Summary
Qui, presentiamo un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi di due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale).
Abstract
Le linee cellulari di pesce sono promettenti modelli in vitro per la valutazione dell'ecotossicità; tuttavia, i sistemi di coltura monostrato convenzionali (coltura 2D) hanno limitazioni ben note (ad esempio, la longevità della coltura e il mantenimento di alcune funzioni cellulari in vivo ). Pertanto, sono state proposte colture 3D, come gli sferoidi, poiché questi modelli possono riprodurre strutture simili a tessuti, ricatturando meglio le condizioni in vivo . Questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D efficace, facile e veloce per la formazione di sferoidi con due linee cellulari di zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrione) e ZFL (epatocita normale). Il protocollo consiste nel placcare le celle in una piastra a 96 pozzetti con attacco a fondo tondo, ultra-basso. Dopo 5 giorni sotto scuotimento orbitale (70 giri / min), si forma un singolo sferoide per pozzetto. Gli sferoidi formati presentano dimensioni e forma stabili, e questo metodo evita la formazione di più sferoidi in un pozzo; Pertanto, non è necessario selezionare a mano sferoidi di dimensioni simili. La facilità, la velocità e la riproducibilità di questo metodo sferoidale lo rendono utile per test in vitro ad alta produttività.
Introduction
Gli sferoidi sono piccole sfere di cellule formate quando le cellule vengono coltivate in stretto contatto cellula-cellula in coltura 3D. La capacità degli sferoidi di imitare l'ambiente tissutale in vivo è già stata studiata in una varietà di linee cellulari e cellule primarie 1,2. Tuttavia, sebbene gli sferoidi siano ben sviluppati per gli studi di tossicità sui mammiferi, lo sviluppo di sferoidi per studi di tossicità con vertebrati non mammiferi (ad esempio pesci) è ancora in corso3. Per le linee cellulari di pesce, gli sferoidi sono stati sviluppati con una varietà di metodi diversi, come lo scuotimento orbitale (OS) utilizzando diversi tipi di piastre di pozzo 3,4,5,6,7 e il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche 8. Tuttavia, alcuni di questi metodi di coltura per gli sferoidi possono avere più svantaggi di altri.
Ad esempio, i metodi giratori in micropiastre di grandi dimensioni (piastre a 24 pozzetti) possono generare un numero elevato di sferoidi diversi per dimensioni e forma; In effetti, è stata dimostrata la formazione di strutture multi-sferoidi7. Ciò richiede sforzi intensi per selezionare a mano sferoidi con dimensioni e forma simili per un esperimento. Il metodo di coltura 3D a goccia sospesa è comunemente usato per generare sferoidi di linee cellulari di mammifero 1,2,9,10,11, per cui possono essere generati singoli sferoidi per goccia, evitando i problemi sopra descritti. Tuttavia, sebbene un metodo di goccia sospesa modificato (goccia sospesa + scuotimento orbitale) sia in grado di generare sferoidi ZFL utilizzando un metodo economico, ha i suoi svantaggi12. Gli aggregati cellulari formati non possono essere mantenuti per lunghi periodi nelle gocce; Pertanto, devono essere trasferiti in piastre di pozzo. Questo processo richiede una manipolazione intensa e lunghi periodi di lavoro in una cappa a flusso laminare, poiché viene eseguito a goccia utilizzando una micropipetta12. Inoltre, questo metodo richiede 10 giorni per formare completamente gli sferoidi ZFL (5 giorni in goccia sospesa + 5 giorni in OS)12. Questi svantaggi possono limitare l'applicazione di sferoidi di pesce 3D per i test di tossicità, soprattutto considerando le potenziali applicazioni per la prioritizzazione chimica e la sostenibilità del prodotto.
Pertanto, questo articolo descrive un protocollo di coltura 3D in grado di generare singoli sferoidi di ZFL (Epatocita normale D. rerio) e ZEM2S (embrione fase D. rerio blastula ) basato sull'uso combinato di piastre di attacco ultra-basse a 96 pozzetti (piastre ULA) e uno shaker orbitale (diametro rotazionale 22 mm). Il metodo applicato è semplice e riproducibile e può generare un numero elevato di sferoidi di dimensioni e forma simili in un breve periodo (5 giorni). I vantaggi di questo metodo possono supportare l'applicazione di modelli 3D di pesci per studi di tossicità acquatica sia nell'industria che nel mondo accademico, nonché il progresso dell'implementazione di metodi alternativi per i test di ecotossicità.
