Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).
Abstract
Linhagens celulares de peixes são modelos in vitro promissores para avaliação de ecotoxicidade; no entanto, os sistemas convencionais de cultura monocamada (cultura 2D) têm limitações bem conhecidas (por exemplo, longevidade da cultura e manutenção de algumas funções celulares in vivo ). Assim, culturas 3D, como os esferoides, têm sido propostas, uma vez que esses modelos podem reproduzir estruturas semelhantes a tecidos, recapturando melhor as condições in vivo . Este artigo descreve um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides com duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal). O protocolo consiste em plaquear as células em uma placa de fundo redondo, ultrabaixa e de 96 poços. Após 5 dias sob agitação orbital (70 rpm), um único esferoide por poço é formado. Os esferoides formados apresentam tamanho e forma estáveis, e este método evita a formação de múltiplos esferoides em um poço; assim, não é necessário escolher esferoides de tamanhos semelhantes. A facilidade, velocidade e reprodutibilidade deste método esferoide o tornam útil para testes in vitro de alto rendimento.
Introduction
Esferoides são pequenas esferas de células formadas quando as células são cultivadas em contato próximo célula a célula em cultura 3D. A capacidade dos esferoides de mimetizar o ambiente tecidual in vivo já foi estudada em uma variedade de linhagens celulares e célulasprimárias1,2. No entanto, embora os esferoides estejam bem desenvolvidos para estudos de toxicidade em mamíferos, o desenvolvimento de esferoides para estudos de toxicidade com vertebrados não mamíferos (por exemplo, peixes) ainda está em andamento3. Para linhagens celulares de peixes, esferoides têm sido desenvolvidos por uma variedade de métodos diferentes, como o orbital shaking (OS) usando diferentes tipos de placas de poço3,4,5,6,7, e o método de levitação magnética usando nanopartículas magnéticas8. No entanto, alguns desses métodos de cultivo para esferoides podem ter mais desvantagens do que outros.
Por exemplo, métodos giratórios em microplacas grandes (placas de 24 poços) podem gerar um alto número de esferoides diferindo em tamanho e forma; De fato, a formação de estruturas multiesferóides tem sido demonstrada7. Isso requer esforços intensos para escolher esferoides com tamanho e forma semelhantes para um experimento. O método de cultura 3D em gota suspensa é comumente utilizado para geração de esferoides de linhagens celulares de mamíferos 1,2,9,10,11, onde esferoides únicos por gota podem ser gerados, evitando os problemas descritos acima. No entanto, embora um método de queda suspensa modificado (queda suspensa + agitação orbital) seja capaz de gerar esferoides ZFL usando um método barato, ele tem suas desvantagens12. Os agregados celulares formados não podem ser mantidos por longos períodos nas gotas; assim, eles precisam ser transferidos para placas de poço. Esse processo requer manuseio intenso e longos períodos de trabalho em capela de fluxo laminar, pois é realizado em gota a gota com o uso de uma micropipeta12. Além disso, esse método requer 10 dias para formar completamente os esferoides ZFL (5 dias em gota suspensa + 5 dias em EO)12. Essas desvantagens podem limitar a aplicação de esferoides de peixes 3D para testes de toxicidade, especialmente considerando potenciais aplicações para priorização química e sustentabilidade do produto.
Assim, este artigo descreve um protocolo de cultura 3D capaz de gerar esferoides únicos de linhagens celulares ZFL (D. rerio hepatócito normal) e ZEM2S (embrião fase blastula de D. rerio) baseado no uso combinado de placas de fixação ultrabaixas de 96 poços (placas ULA) e um agitador orbital (22 mm de diâmetro rotacional). O método aplicado é simples e reprodutível, podendo gerar um grande número de esferoides de tamanho e forma semelhantes em um curto período (5 dias). As vantagens deste método podem apoiar a aplicação de modelos 3D de peixes para estudos de toxicidade aquática na indústria e no meio acadêmico, bem como o progresso da implementação de métodos alternativos para testes de ecotoxicidade.
