudden om enkele sferoïden van zebraviscellijnen te genereren (d.w.z. één sferoïde per put van een 96-putplaat). Dit is vooral voordelig omdat het gemakkelijk en snel een goede hoeveelheid sferoïden kan vormen en de gevormde sferoïden in cultuur op dezelfde plaat kunnen worden gehouden. Chemische blootstelling kan dus direct op de ULA-plaat worden gedaan om verschillende soorten toxiciteitstests uit te voeren.
Om de juiste orbitale schudsnelheid te bepalen om ZFL- en ZEM2S-sferoïden te vormen, vergeleken we de vorming van de sferoïden bij 70 en 100 tpm. De resultaten laten zien dat deze methode beter presteert bij 70 tpm en dat een hogere rotatiesnelheid de grootte en vorm van ZEM2S-sferoïden aanzienlijk kan beïnvloeden (figuur 5D, F). ZFL-sferoïden vertoonden geen significante verschillen in grootte en vorm bij deze rotatiesnelheden; bij 100 tpm werden echter lagere circulariteitsindexen verkregen, die een negatieve impact in bolvorm bij een hogere rotatiesnelheid lieten zien (figuur 5C,E).
De initiële celdichtheid van 3.500 ZEM2S-cellen en 7.000 ZFL-cellen genereert sferoïden met vergelijkbare groottes op de vijfde dag in cultuur (respectievelijk 226,63 en 225,62 μm). Aangezien zuurstof en voedingsstoffen worden getransporteerd door diffusie in sferoïden25, kan hun diameter de voeding en cellulaire integriteit in de kern van sferoïden sterk beïnvloeden; Over het algemeen worden sferoïden tot 100 μm aanbevolen om necrotische kern26 te vermijden. Om de cellulaire integriteit in de kern van de sferoïden te verifiëren, evalueerden we de nucleaire en membraanintegriteit door immunostaining met DAPI en Lectine Alexa Fluor 594 door confocale microscopie (figuur 6A, B), en de integriteit van de sferoïden werd aangetoond. De cellulaire levensvatbaarheid in de kern van de sferoïden werd ook geverifieerd door ze bloot te stellen aan resazurine (Alamarblue) en de fluorescentie van resorufine te analyseren met een confocale microscoop (figuur 6C, D). Wanneer de cellen levensvatbaar zijn, wordt het resazurine gereduceerd tot resorufine (fluorescerende stof) door cellulaire metabole functie. De prestaties van de MTT-test toonden ook geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen bij vergelijking van ZFL- en ZEM2S-sferoïden met monolaagcultuur (2D-cultuur) (figuur 6E, F). Hoewel de sferoïden groter zijn dan 100 μm, tonen de resultaten aan dat dit protocol levensvatbare sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen genereert met voldoende voeding, zelfs in hun binnenste gedeelte.
De celdichtheden van ZFL- en ZEM2S-cellen en de snelheid van orbitaal schudden toegepast in dit protocol maakten de vorming van zeer stabiele sferoïden in grootte en vorm mogelijk, met lage variabiliteit tussen de putten (figuur 4), waardoor de noodzaak om adequate sferoïden te selecteren als een eerdere stap van het uitvoeren van een test werd vermeden. Als de testprocedure vereist dat de sferoïden worden overgebracht naar andere platen of buisjes / microbuizen, kunnen ze gemakkelijk worden overgebracht met een micropipette zonder desaggregatieproblemen.
Hier demonstreerden we een protocol dat is ontwikkeld op basis van de beste parameters om levensvatbare ZFL- en ZEM2S-sferoïden te vormen. De ZFL- en ZEM2S-cellijnen kunnen nuttig zijn bij aquatische toxiciteitstests om chemische effecten op vissen te schatten 23,24,27,28,29,30. Bovendien kunnen ontwikkelingseindpunten ook worden bestudeerd met behulp van visembryocellijnen, zoals de ZEM2S-cellijn (fibroblastcellen van de blastulafase), die een mate van pluripotentie28 behouden. Deze maken deze zebravissferoïden potentieel nuttig voor het testen van vistoxiciteit. Bovendien kan het, als een eenvoudige vissferoïde methode, worden gebruikt in ecotoxiciteitstests met hoge doorvoer, ter ondersteuning van de toepassing ervan in de industrie en de academische wereld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) dankbaar voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
- Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
- Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470 (2022).
- Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837 (2017).
- Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947 (2018).
- Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
- Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161 (2016).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).
- Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
- de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
- Ferreira, T., Rasband, W.
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
- Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
- Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
