Summary
Les cellules métaplasiques pancréatiques sont des précurseurs de cellules malignes à l’origine des tumeurs pancréatiques. Cependant, il est difficile d’isoler des cellules pancréatiques viables intactes. Nous présentons ici une méthode efficace de dissociation du tissu pancréatique. Les cellules peuvent ensuite être utilisées pour le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ou pour la co-culture bidimensionnelle ou tridimensionnelle.
Abstract
Le pancréas comprend deux systèmes principaux : le système endocrinien, qui produit et sécrète des hormones, et le système exocrinien, qui représente environ 90 % du pancréas et comprend des cellules qui produisent et sécrètent des enzymes digestives. Les enzymes digestives sont produites dans les cellules acineuses pancréatiques, stockées dans des vésicules appelées zymogènes, et sont ensuite libérées dans le duodénum via le canal pancréatique pour initier des processus métaboliques. Les enzymes produites par les cellules acineuses peuvent tuer les cellules ou dégrader l’ARN acellulaire. De plus, les cellules acineuses sont fragiles et les protocoles de dissociation courants entraînent un grand nombre de cellules mortes et de protéases et de RNases acellulaires. Par conséquent, l’un des plus grands défis de la digestion des tissus pancréatiques est de récupérer des cellules intactes et viables, en particulier les cellules acineuses. Le protocole présenté dans cet article montre une méthode en deux étapes que nous avons développée pour répondre à ce besoin. Le protocole peut être utilisé pour digérer un pancréas normal, un pancréas qui comprend des lésions précancéreuses ou des tumeurs pancréatiques qui comprennent un grand nombre de cellules stromales et immunitaires.
Introduction
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l’un des types de cancer les plus agressifs1. Les preuves cliniques soutiennent l’idée que la PDAC se développe à partir de cellules du système exocrinien, y compris les cellules acineuses, sur de nombreuses années, sous l’effet de mutations dans le proto-oncogène2 KRAS.
Les tumeurs pancréatiques comprennent de nombreux types de cellules différentes, et il a été démontré que les cellules malignes ne représentent que 20 à 50 % de la masse tumorale3. Différents types de cellules interagissent avec les cellules épithéliales, soutiennent leur transformation et améliorent la formation et la croissance des tumeurs. Les événements précoces provoquent une métaplasie acineuse, qui donne lieu à des lésions microscopiques appelées néoplasie intraépithéliale pancréatique (PanINs), qui peuvent dans certains cas évoluer en PDAC4.
Il est essentiel d’étudier ces interactions et de cibler les signaux pivots. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) est une méthode puissante qui révèle l’expression des gènes à une résolution unicellulaire, permettant ainsi de suivre les changements subis par les cellules épithéliales, permettant ainsi d’explorer le développement du cancer du pancréas.
La dissection tissulaire et la digestion de cellules individuelles constituent la première étape d’une expérience de séquençage de l’ARNsc. Plusieurs facteurs rendent la digestion des tissus pancréatiques particulièrement difficile : i) les cellules acineuses représentent plus de 90 % du pancréas et les cellules acineuses contiennent de grandes quantités d’enzymes digestives, y compris des protéases et des RNases qui réduisent la qualité des banques à base d’ARN ; (ii) les cellules acineuses sont très sensibles et peuvent se lyser si des protocoles standard sont utilisés ; (iii) les cellules acineuses expriment un petit nombre de gènes à des niveaux très élevés. Par conséquent, si ces cellules sont lysées au cours de l’expérience, cela peut contaminer le profil d’expression génique observé d’autres cellules ; (iv) le tissu pancréatique récupéré des tumeurs est desmoplastique, ce qui le rend difficile à disséquer sans endommager les cellules. Ainsi, même s’il est nécessaire de maintenir une viabilité élevée de tous les types de cellules, le grand nombre et la sensibilité des cellules acineuses ajoutent une complexité supplémentaire. Ces facteurs imposent des difficultés à obtenir une suspension unicellulaire viable à plus de 80 % et sans amas, comme c’est le cas pour les expériences de scRNA-seq.
