Summary
Gennemførligheden og effektiviteten af scRNA-seq-metoder med høj kapacitet indvarsler en enkeltcelleæra inden for planteforskning. Her præsenteres en robust og komplet procedure til isolering af specifikke Arabidopsis thaliana rodcelletyper og efterfølgende transkriptombibliotekskonstruktion og analyse.
Abstract
I flercellede organismer kan udviklingsprogrammering og miljøresponser være meget divergerende i forskellige celletyper eller endda inden for celler, hvilket er kendt som cellulær heterogenitet. I de senere år er enkeltcelle- og celletypeisolering kombineret med næste generations sekventeringsteknikker (NGS) blevet vigtige værktøjer til at studere biologiske processer ved enkeltcelleopløsning. Imidlertid er isolering af planteceller relativt vanskeligere på grund af tilstedeværelsen af plantecellevægge, hvilket begrænser anvendelsen af enkeltcellemetoder i planter. Denne protokol beskriver en robust procedure til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)-baseret enkeltcelle- og celletypeisolering med planteceller, som er velegnet til downstream multi-omics-analyse og andre undersøgelser. Ved hjælp af Arabidopsis rodfluorescerende markørlinjer demonstrerer vi, hvordan bestemte celletyper, såsom xylempol-pericykelceller, laterale rodudgangsceller, laterale rodhætteceller, cortexceller og endodermale celler, isoleres. Desuden leveres også en effektiv nedstrøms transkriptomanalysemetode ved hjælp af Smart-seq2. Celleisoleringsmetoden og transkriptomanalyseteknikkerne kan tilpasses andre celletyper og plantearter og har et bredt anvendelsespotentiale inden for plantevidenskab.
Introduction
Celler er den grundlæggende enhed for alle levende organismer og udfører strukturelle og fysiologiske funktioner. Selvom cellerne i flercellede organismer viser tilsyneladende synkronicitet, præsenterer celler af forskellige typer og individuelle celler forskelle i deres transkriptomer under udvikling og miljøresponser. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) giver hidtil uset kraft til forståelse af cellulær heterogenitet. Anvendelse af scRNA-seq i plantevidenskab har bidraget til vellykket konstruktion af et plantecelleatlas1, er blevet brugt til at identificere sjældne cellulære taxa i plantevæv2, har givet indsigt i sammensætningen af celletyper i plantevæv og er blevet brugt til at identificere cellulær identitet og vigtige funktioner, der anvendes under planteudvikling og differentiering. Derudover er det muligt at udlede spatiotemporale udviklingsbaner i plantevæv 1,2,3 for at opdage nye markørgener4 og studere funktionerne af vigtige transkriptionsfaktorer 5 ved hjælp af scRNA-seq for at afsløre den evolutionære bevarelse af den samme celletype i forskellige planter 3. Abiotiske belastninger er blandt de vigtigste miljøpåvirkninger på plantevækst og udvikling. Ved at undersøge ændringerne i sammensætningen af celletyper i plantevæv under forskellige behandlingsbetingelser gennem enkeltcelletranskriptomsekventering kan man også løse den abiotiske stressresponsmekanisme6.
Potentialet for at løse transkriptionel heterogenitet mellem celletyper ved hjælp af scRNA-sekventering afhænger af celleisolationsmetoden og sekventeringsplatformen. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er en meget anvendt teknik til isolering af en delpopulation af celler til scRNA-seq baseret på lysspredning og cellernes fluorescensegenskaber. Udviklingen af fluorescerende markørlinjer ved hjælp af transgen teknologi har i høj grad forbedret effektiviteten af celleisolering med FACS7. Udførelse af scRNA-seq ved hjælp af Smart-seq28 forbedrer yderligere evnen til at dissekere den cellulære heterogenitet. Smart-seq2-metoden har god følsomhed for gendetektion og kan detektere gener selv med et lavt transkriptionsinput9. Ud over indsamling af bulkcelletyper giver moderne cellesorterere et enkeltcelleindekssorteringsformat, der tillader transkriptomanalyse ved enkeltcelleopløsning ved hjælp af Smart-seq210 eller andre multipleksede RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Enkeltcelle- eller cellesortering kan potentielt bruges til mange andre downstream-applikationer, såsom parallelle multi-omics-undersøgelser12,13. Præsenteret her er en robust og alsidig protokol til isolering af plantecelletyper, såsom xylempol pericykelceller, laterale rodhætteceller, laterale rodudgangsceller, cortexceller og endodermale celler fra rødderne af Arabidopsis thaliana markørcellelinjer af FACS. Protokollen involverer yderligere konstruktion af Smart-seq2-biblioteket til downstream-transkriptomanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol er optimeret til A. thaliana vildtypefrø (WT) uden fluorescens og fluorescerende markørlinjer for følgende rodcelletyper: xylempolede pericykelceller (J0121), laterale rodudgangsceller, laterale rodhætteceller (J3411), endodermis og cortexceller (J0571) (figur 1A). Alle markørlinjerne blev opnået fra en kommerciel kilde (se materialetabellen), bortset fra den laterale rodinitieringscellemarkørlinje, som blev genereret ved at indføre en GATA23-promotordrevet GFP-konstruktion i en vildtype Arabidopsis-plante efter en tidligere offentliggjort rapport14.