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Protocol
Os principais passos para gerar esferoides 3D de linhas celulares ZFL e ZEM2S em uma placa de fundo redondo de 96 poços são apresentados na Figura 1.
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais usados neste protocolo e a Tabela 1 para soluções e meios de cultura usados neste protocolo.
1. Meio de cultura celular e culturas de monocamada
- Cultivar ambas as linhagens celulares (ZFL, ZEM2S) como monocamadas em uma incubadora a 28 °C sem CO2, e subcultá-las em uma proporção de subcultivo de 1:3 quando atingirem ~80% de confluência.
- Comece com um frasco T75 de células de peixe-zebra a ~80% de confluência, cultivado como descrito acima.
- Retirar o meio completo e lavar as células adicionando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (0,01 M) ao frasco de cultura com o auxílio de uma pipeta.
- Com o auxílio de uma pipeta, adicionar 3 mL de EDTA 1x tripsina-0,5 mM (0,05% [v/v]) aos frascos de cultura e incubar a 28 °C por 3 min para o desprendimento das células do frasco.
- Tocar suavemente no balão para libertar as células e, em seguida, interromper a digestão de tripsina adicionando 3 ml de meio de cultura completo ao balão.
- Com uma pipeta, transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL e centrifugar a 100 × g por 5 min.
- Após a formação do pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante, adicione 1 mL do meio completo para a respectiva linhagem celular em uso (ZFL ou ZEM2S) e ressuspenda usando uma micropipeta. Pegue uma alíquota para contagem de células.
2. Contagem celular com teste de exclusão do corante azul de tripano
- Adicionar 10 μL da suspensão celular e 10 μL do corante azul de tripano a um microtubo para contar as células e avaliar sua viabilidade. Misture a suspensão celular e o corante usando uma pipeta.
- Em seguida, transferir 10 μL dessa mistura (suspensão celular + azul de tripano) para uma câmara de Neubauer e contar as células nos quatro grandes quadrados (quadrantes: Q) colocados nos cantos da câmara, considerando viáveis as células que não absorvem o azul de tripano. Calcule o número de células viáveis usando a equação (1):
(1º) - Para calcular o número final de células na suspensão celular, multiplique o número de células determinado pela equação (1) por 2 (o fator de diluição devido ao uso do azul de tripano).
NOTA: Alternativamente, um sistema automatizado de contagem de células pode ser usado.
(1º)3. Revestimento celular em placas ULA
- Depois de calcular o número de células, ajuste a suspensão celular para a placa de 200 μL dessa suspensão por poço de uma placa ULA de fundo redondo de 96 poços com o número de células necessárias para cada linha celular, conforme indicado abaixo:
- Placa 7.000 células ZFL viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 700.000 células em 20 mL de meio completo.
- Placa 3.500 células ZEM2S viáveis/poço; assim, para toda a placa ULA, utilizar 350.000 células em 20 mL de meio completo.
- Prepare a suspensão celular com a concentração ajustada de células em um reservatório médio e misture-a usando uma micropipeta multicanal, tomando cuidado para não formar espuma ou bolhas. Usando a micropipeta multicanal, adicionar 200 μL da suspensão celular ajustada a cada poço da placa ULA.
NOTA: A placa deve ser selada com parafilme ou folha de vedação adesiva para evitar a evaporação do meio de cultura da placa de 96 poços.
4. Formação esferoide
- Incubar a placa ULA em um agitador orbital a 70 rpm por 5 dias em uma incubadora de 28 °C. Permitir que os esferoides se formem ao longo de 5 dias de agitação orbital (Figura 2), atingindo um tamanho médio de ~225 μm de diâmetro (esferoides ZFL) e ~226 μm de diâmetro (esferoides ZEM2S)12.
NOTA: Após 5 dias de incubação (circularidade máxima), os esferoides estão prontos para uso. - Para manter os esferoides em cultura por mais de 5 dias, remova 100 μL do meio gasto a cada 5 dias e adicione 100 μL de meio de cultura completo fresco usando uma micropipeta multicanal.