Ici, nous avons développé un protocole utilisant la trypsine C et la collagénase P, ainsi qu’une surveillance fréquente des tissus. Cela favorise la dissociation en cellules uniques tout en conservant une viabilité élevée pour soutenir le succès des expériences de scRNA-seq 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le comité mixte d’éthique (Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux) de l’Université hébraïque (Jérusalem, Israël) et du Centre médical Hadassah (Jérusalem, Israël) a approuvé le protocole d’étude pour le bien-être animal (MD-18-15417-5 « Dynamique tissulaire dans le cancer du pancréas chez la souris »), et le protocole présenté ici était conforme à toutes les règles éthiques pertinentes pour l’expérimentation et la recherche sur les animaux. L’Université hébraïque est un institut accrédité par l’Association pour l’évaluation et l’accréditation des soins aux animaux de laboratoire à l’échelle internationale.
NOTE : Les souches de souris #007908, #019378 et #008179 ont été obtenues du laboratoire de Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D ; Ptf1a-CreER ; Les souris Rosa26LSL-tdTomato) ont été créées en croisant les souches ci-dessus. Des souris des deux sexes, âgées de 6 semaines à 15 mois, ont été utilisées pour l’étude. Le tamoxifène a été préparé en dissolvant la poudre dans de l’huile de maïs. Des souris adultes (âgées de 6 à 8 semaines, femelles et mâles) ont reçu une injection sous-cutanée de tamoxifène aux jours 0 et 2 à une dose de 400 mg/kg et ont été examinées deux fois par semaine après l’injection. Il n’a pas été possible de mesurer les tumeurs car elles étaient situées à l’intérieur ; Par conséquent, l’euthanasie était pratiquée si des signes cliniques anormaux étaient observés selon le protocole éthique. Les souris ont été euthanasiées à différents moments après l’induction du tamoxifène, en utilisant de l’isoflurane et une luxation cervicale.
1. Dissection pancréatique
REMARQUE : Pour un rendement optimal lors de l’extraction et pour assurer une bonne viabilité cellulaire, une dissection rapide est essentielle. Pour raccourcir le temps nécessaire à l’isolement du pancréas, tous les instruments et équipements doivent être prêts sur la glace avant d’euthanasier la souris.
- Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 et vérifier à l’aide d’une luxation cervicale. À partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées avec des instruments de dissection stériles.
- Fixez la souris et vaporisez l’abdomen avec 70% d’éthanol. Faites une incision en forme de V de 2,5 cm dans la région génitale avec des ciseaux et une pince et remontez pour ouvrir complètement la cavité abdominale.
- Localisez l’estomac sur le côté gauche de la souris. Localisez le pancréas, qui se trouve près de la rate. Séparez le pancréas de l’estomac et du duodénum à l’aide de deux pinces (sans déchirer). Continuez et séparez le pancréas de l’intestin grêle, du jéjunum et de l’iléon.
- Déplacez le pancréas vers le côté droit de la souris. Séparez les connexions restantes entre le pancréas et la cavité thoracique avec des pinces pour détacher complètement le pancréas et la rate attachée.
- Retirez le pancréas et étalez-le pour l’examiner dans une boîte de Pétri sur de la glace.
REMARQUE : Au cours de cette étape, il faut veiller à retirer uniquement le pancréas et à ne pas enlever le tissu adipeux mésentérique ou d’autres tissus adjacents avec le pancréas, afin d’éviter toute contamination cellulaire.
2. Dissociation enzymatique et mécanique du pancréas
- Préparez à l’avance les tampons suivants.
- Tampon de dissociation 1 : 4 mL de trypsine C + 6 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (voir tableau 1) pour chaque échantillon.