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Protocol
I passaggi chiave per generare sferoidi 3D di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo sono presentati nella Figura 1.
NOTA: vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali utilizzati in questo protocollo e la Tabella 1 per le soluzioni e i terreni di coltura utilizzati in questo protocollo.
1. Terreno di coltura cellulare e colture monostrato
- Coltiva entrambe le linee cellulari (ZFL, ZEM2S) come monostrati in un incubatore a 28 ° C senza CO2 e sottocoltivali con un rapporto di subcoltivazione di 1: 3 quando raggiungono ~ 80% di confluenza.
- Inizia con un pallone T75 di cellule di zebrafish a ~ 80% di confluenza, coltivato come descritto sopra.
- Prelevare il mezzo completo e lavare le cellule aggiungendo 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (0,01 M) al matraccio di coltura con l'aiuto di una pipetta.
- Con l'aiuto di una pipetta, aggiungere 3 mL di 1x tripsina-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) ai palloni di coltura e incubare a 28 °C per 3 minuti per il distacco delle cellule dal pallone.
- Picchiettare delicatamente il matraccio per rilasciare le cellule, quindi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo 3 ml di terreno di coltura completo al pallone.
- Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 100 × g per 5 minuti.
- Dopo la formazione del pellet, rimuovere con attenzione il surnatante, aggiungere 1 mL del mezzo completo per la rispettiva linea cellulare in uso (ZFL o ZEM2S) e risospendere utilizzando una micropipetta. Prendi un'aliquota per il conteggio delle cellule.
2. Conteggio delle cellule con test di esclusione del colorante blu tripano
- Aggiungere 10 μL della sospensione cellulare e 10 μL di colorante blu tripano a un microtubo per contare le cellule e valutarne la vitalità. Mescolare la sospensione cellulare e colorare usando una pipetta.
- Quindi, trasferire 10 μL di questa miscela (sospensione cellulare + blu tripano) in una camera di Neubauer e contare le cellule nei quattro grandi quadrati (quadranti: Q) posti agli angoli della camera, considerando vitali le cellule che non assorbono il blu tripano. Calcola il numero di celle vitali usando l'equazione (1):
(1) - Per calcolare il numero finale di celle nella sospensione cellulare, moltiplicare il numero di celle determinato utilizzando l'equazione (1) per 2 (il fattore di diluizione dovuto all'uso del blu di tripano).
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un sistema automatico di conteggio delle celle.
(1)3. Placcatura cellulare in piastre ULA
- Dopo aver calcolato il numero di celle, regolare la sospensione della cella sulla piastra 200 μL di questa sospensione per pozzetto di una piastra ULA a fondo rotondo a 96 pozzetti con il numero di celle richiesto per ciascuna linea cellulare, come indicato di seguito:
- Piastra 7.000 celle ZFL vitali / pozzetto; quindi, per l'intera piastra ULA, utilizzare 700.000 celle in 20 ml di mezzo completo.
- Piastra 3.500 cellule/pozzetto ZEM2S vitali; quindi, per l'intera piastra ULA, utilizzare 350.000 celle in 20 ml di mezzo completo.
- Preparare la sospensione cellulare con la concentrazione regolata di cellule in un serbatoio medio e mescolarla utilizzando una micropipetta multicanale, facendo attenzione a non formare schiuma o bolle. Utilizzando la micropipetta multicanale, aggiungere 200 μL della sospensione cellulare regolata a ciascun pozzetto della piastra ULA.
NOTA: La piastra deve essere sigillata con parafilm o pellicola sigillante adesiva per evitare l'evaporazione del terreno di coltura dalla piastra a 96 pozzetti.
4. Formazione sferoidale
- Incubare la piastra ULA su uno shaker orbitale a 70 rpm per 5 giorni in un incubatore a 28 °C. Lasciare che gli sferoidi si formino in 5 giorni di scuotimento orbitale (Figura 2), raggiungendo una dimensione media di ~225 μm di diametro (sferoidi ZFL) e ~226 μm di diametro (sferoidi ZEM2S)12.
NOTA: Dopo 5 giorni di incubazione (circolarità massima), gli sferoidi sono pronti per essere utilizzati. - Per mantenere gli sferoidi in coltura per più di 5 giorni, rimuovere 100 μL del mezzo esaurito ogni 5 giorni e aggiungere 100 μL di terreno di coltura completo fresco utilizzando una micropipetta multicanale.
NOTA: Fare attenzione a non aspirare gli sferoidi durante questo processo.