NOTA: Tome cuidado para não aspirar os esferoides durante este processo.
5. Medição do tamanho (diâmetro) e forma (índice de circularidade) dos esferoides
- Adquira as imagens.
- Sob um microscópio de luz invertida com um sistema de captura de imagens, obtenha-se uma imagem de uma escala definida.
NOTA: Use uma lâmina de calibração de estágio de microscópio ou uma lâmina de Neubauer (na qual os tamanhos dos quadrantes são conhecidos) para obter a escala. - Sob o microscópio e usando a mesma lente objetiva usada para obter a imagem da escala, obtenha imagens dos esferoides totalmente formados (ou seja, esferoides de 5 dias de idade).
NOTA: Todas as imagens devem ser tiradas usando o mesmo sistema de captura de imagem, pois a resolução da imagem é importante para determinar o tamanho e a forma dos esferoides, e pode diferir entre os tipos de sistemas.
- Sob um microscópio de luz invertida com um sistema de captura de imagens, obtenha-se uma imagem de uma escala definida.
- Defina a escala.
- Usando o software ImageJ, abra a imagem da escala definida (clique em Arquivo | abrir).
- Selecione o seletor de linha reta na barra de ferramentas e, usando o mouse, arraste uma linha pela extensão da escala definida na imagem.
- Defina a escala selecionando Analisar | Defina a escala e aguarde até que a janela Definir escala seja aberta.
- Na janela Definir escala, preencha o espaço em branco de Distância conhecida com a distância conhecida (μm) correspondente à reta; preencha a unidade de comprimento com um para μm. Clique em OK.
NOTA: A escala em pixels/μm é exibida na parte inferior da janela.
- Defina os parâmetros de medição.
- No software ImageJ, selecione Analisar | Defina as medidas para abrir a janela Definir medidas .
- Na janela Definir medidas, selecione as caixas para as medidas desejadas (ou seja, descritores de área e forma). Clique em OK.
- Obter o diâmetro e circularidade dos esferoides.
- Abrir a imagem de um esferoide (Arquivo | Aberto).
- Selecione a ferramenta de seleção à mão livre na barra de ferramentas e, usando o mouse, selecione o lado externo do esferoide, conforme demonstrado na Figura 3A.
Observação : para ampliar ou reduzir a imagem, pressione a tecla Ctrl e use o mouse para rolar para baixo ou para cima, ou pressione a tecla Ctrl e use as teclas de seta para cima ou para baixo no teclado. - Selecione Analisar | Medir para abrir a janela Resultados , na qual os valores medidos são exibidos.
- Usando o valor de área , calcule o tamanho (diâmetro) dos esferoides usando a equação (2):
(2º) - O índice de circularidade é dado na janela Resultados como "Circ.", e é calculado automaticamente pelo software usando a equação (3):
(3º)
NOTA: O índice de circularidade de 1,0 representa uma forma esferoidal perfeita, enquanto um valor próximo de 0,0 indica uma forma alongada13.
(2º)
(3º)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Esferoides únicos por poço com tamanho e forma estáveis são formados por este método. A Figura 2 ilustra o processo de formação de esferoides simples de células ZFL e ZEM2S em um poço de uma placa ULA sob agitação orbital (70 rpm). As linhagens celulares ZFL e ZEM2S apresentam comportamentos diferentes em cultura 3D. A linhagem celular ZEM2S apresenta características que conferem a capacidade de formar prontamente uma forma esferoidal desde o primeiro dia de agitação orbital (Figura 2E), enquanto a linhagem celular ZFL requer 5 dias para atingir a forma esferoidal desejável (Figura 2A-C). Os esferoides gerados por este método também apresentaram estabilidade em termos de forma em períodos mais longos de cultura (períodos >5 dias), como demonstrado na Figura 2D (esferoide ZFL de 16 dias) e Figura 2H (esferoide ZEM2S de 10 dias de idade). O diâmetro e a circularidade dos esferoides foram determinados medindo-se a área projetada nas imagens obtidas, utilizando-se um software para processamento e análise de imagenscientíficas13 (Figura 3). A Tabela de Materiais indica o software utilizado para processamento e análise das imagens. As células ZFL tendem a formar grandes agregados celulares (tamanho médio de 319 ± 23,33 μm) no primeiro dia de agitação orbitária, que diminui ao longo do tempo até o dia 5 (225,62 ± 19,20 μm) (Figura 4A), aumentando a circularidade ao longo do tempo em cultura (Figura 4B). Ao contrário das células ZFL, a linhagem celular ZEM2S forma pequenos esferoides a partir do primeiro dia (202,64 ± 5,78 μm), que aumentam progressivamente até o dia 5 (226,63 ± 4,80 μm) (Figura 4C). A Figura 4E mostra os diferentes padrões de crescimento nas linhagens celulares ZFL e ZEM2S em cultura 3D. Recomenda-se o uso dos esferoides ZFL e ZEM2S no quinto dia, pois atingem maior forma esferoidal (índice de circularidade de 0,80 ± 0,01 e 0,83 ± 0,00, respectivamente) (Figura 4B,D), o que indica maior estabilidade deste modelo 3D.