- Tampon de dissociation 2 : 9 mL de solution saline équilibrée Hanks (HBSS) 1x ; 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) ; 1 mL de collagénase P (10 mg/mL) ; 200 μL d’inhibiteur de la trypsine (10 mg/mL) ; et 200 μL de DNase I (10 mg/mL) (voir le tableau 1).
- Tampon de lavage : 50 mL de HBSS 1x ; 2 g de BSA ; 1 mL d’inhibiteur de la trypsine (10 mg/mL) ; et 1 mL de DNase 1 (10 mg/mL).
- Solution d’arrêt de l’activité enzymatique : HBSS 1x contenant 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 150 g de DNase I (0,2 mg/mL).
- Placer le pancréas dans un tube de 50 ml sur de la glace. Rincez le pancréas dans 10% FBS dans HBSS 1x. Le tissu adipeux va flotter et le pancréas va couler. Il s’agit d’un moyen facile de visualiser et d’éliminer rapidement le tissu adipeux blanc contaminant encore attaché au pancréas.
- Transférez le tissu pancréatique de la souris dans une boîte de Pétri stérile contenant 5 mL d’HBSS 1x sur glace. Coupez le pancréas en petits morceaux de 1 à 3 mm3 à l’aide de ciseaux Noyes et d’un scalpel (Figure 2A). Dans le cas de plus d’un échantillon, les échantillons doivent être conservés sur de la glace dans 10 % FBS/HBSS 1x.
- Transférez les tissus dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 350 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer et jeter le surnageant pour éliminer les fragments cellulaires et les cellules sanguines.
- Remettre les morceaux en suspension dans le tampon de dissociation 1 contenant 0,02 % de trypsine C-0,05 % EDTA pendant 10 min à 37 °C avec agitation (180 tr/min). Laver immédiatement avec 10 % de milieu Eagle’s modifié (DMEM) de FBS/Dulbecco. Centrifuger pendant 5 min à 350 g à 4 °C.
- Laver à nouveau en remettant le granulé en suspension dans 10 mL de tampon de lavage et en centrifugeant à 350 x g pendant 5 min à 4 °C avant l’étape de dissociation suivante.
- Incuber le pancréas dans le tampon de dissociation 2 pendant 15 min à 37 °C avec agitation (180 tr/min).
- Après 15 min, effectuer une dissociation mécanique en pipetant vigoureusement les fragments pancréatiques de haut en bas dans des pipettes stériles de taille décroissante (pipettes sérologiques de 25, 10 et 5 ml) 10 fois et ramener à 37 °C.
- Après 5 minutes supplémentaires, répétez la dissociation mécanique et utilisez la microscopie optique pour surveiller la dissociation en fonction de la quantité de suspension unicellulaire. Habituellement, si à ce stade, moins de 90% de la suspension est constituée de cellules isolées individuelles, un temps d’incubation plus long est nécessaire. Utilisez le bleu trypan pour surveiller la viabilité des cellules.
- Poursuivez l’incubation et prélevez des échantillons pour détecter la dissociation toutes les 5 min.
REMARQUE : La durée totale d’incubation dépend du tissu et peut varier d’un échantillon à l’autre. L’incubation et la dissociation tissulaire doivent se terminer lorsque 90 % des cellules sont séparées en cellules individuelles ou lorsqu’une réduction de la viabilité est détectée.
- Une fois que le tissu pancréatique est bien dissocié (correspondant à la disparition des fragments pancréatiques et à l’augmentation de la turbidité de la solution) (Figure 2), arrêter la réaction enzymatique en lavant deux fois avec une solution d’arrêt d’activité enzymatique pendant 5 min à 4 °C. À partir de cette étape, maintenez la suspension cellulaire sur la glace.
- Passez la suspension cellulaire à travers un maillage en nylon de 70 μm et vérifiez la viabilité cellulaire au microscope. Des mailles en nylon de plus petite taille peuvent réduire la viabilité des cellules.