5. Misura delle dimensioni (diametro) e della forma (indice di circolarità) degli sferoidi
- Acquisisci le immagini.
- Sotto un microscopio a luce invertita con un sistema di acquisizione delle immagini, ottenere un'immagine di una scala definita.
NOTA: Utilizzare un vetrino di calibrazione dello stadio del microscopio o un vetrino Neubauer (in cui sono note le dimensioni del quadrante) per ottenere la scala. - Al microscopio e utilizzando la stessa lente obiettiva utilizzata per ottenere l'immagine della scala, ottenere immagini degli sferoidi completamente formati (cioè sferoidi di 5 giorni).
NOTA: Tutte le immagini devono essere scattate utilizzando lo stesso sistema di acquisizione delle immagini, poiché la risoluzione dell'immagine è importante per determinare le dimensioni e la forma degli sferoidi e può differire tra i tipi di sistemi.
- Sotto un microscopio a luce invertita con un sistema di acquisizione delle immagini, ottenere un'immagine di una scala definita.
- Imposta la scala.
- Utilizzando il software ImageJ, aprire l'immagine della scala definita (fare clic su File | apri).
- Selezionare il selettore a linea retta dalla barra degli strumenti e, utilizzando il mouse, trascinare una linea attraverso l'estensione della scala definita nell'immagine.
- Impostare la scala selezionando Analizza | Impostate la scala e attendete l'apertura della finestra Imposta scala .
- Nella finestra Imposta scala, riempire lo spazio vuoto di Distanza nota con la distanza nota (μm) corrispondente alla linea retta; riempire l'unità di lunghezza con um per μm. Fare clic su OK.
NOTA: la scala in pixel/μm viene visualizzata nella parte inferiore della finestra.
- Impostare i parametri di misurazione.
- Nel software ImageJ, selezionare Analizza | Impostare le misure per aprire la finestra Imposta misure .
- Nella finestra Imposta misure, selezionare le caselle per le misure desiderate (ad esempio, Descrittori di area e forma). Fare clic su OK.
- Ottenere il diametro e la circolarità degli sferoidi.
- Aprire l'immagine di uno sferoide (File | Aperto).
- Selezionare lo strumento di selezione a mano libera nella barra degli strumenti e, utilizzando il mouse, selezionare il lato esterno dello sferoide, come illustrato nella Figura 3A.
NOTA: per ingrandire o ridurre l'immagine, premere CTRL e utilizzare il mouse per scorrere verso il basso o verso l'alto oppure premere il tasto CTRL e utilizzare i tasti freccia su o giù sulla tastiera. - Seleziona Analizza | Misura per aprire la finestra Risultati , in cui vengono visualizzati i valori misurati.
- Utilizzando il valore Area , calcolare la dimensione (diametro) degli sferoidi usando l'equazione (2):
(2) - L'indice di circolarità è dato nella finestra Risultati come "Circ.", e viene calcolato automaticamente dal software utilizzando l'equazione (3):
(3)
NOTA: L'indice di circolarità di 1,0 rappresenta una forma sferoidale perfetta, mentre un valore vicino a 0,0 indica una forma allungata13.
(2)
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Representative Results
I singoli sferoidi per pozzetto con dimensioni e forma stabili sono formati con questo metodo. La Figura 2 illustra il processo di formazione di singoli sferoidi di cellule ZFL e ZEM2S in un pozzetto di una piastra ULA sotto scuotimento orbitale (70 rpm). Le linee cellulari ZFL e ZEM2S hanno comportamenti diversi nella coltura 3D. La linea cellulare ZEM2S presenta caratteristiche che conferiscono la capacità di formare prontamente una forma sferoidale fin dal primo giorno dello scuotimento orbitale (Figura 2E), mentre la linea cellulare ZFL richiede 5 giorni per raggiungere la forma sferoidale desiderabile (Figura 2A-C). Gli sferoidi generati da questo metodo hanno anche mostrato stabilità in termini di forma in periodi di coltura più lunghi (periodi >5 giorni), come dimostrato nella Figura 2D (sferoide ZFL di 16 giorni) e nella Figura 2H (sferoide ZEM2S di 10 giorni). Il diametro e la circolarità degli sferoidi sono stati determinati misurando la loro area proiettata nelle immagini ottenute utilizzando un software per l'elaborazione e l'analisi di immagini scientifiche13 (Figura 3). La tabella dei materiali indica il software utilizzato per l'elaborazione e l'analisi delle immagini. Le cellule ZFL tendono a formare aggregati cellulari di grandi dimensioni (dimensione media 319 ± 23,33 μm) il primo giorno di scuotimento orbitale, che diminuisce nel tempo fino al giorno 5 (225,62 ± 19,20 μm) (Figura 4A), migliorando la circolarità nel tempo in coltura (Figura 4B). A differenza delle cellule ZFL, la linea cellulare ZEM2S forma piccoli sferoidi dal primo giorno (202,64 ± 5,78 μm), che aumentano progressivamente fino al giorno 5 (226,63 ± 4,80 μm) (Figura 4C). La Figura 4E mostra i diversi modelli di crescita nelle linee cellulari ZFL e ZEM2S in coltura 3D. Si consiglia di utilizzare gli sferoidi ZFL e ZEM2S il quinto giorno perché raggiungono una forma sferoidale più elevata (indice di circolarità di 0,80 ± 0,01 e 0,83 ± 0,00, rispettivamente) (Figura 4B, D), che indica una maggiore stabilità di questo modello 3D.