Figura 1: As principais etapas para gerar esferoides 3D de linhas celulares ZFL e ZEM2S em uma placa de fundo redondo de 96 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esferoides únicos de linhagens celulares ZFL e ZEM2S formados em placas ULA de fundo redondo de 96 poços sob agitação orbital. Um agregado celular ZFL é formado no primeiro dia de OS (A). O agregado celular aumenta sua circularidade no terceiro dia (B) e atinge uma forma esferoidal adequada no dia 5 (C). (D) Um esferoide ZFL de 16 dias em placa ULA. A linhagem celular ZEM2S forma esferoides a partir do primeiro dia de OS (E). O esferoide ZEM2S mantém sua forma e aumenta de tamanho no terceiro dia (F), e sua circularidade máxima é atingida no dia 5 (G). (H) Um esferoide ZEM2S de 10 dias em uma placa ULA. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: OS = agitação orbital; ULA = fixação ultrabaixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Determinação do tamanho e circularidade dos esferoides utilizando software para processamento e análise de imagens científicas. Depois de configurar o software para medir uma área selecionada com base em uma escala conhecida, selecione o lado externo do esferoide para determinar sua área e circularidade (A). A área do esferoide é usada para determinar seu tamanho calculando o diâmetro d, e o software fornece a circularidade do esferoide por uma fórmula que usa a área e o perímetro selecionados (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Reprodutibilidade do método esferoide 3D mostrada por esferoides de tamanho uniforme (diâmetro) e circularidade (forma esferoidal). O tamanho medido dos esferoides das linhagens celulares ZFL (A) e ZEM2S (B). O índice de circularidade medido dos esferoides ZFL (C) e ZEM2S (D). O padrão de crescimento dos esferoides ZFL e ZEM2S (E). Os dados são representativos de três réplicas técnicas de diferentes lotes celulares. Os números acima de cada ponto indicam a média das triplicatas para os dias 1, 3 e 5. Os dados apresentados como média ± desvio padrão (n = 10). Esse valor foi modificado de Souza et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação entre a formação dos esferoides ZFL e ZEM2S realizada em duas velocidades de rotação (70 e 100 rpm). Um esferoide ZFL (A) e um esferoide ZEM2S (B) formaram-se após 5 dias de agitação orbital a 100 rpm (barras de escala representam 100 μm). O padrão de crescimento dos esferoides ZFL (C) e ZEM2S (D) formou-se a 70 e 100 rpm. O índice de circularidade dos esferoides ZFL (E) e ZEM2S (F) formou-se a 70 e 100 rpm. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 10). *indica significância estatística (p < 0,05). s.s.: diferença não significativa (teste t) entre esferoides formados no dia 5 a 70 e 100 rpm. Esse valor foi modificado de Souza et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Integridade celular e viabilidade dos esferoides ZFL e ZEM2S (5 dias de idade) formados por agitação orbital em placa de poço de fixação ultrabaixa de fundo redondo. A coloração das membranas celulares pela lectina Alexa Fluor 594 (vermelho) e núcleos por DAPI (azul) demonstra a integridade celular no núcleo de um esferoide ZEM2S (A) e esferoide ZFL (B). A fluorescência da resorufina (vermelho) formada por uma redução de Alamarblue demonstra células viáveis no núcleo dos esferoides ZEM2S (C) e ZFL (D). As imagens representam planos ortogonais capturados por microscópio confocal. Ensaio de viabilidade de MTT em cultura 3D (esferoides) e cultivo 2D da linhagem celular ZEM2S (E) e ZFL (F). Os dados mostraram como média da absorbância medida a 570 nm ± desvio padrão. ns: diferença não significativa pelo teste t de Welch. Esse valor foi modificado de Souza e colaboradores (2021)12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Soluções para o cultivo ZFL e ZEM2S. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Comparação dos métodos esferoides 3D usados para formar esferoides ZFL únicos. * O melhor resultado para um parâmetro testado. um O parâmetro selecionado a partir dos melhores resultados verificados no método convencional de gota suspensa. b O parâmetro selecionado de Baron et al.3 para a formação de um esferoide de peixe com agitação orbitária. c Variações igualmente adequadas a um parâmetro testado. Abreviações: HD = gota pendurada; OS = agitação orbital; ULA = fixação ultrabaixa; poli-HEMA = poli(2-hidroxietil metacrilato). Essa tabela foi modificada de Souza et al.12. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Este é um método simples, fácil e rápido para gerar esferoides de linhagens celulares de fígado e embrião de peixe-zebra. Este método foi desenvolvido por este grupo com base em modificações de métodos esferoides 3D existentes para superar problemas relatados em estudos científicos relacionados à formação de esferoides, bem como incertezas na precisão dos dados de ensaios esferoides 3D. Por exemplo, os problemas relatados residem nas dificuldades de manuseio, na demora na geração de esferoides, na necessidade de selecionar esferoides de tamanho e forma semelhantes para a realização de um ensaio, bem como nas dificuldades no processo de transferência de esferoides das gotas para as microplacas no método da gota suspensa 3,7,12. Além disso, este protocolo recomenda o cultivo de linhagens celulares ZFL e ZEM2S em uma condição livre de CO2. A composição do meio de cultura e o ambiente livre de CO2 propostos neste protocolo para ambas as linhagens celulares são amplamente relatados na literatura. A linhagem celular ZFL é usualmente cultivada em meio L-15 e RPMI com ou sem adição de bicarbonato de sódio e sem CO2 14,15,16,17,18,19,20. A linhagem celular ZEM2S é cultivada de acordo com as instruções do centro de biorecursos, e seu meio de cultura foi formulado para culturas livres de CO2; assim, o CO2 e a mistura de ar podem ser prejudiciais às células quando se utiliza esse tipo de meio de cultura21.
O presente protocolo esferoide de peixes foi desenvolvido após a avaliação de vários parâmetros (i.e., diferentes densidades celulares, velocidade de agitação orbital [70 ou 100 rpm] e o uso de diferentes placas de 96 poços [fundo plano ou fundo redondo]) para determinar os melhores parâmetros para formar esferoides ZFL. Além disso, uma comparação com outros métodos de cultura 3D (i.e., método de drop suspenso e método de drop suspenso combinado com método de agitação orbital) foi feita, indicando que a agitação orbital de placas UL-bottom redondas teve o melhor desempenho (i.e., método fácil, rápido e reprodutível). A Tabela 2 mostra os parâmetros e o desempenho dos outros métodos de cultura 3D avaliados para formar esferoides ZFL.
Já foi relatado que placas ULA de fundo redondo formam esferoides únicos de células humanas seguidos de centrifugação22 ou agitação orbital23,24. Neste protocolo, estamos propondo o uso da mesma placa, exceto sob agitação orbital para gerar esferoides únicos de linhagens celulares de peixe-zebra (ou seja, um esferoide por poço de uma placa de 96 poços). Isso é particularmente vantajoso porque pode facilmente e rapidamente formar uma boa quantidade de esferoides, e os esferoides formados podem ser mantidos em cultura na mesma placa. Assim, a exposição química pode ser feita diretamente na placa ULA para realizar diferentes tipos de ensaios de toxicidade.