- Remettre en suspension et laver le granulé avec 5 à 10 ml de solution de lavage tamponnée glacée. Comptez les cellules.
- Si plusieurs globules rouges sont observés, traitez les cellules avec un tampon de lyse des globules rouges pendant 2 min à température ambiante. Dans les cas où des amas sont observés, l’échantillon doit être traité à nouveau avec de la trypsine, comme décrit à l’étape 2.5. La viabilité est détectée au microscope à l’aide du bleu de trypan et, si la viabilité est inférieure à 80 %, les cellules vivantes doivent être isolées à l’aide du kit d’élimination des cellules mortes à tri magnétique activé (MACS) avec des colonnes MACS MS ( voir le tableau 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans un travail récemment publié5, nous avons appliqué le protocole décrit ci-dessus pour explorer les premières étapes du développement de la PDAC à l’aide d’un modèle murin. La souris a été génétiquement modifiée pour inclure les cassettes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, qui permettent l’expression de KRAS constitutivement actif dans les cellules acineuses après injection de tamoxifène.
Après une luxation cervicale (selon le protocole éthique de la souris), le pancréas a été réséqué et le protocole décrit ci-dessus a été appliqué (voir Figure 1 et Protocole).
Pour optimiser le protocole de dissociation, la dissociation a été réalisée avec ou sans pré-incubation du tissu avec de la trypsine C. Il a été constaté que la pré-incubation avec la trypsine C accélérait la dissociation sans affecter la viabilité. De plus, différentes collagénases, dont la collagénase D, la collagénase 1a et la collagénase P, ont été essayées (voir tableau 1). Il a été constaté que l’utilisation de la collagénase D entraînait une mort cellulaire massive, et en effet dans d’autres études qui ont utilisé cette collagénase, la fraction de cellules acineuses était très faible8. L’utilisation de la collagénase 1a n’a pas non plus donné les résultats escomptés, car même après une incubation de 90 minutes avec la collagénase 1a, le tissu n’a pas été dissocié. Seule la collagénase P nous a permis de dissocier les tissus et de maintenir une viabilité élevée de tous les types de cellules.
Ces expériences ont été répétées à sept moments différents après l’injection de tamoxifène. Simultanément à la métaplasie acineuse-canalaire et à la formation de lésions PanIN, il y a eu une accumulation de cellules stromales et immunitaires, y compris des fibroblastes, et le tissu est devenu desmoplastique et rigide. Les différents moments post-injection de tamoxifène nous ont permis d’examiner le protocole sous plusieurs états tissulaires différents et de mesurer la récupération des cellules épithéliales, stromales et immunitaires.
Une photo d’une souris est montrée à la figure 2A et le pancréas isolé, un tissu duveteux, est montré à la figure 2C. La couleur rouge du tissu résulte de l’expression de tdTomato dans les cellules acineuses. Le protocole a été utilisé avec succès avec tous les états tissulaires et avec des échantillons humains. Cependant, les temps d’incubation avec la trypsine et la collagénase peuvent varier. Il est donc important de surveiller l’échantillon et d’observer la dissociation de la viabilité tissulaire et cellulaire toutes les quelques minutes au microscope. À un stade précoce du protocole de dissociation, il y avait un faible nombre de cellules isolées et un grand nombre d’amas (Figure 2D, à gauche). Notre objectif était d’obtenir des cellules viables isolées, comme le montre la figure 2D, au milieu, et d’éviter une réduction du nombre de cellules viables (figure 2D, à droite).