Figura 1: I passaggi chiave per generare sferoidi 3D di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Singoli sferoidi di linee cellulari ZFL e ZEM2S formati in piastre ULA a 96 pozzetti a fondo tondo sotto scuotimento orbitale. Un aggregato di celle ZFL si forma il primo giorno di OS (A). L'aggregato cellulare aumenta la sua circolarità il terzo giorno (B) e raggiunge un'adeguata forma sferoidale il giorno 5 (C). (D) Uno sferoide ZFL di 16 giorni in piastra ULA. La linea cellulare ZEM2S forma sferoidi dal primo giorno di OS (E). Lo sferoide ZEM2S mantiene la sua forma e aumenta di dimensioni il terzo giorno (F), e la sua massima circolarità viene raggiunta il giorno 5 (G). (H) Uno sferoide ZEM2S di 10 giorni in una piastra ULA. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: OS = scuotimento orbitale; ULA = attacco ultra-basso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Determinazione delle dimensioni e della circolarità degli sferoidi utilizzando un software per l'elaborazione e l'analisi di immagini scientifiche. Dopo aver impostato il software per misurare un'area selezionata in base a una scala nota, selezionare il lato esterno dello sferoide per determinarne l'area e la circolarità (A). L'area dello sferoide viene utilizzata per determinare la sua dimensione calcolando il diametro d e il software fornisce la circolarità dello sferoide con una formula che utilizza l'area e il perimetro selezionati (B). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Riproducibilità del metodo sferoidale 3D mostrata da sferoidi di dimensioni uniformi (diametro) e circolarità (forma sferoidale). La dimensione misurata degli sferoidi delle linee cellulari ZFL (A) e ZEM2S (B). L'indice di circolarità misurato degli sferoidi ZFL (C) e ZEM2S (D). Il modello di crescita degli sferoidi ZFL e ZEM2S (E). I dati sono rappresentativi di tre repliche tecniche di diversi batch di celle. I numeri sopra ogni punto indicano la media delle triplicate per i giorni 1, 3 e 5. I dati mostrati come deviazione media ± standard (n = 10). Questa cifra è stata modificata da Souza et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Confronto tra la formazione di sferoidi ZFL e ZEM2S eseguita a due velocità di rotazione (70 e 100 rpm). Uno sferoide ZFL (A) e uno sferoide ZEM2S (B) si sono formati dopo 5 giorni di scuotimento orbitale a 100 giri / min (le barre della scala rappresentano 100 μm). Il modello di crescita degli sferoidi ZFL (C) e degli sferoidi ZEM2S (D) si è formato a 70 e 100 giri / min. L'indice di circolarità degli sferoidi ZFL (E) e degli sferoidi ZEM2S (F) si è formato a 70 e 100 giri / min. I dati sono indicati come media ± deviazione standard (n = 10). *indica la significatività statistica (p < 0,05). N.S.: differenza non significativa (T-test) tra sferoidi formatisi il giorno 5 a 70 e 100 giri/min. Questa cifra è stata modificata da Souza et al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: L'integrità cellulare e la vitalità degli sferoidi ZFL e ZEM2S (5 giorni di vita) formati dallo scuotimento orbitale nella piastra del pozzetto di attacco ultra-basso a fondo tondo. La colorazione delle membrane cellulari da parte di Lectin Alexa Fluor 594 (rosso) e nuclei da DAPI (blu) dimostra l'integrità cellulare nel nucleo di uno sferoide ZEM2S (A) e ZFL sferoide (B). La fluorescenza della resorufina (rosso) formata da una riduzione di Alamarblue dimostra cellule vitali nel nucleo degli sferoidi ZEM2S (C) e ZFL (D). Le immagini rappresentano piani ortogonali catturati utilizzando un microscopio confocale. Saggio di vitalità MTT in coltura 3D (sferoidi) e coltura 2D della linea cellulare ZEM2S (E) e ZFL (F). I dati mostrati come media di assorbanza misurata a 570 nm ± deviazione standard. ns: differenza non significativa rispetto al t-test di Welch. Questa cifra è stata modificata da Souza et al. (2021)12. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Soluzioni per la coltivazione di ZFL e ZEM2S. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Confronto dei metodi sferoidi 3D utilizzati per formare singoli sferoidi ZFL. * Il miglior risultato per un parametro testato. un Il parametro selezionato dai migliori risultati verificati nel metodo convenzionale a goccia sospesa. b Il parametro selezionato da Baron et al.3 per formare uno sferoide di pesce con scuotimento orbitale. c Variazioni ugualmente adatte ad un parametro testato. Abbreviazioni: HD = goccia sospesa; OS = scuotimento orbitale; ULA = attacco ultra-basso; poli-HEMA = poli(2-idrossietilmetacrilato). Questa tabella è stata modificata da Souza et al.12. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo è un metodo semplice, facile e veloce per generare sferoidi di fegato zebrafish e linee cellulari embrionali. Questo metodo è stato sviluppato da questo gruppo sulla base di modifiche dei metodi sferoidi 3D esistenti per superare i problemi riportati negli studi scientifici relativi alla formazione di sferoidi, nonché le incertezze nell'accuratezza dei dati dai saggi sferoidi 3D. Ad esempio, i problemi segnalati risiedono nelle difficoltà di manipolazione, nella natura dispendiosa in termini di tempo della generazione di sferoidi, nella necessità di selezionare sferoidi di dimensioni e forma simili per eseguire un test, nonché nelle difficoltà nel processo di trasferimento degli sferoidi dalle gocce alle micropiastre nel metodo delle gocce sospese 3,7,12. Inoltre, questo protocollo raccomanda la coltura di linee cellulari ZFL e ZEM2S in una condizione priva di CO2. La composizione del terreno di coltura e l'ambiente privo di CO2 proposti in questo protocollo per entrambe le linee cellulari sono ampiamente riportati in letteratura. La linea cellulare ZFL è solitamente coltivata in terreni L-15 e RPMI con o senza aggiunta di bicarbonato di sodio e senza CO2 14,15,16,17,18,19,20. La linea cellulare ZEM2S è coltivata secondo le istruzioni del centro di biorisorse e i suoi terreni di coltura sono stati formulati per colture prive di CO2; pertanto, la CO2 e la miscela d'aria possono essere dannose per le cellule quando si utilizza questo tipo di terreno di coltura21.
L'attuale protocollo sferoidale di pesce è stato sviluppato dopo aver valutato diversi parametri (cioè diverse densità cellulari, velocità di scuotimento orbitale [70 o 100 giri / min] e l'uso di diverse piastre a 96 pozzetti [fondo piatto o fondo tondo]) per determinare i migliori parametri per formare sferoidi ZFL. Inoltre, è stato effettuato un confronto con altri metodi di coltura 3D (ad esempio, il metodo della goccia sospesa e il metodo della goccia sospesa combinato con il metodo di scuotimento orbitale), indicando che lo scuotimento orbitale delle piastre ULA a fondo rotondo aveva le migliori prestazioni (cioè metodo facile, veloce e riproducibile). La tabella 2 mostra i parametri e le prestazioni di altri metodi di coltura 3D valutati per formare sferoidi ZFL.
È già stato riportato che le piastre ULA a fondo rotondo formano singoli sferoidi di cellule umane seguite da centrifugazione22 o scuotimento orbitale23,24. In questo protocollo, proponiamo l'uso della stessa placca, tranne che sotto scuotimento orbitale per generare singoli sferoidi di linee cellulari di zebrafish (cioè uno sferoide per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti). Ciò è particolarmente vantaggioso perché può facilmente e rapidamente formare una buona quantità di sferoidi e gli sferoidi formati possono essere mantenuti in coltura sulla stessa piastra. Pertanto, l'esposizione chimica può essere effettuata direttamente sulla piastra ULA per eseguire diversi tipi di saggi di tossicità.