Para determinar a velocidade de agitação orbital adequada para formar esferoides ZFL e ZEM2S, comparamos a formação dos esferoides a 70 e 100 rpm. Os resultados mostram que este método tem melhor desempenho a 70 rpm, e uma maior velocidade de rotação pode afetar significativamente o tamanho e a forma dos esferoides ZEM2S (Figura 5D,F). Os esferoides ZFL não apresentaram diferenças significativas no tamanho e na forma nessas velocidades de rotação; entretanto, menores índices de circularidade foram obtidos a 100 rpm, mostrando um impacto negativo na forma esferoidal a uma maior velocidade de rotação (Figura 5C,E).
A densidade celular inicial de 3.500 células ZEM2S e 7.000 células ZFL gera esferoides com tamanhos semelhantes no quinto dia de cultura (226,63 e 225,62 μm, respectivamente). Como oxigênio e nutrientes são transportados por difusão em esferoides25, seu diâmetro pode influenciar fortemente a nutrição e a integridade celular no núcleo dos esferoides; Geralmente, esferoides de até 100 μm são recomendados para evitar núcleo necrótico26. Para verificar a integridade celular no núcleo dos esferoides, avaliamos a integridade nuclear e de membrana por imunomarcação com DAPI e Lectina Alexa Fluor 594 por microscopia confocal (Figura 6A,B), e a integridade dos esferoides foi demonstrada. A viabilidade celular no núcleo dos esferoides também foi verificada expondo-os à resazurina (Alamarblue) e analisando a fluorescência da resorufina por microscópio confocal (Figura 6C,D). Quando as células são viáveis, a resazurina é reduzida a resorufin (substância fluorescente) pela função metabólica celular. O desempenho do ensaio de MTT também não demonstrou diferença significativa na viabilidade celular comparando os esferoides ZFL e ZEM2S com cultura monocamada (cultura 2D) (Figura 6E,F). Embora os esferoides sejam maiores que 100 μm, os resultados mostram que este protocolo gera esferoides viáveis de linhagens celulares ZFL e ZEM2S com nutrição adequada mesmo em sua porção interna.
As densidades celulares das células ZFL e ZEM2S e a velocidade de agitação orbital aplicada neste protocolo permitiram a formação de esferoides muito estáveis em tamanho e forma, com baixa variabilidade entre os poços (Figura 4), evitando a necessidade de selecionar esferoides adequados como etapa prévia da realização de um ensaio. Se o procedimento de ensaio requer a transferência dos esferoides para outras placas ou tubos/microtubos, eles podem ser facilmente transferidos com uma micropipeta sem problemas de desagregação.
Aqui, demonstramos um protocolo desenvolvido com base nos melhores parâmetros para formar esferoides ZFL e ZEM2S viáveis. As linhagens celulares ZFL e ZEM2S podem ser úteis em testes de toxicidade aquática para estimar efeitos químicos em peixes 23,24,27,28,29,30. Além disso, desfechos de desenvolvimento também podem ser estudados utilizando linhagens celulares de embriões de peixes, como a linhagem celular ZEM2S (fibroblastos da fase blástula), que retêm um grau de pluripotência28. Estes tornam estes esferoides de peixe-zebra potencialmente úteis para testes de toxicidade em peixes. Além disso, como um método esferoide de peixe fácil, pode ser usado em testes de ecotoxicidade de alto rendimento, apoiando sua aplicação na indústria e na academia.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Em memória do Dr. Márcio Lorencini, coautor deste trabalho, excelente pesquisador na área de cosméticos e dedicado a promover a pesquisa cosmética no Brasil. Os autores agradecem ao Laboratório Multiusuário do Departamento de Fisiologia (UFPR) pela disponibilidade dos equipamentos e pelo apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Brasil) (Código Financeiro 001) e do Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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