Il est important de noter que des temps d’incubation plus longs ont réduit la viabilité des cellules. À partir d’un tissu de 0,5 x 10 cm3 , nous avons récupéré un total de 5 x 106 cellules, dont 5 x 105 étaient des cellules positives tdTomato . Selon l’analyse de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de la figure 3, notre protocole de dissociation du pancréas prend en charge la récupération de plusieurs types de cellules, y compris les cellules acineuses, les cellules canalaires, les cellules endothéliales, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les péricytes à haute viabilité. Cependant, le rapport réel entre le nombre de cellules de chaque type dans le tissu avant la dissociation peut être différent, déduit des images de fluorescence de coupes pancréatiques congelées qui incluent des cellules positives à la tdTomato (Figure 2E). La haute viabilité obtenue à l’aide du protocole détaillé ci-dessus est démontrée par l’analyse FACS (Figure 3) et le comptage des cellules vivantes/cellules mortes effectué à l’aide d’un hémocytomètre (Figure 3H).
Pour chaque échantillon, nous avons effectué un scRNA-seq et, conformément à l’analyse FACS, nous avons confirmé la détection de tous les types de cellules mentionnés ci-dessus (Figure 4A,B), dans chacun des tissus réséqués à tous les moments post-injection de tamoxifène. Nous avons également examiné l’expression de la carboxypeptidase 1 (Cpa1), qui code pour la carboxypeptidase1. L’expression de Cpa1 dans les cellules acineuses est extrêmement élevée et peut indiquer dans quelle mesure les cellules acineuses ont été lysées lors de la dissociation, ainsi que dans quelle mesure elles ont contaminé le transcriptome d’autres types de cellules. Nous avons détecté une contamination minimale, comme on peut le voir sur la figure 4C,D. La dissociation douce se traduit également par une viabilité élevée qui nous permet de poursuivre le tri cellulaire des types de cellules souhaités pour des expériences supplémentaires (Figure 3).
Ensemble, la qualité du protocole de dissociation soutient différentes expériences de suivi, y compris le scRNA-seq.
Figure 1 : Schéma du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Isolement des cellules pancréatiques. (A) Une photo montrant le pancréas (en rouge), le foie et la rate de la souris après l’ouverture complète de la cavité abdominale. (B) La même souris qu’en (A) après l’ablation du pancréas. (C) La dissection du pancréas. Le pancréas après avoir été retiré de l’animal (à gauche). Le pancréas après le clivage en petits morceaux (milieu). Séparation de phase après centrifugation (à droite). (D) Surveillance des cellules au microscope pour examiner la viabilité d’une cellule unique. Isolement total des cellules pancréatiques primaires (20x). Amonceaux de cellules après 15 min de réaction enzymatique (à gauche). Suspension unicellulaire après 25 min de réaction enzymatique (milieu). Réduction de la viabilité cellulaire après une longue incubation (à droite). (E) Images de fluorescence d’une coupe pancréatique gelée. Les cellules acineuses sont tdTomato positives ; Coloration DAPI en bleu (photo à 40x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse FACS de la suspension unicellulaire du cancer du pancréas. (A) Cellules positives et négatives de la tomate td. (B) Cytométrie en flux de cellules acineuses non triées (rouges) par rapport à des cellules acineuses triées (bleues). (C,F) Cellules non colorées, APC et PB450. (D) Analyse FACS après coloration avec Anti-CD31, un marqueur des cellules endothéliales. (E) Analyse FACS après coloration avec l’Anti-CD140b, un marqueur des péricytes. (G) Analyse FACS après coloration avec Anti-CD11c, un marqueur des cellules dendritiques et des macrophages. (H) Rapport entre les cellules vivantes et les cellules mortes dans quatre isolements différents de cellules pancréales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse des données de scRNA-seq produites à l’aide du protocole que nous décrivons dans le présent article. (A) UMAP montrant le scRNA-seq d’un pancréas de souris à différents moments après l’injection de tamoxifène, comme indiqué sur le côté droit du panneau. (B) Les types de cellules ont été déterminés sur la base de marqueurs connus. (C,D) Les cellules sont colorées en fonction du niveau d’expression de Cpa1 (en C) ou du niveau de tdTomato (en D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dans cet article, nous vous présentons un protocole de dissociation du tissu pancréatique. Le protocole est simple, facile à utiliser et fournit un outil pour isoler des cellules uniques viables du tissu pancréatique à différents stades du processus de malignité, y compris les tumeurs solides. Dans des études antérieures, différents types de collagénases ont été utilisés pour digérer le pancréas 8,9. L’utilisation d’une collagénase très puissante, telle que la collagénase D, entraîne une grande population de cellules immunitaires et un pourcentage plus faible de cellules épithéliales. L’utilisation de la collagénase P permet une digestion pancréatique adaptée au tissu pancréatique intact ou tumoral.