Al fine di determinare la velocità di scuotimento orbitale adeguata per formare sferoidi ZFL e ZEM2S, abbiamo confrontato la formazione degli sferoidi a 70 e 100 giri / min. I risultati mostrano che questo metodo funziona meglio a 70 giri / min e una maggiore velocità di rotazione può avere un impatto significativo sulle dimensioni e sulla forma degli sferoidi ZEM2S (Figura 5D, F). Gli sferoidi ZFL non hanno mostrato differenze significative di dimensioni e forma a queste velocità di rotazione; tuttavia, indici di circolarità più bassi sono stati ottenuti a 100 giri / min, mostrando un impatto negativo nella forma sferoidale a una velocità di rotazione più elevata (Figura 5C,E).
La densità cellulare iniziale di 3.500 cellule ZEM2S e 7.000 cellule ZFL genera sferoidi con dimensioni simili il quinto giorno di coltura (226,63 e 225,62 μm, rispettivamente). Dato che l'ossigeno e le sostanze nutritive sono trasportati per diffusione negli sferoidi25, il loro diametro può influenzare fortemente la nutrizione e l'integrità cellulare nel nucleo degli sferoidi; Generalmente, si raccomandano sferoidi fino a 100 μm per evitare il nucleo necrotico26. Per verificare l'integrità cellulare nel nucleo degli sferoidi, abbiamo valutato l'integrità nucleare e di membrana mediante immunocolorazione con DAPI e Lectin Alexa Fluor 594 mediante microscopia confocale (Figura 6A, B), ed è stata dimostrata l'integrità degli sferoidi. La vitalità cellulare nel nucleo degli sferoidi è stata verificata anche esponendoli alla resazurina (Alamarblue) e analizzando la fluorescenza di resorufin mediante un microscopio confocale (Figura 6C,D). Quando le cellule sono vitali, la resazurina viene ridotta a resorufin (sostanza fluorescente) dalla funzione metabolica cellulare. Le prestazioni del test MTT non hanno inoltre dimostrato alcuna differenza significativa nella vitalità cellulare confrontando gli sferoidi ZFL e ZEM2S con la coltura monostrato (coltura 2D) (Figura 6E,F). Sebbene gli sferoidi siano superiori a 100 μm, i risultati mostrano che questo protocollo genera sferoidi vitali di linee cellulari ZFL e ZEM2S con un'alimentazione adeguata anche nella loro porzione interna.
Le densità cellulari delle cellule ZFL e ZEM2S e la velocità di scuotimento orbitale applicata in questo protocollo hanno permesso la formazione di sferoidi molto stabili per dimensioni e forma, con bassa variabilità tra i pozzetti (Figura 4), evitando la necessità di selezionare sferoidi adeguati come fase precedente dell'esecuzione di un test. Se la procedura di analisi richiede il trasferimento degli sferoidi su altre piastre o tubi/microtubi, possono essere facilmente trasferiti con una micropipetta senza problemi di disaggregazione.
Qui, abbiamo dimostrato un protocollo sviluppato basato sui migliori parametri per formare sferoidi ZFL e ZEM2S vitali. Le linee cellulari ZFL e ZEM2S possono essere utili nei test di tossicità acquatica per stimare gli effetti chimici sui pesci 23,24,27,28,29,30. Inoltre, gli endpoint dello sviluppo possono anche essere studiati utilizzando linee cellulari di embrioni di pesce, come la linea cellulare ZEM2S (cellule fibroblastiche della fase blastula), che mantengono un grado di pluripotenza28. Questi rendono questi sferoidi zebrafish potenzialmente utili per i test di tossicità dei pesci. Inoltre, come metodo sferoidale di pesce facile, può essere utilizzato in test di ecotossicità ad alto rendimento, supportandone l'applicazione nell'industria e nel mondo accademico.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
In memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautore di questo lavoro, eccellente ricercatore nel campo della cosmesi e dedito alla promozione della ricerca cosmetica in Brasile. Gli autori sono grati al Laboratorio Multiutente del Dipartimento di Fisiologia (UFPR) per la disponibilità delle attrezzature e per il sostegno finanziario del Coordinamento per il miglioramento del personale dell'istruzione superiore (CAPES, Brasile) (Codice finanziario 001) e del Grupo Boticário.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile | Corning | 7007 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Image Processing and analysis in Java (ImageJ) 1.52p software | National Institutes of Health, USA |
Available at: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz's L-15 Medium, powder | Gibco | 41300021 | |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10x) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Sodium bicarbonate, powder, bioreagent for molecular biology | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Trypan blue stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
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