Sur la base de nos observations, tous les types de cellules peuvent être isolés. Nous avons précédemment validé l’infiltration des lymphocytes T immunitaires, par exemple, en utilisant l’immunohistochimie5 ; Nous pensons que le nombre relatif de cellules que nous avons observé dans notre analyse est une approximation correcte de la représentation réelle des cellules dans le tissu, à l’exception des cellules acineuses qui sont fragiles et étaient donc sous-représentées. Nous recommandons d’utiliser l’immunohistochimie ou la transcriptomique spatiale10,11,12 s’il est nécessaire d’obtenir des proportions précises de types de cellules dans le tissu. De plus, nous avons observé que la dissociation des tissus des souris de type sauvage en l’absence d’expression constitutivement active de KRAS est plus difficile et nécessite une surveillance plus fréquente, afin d’arrêter la réaction enzymatique à temps en ajoutant 10% de FBS au tampon de lavage et d’éviter une mort cellulaire massive. Ceci est également cohérent avec la contamination par certains transcrits acineux très abondants, tels que Cpa1, bien que notre protocole minimise ce problème.
L’isolement cellulaire peut être utilisé pour le scRNA-seq, comme nous l’avons montré5, pour la culture de cellules, ou comme matière première pour les organoïdes, par exemple.
Le besoin de tissus frais est l’une des limites de la méthode. Une approche alternative qui se concentre sur l’isolement des noyaux, le séquençage de l’ARN à noyau unique (sNuc-seq)13, a récemment été utilisée pour étudier les tumeurs PDAC de patients à une résolution unicellulaire11 ; À l’avenir, il sera intéressant de comparer la qualité des données des cellules épithéliales pancréatiques obtenues à partir du sNuc-seq par rapport au scRNA-seq. Il est important de noter que l’extraction du noyau ne permet pas la culture cellulaire et que le tri pour enrichir des types de cellules spécifiques est extrêmement difficile. Par conséquent, le protocole de dissociation tissulaire sera utile à l’avenir pour les expériences de scRNA-seq et pour ces applications supplémentaires.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier la Dre Avital Sarusi-Portuguez pour son aide dans l’analyse des données et la Dre Dror Kolodkin-Gal pour son aide dans l’établissement du protocole dans le cadre d’une étude précédente. Nous remercions tous les membres passés et présents du laboratoire Parnas. Nous remercions la Dre Gillian Kay et le Dr Michael Kanovsky pour leur aide dans la révision. Ce projet a reçu un financement de la Fondation israélienne pour la science (n° 526/18 O.P.), du programme Alex U. Soyka et d’une subvention du Fonds israélien de recherche sur le cancer (prix de développement de carrière en recherche).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent or Resource | |||
| 70 µm nylon mesh | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Fetal Bovine Serum South American | ThermoFisher | Cat#10270106 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Biological industries | cat#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D mice | Jackson Laboratory | JAX008179 | |
| MACS dead cells removal kit | Milteny Biotec | cat#130-090-101 | |
| PBS | Biological industries | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER mice | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato mice | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Trypsin C-EDTA 0.05% | Biological industries | cat# 03-053-1A | |
| Trypsin inhibitor | Roche | cat#T6522 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777 (2019).
- Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E.
- Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516 (2020).
- Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
- Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
- Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
- Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