1. Fremstilling af plantematerialet
- Steriliser A. thaliana WT frø og fluorescerende markørlinjefrø ved at inkubere frøene i 20% blegemiddel i en roterende inkubator ved stuetemperatur i 15 min.
- Skyl frøene i dobbeltdestilleret vand (ddH2O) tre til fem gange. Udfør dette trin på en steril ren bænk.
- Plade WT- og reporterlinjefrøene på halv styrke Murashige og Skoog (MS) medium med 0,8% agar (w / v) 15. Planterne dyrkes lodret i 5 dage (16 timers lys ved 23 °C) efter stratificering i 2 dage ved 4 °C.
2. Midlertidig
- Forbered protoplasteringsopløsningerne2,5, kaldet opløsning A og opløsning B (se materialetabel).
- Forbered opløsning A indeholdende 400 mM mannitol, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 og 20 mM KCl (se materialetabel). Opbevar opløsning A ved -20 °C i op til 1 måned.
- Forbered opløsning B ved at tilsætte 1 % (w/v) cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v) hemicellulase, 0,5 % (w/v) pectolyase og 1 % (w/v) macerozym R10 i en frisk prøve af opløsning A. Opbevar opløsning B ved -20 °C i op til 1 måned.
- Opløsning A og opløsning B tøs forsigtigt op på is, inden eksperimentet påbegyndes.
- Skær rødderne af med et rent blad eller en saks, og hak rødderne i ~ 0,5 cm stykker. Nedsænk rødderne i 1,5 ml opløsning B efterfulgt af forsigtig rotation (ved ca. 18 o / min) ved stuetemperatur i 1,5-2 timer.
- Filtrer rodprotoplasterne gennem 40 μm sinettet (se materialetabel).
- Skyl silnettet med 1-2 ml opløsning A.
- Væskerne fra trin 2.4 og trin 2.5 kombineres, og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten kasseres med en pipette, cellepelletsen resuspenderes i 500-600 μL opløsning A, hvorefter den straks lægges på is.
- Overfør den resuspenderede celleopløsning til et nyt 5 ml reagensglas til cellesortering.
3. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)
- Tænd og afslut instrumentopsætningstrinnene på sorteringsmaskinen (se Materialetabel). Vælg fluorescenskanalerne, brug et WT-anlæg (ingen fluorescens) som kontrol til at bestemme basislinjen for autofluorescens, og juster sorteringsporten baseret på fluorescensintensiteten og FSC/SSC-singlets (figur 2).
- Der tilsættes 500 μL opløsning A (trin 2.1.1) i et 1,5 ml opsamlingsrør for at forhindre, at cellerne beskadiges. Saml 2.000-3.000 celler pr. rør.
- Efter sorteringen anbringes prøverne straks på is, centrifugeres opsamlingsglasset med cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C, og supernatanten fjernes med en pipette.
- Tag 2 μL sorterede celler, og kontroller for fluorescens ved hjælp af et fluorescensmikroskop (se materialetabel).
- Opbevar de sorterede celler ved -80 °C, eller brug dem straks til biblioteksbyggeri (trin 4).
- Ved sortering af enkeltcelleindeks skal du placere 96-brøndpladen i adapteren. Kalibrer pladens position, så dråben falder i pladens midterhul. Vælg sorteringstilstand for enkeltceller, når du sorterer, indtast målantallet af sorterede celler som 1, og start sorteringen.
4. Smart-seq2 bibliotek forberedelse
- Som et resultat af den ultralave mængde input skal du udføre enkeltcelletype RNA-seq-bibliotekskonstruktion i et forureningsfrit miljø. Før du begynder eksperimentet, skal du rengøre bænken med et overfladedekontaminant8 (se materialetabel) og 75% ethanol.
- Forbered lysisbuffer (blanding A) (tabel 1) ved at kombinere 0,33 μL 10% Triton X-100, 0,55 μL RNasehæmmer og 0,22 μL 0,1 M DTT (se materialetabel).
- Der tilsættes 1 μL blanding A i den sorterede prøve, og der males med en steril pistil. Det foretrukne prøvevolumen er ≤0,5 μL; Brug RNasefrit vand til at fylde volumen op til 14 μL. Overfør hver enkelt celleprøve til et 0,2 ml tyndvægget PCR-rør.
- Forbered blanding B indeholdende 0,44 μL oligo-dT30VN revers transkription (RT) reaktionsprimer (100 μM) og 4,4 μL dNTP'er (10 mM) (tabel 2) (se materialetabel).
- Der tilsættes 4,4 μL blanding B til prøven på 14 μL i hvert glas, pipetten blandes forsigtigt, og prøven inkuberes ved 72 °C i 3 minutter. Efter inkubation sættes prøverne straks på is for at hybridisere oligo-dT til poly A-halen.
- Forbered den omvendte transkriptionsreaktionsblanding (blanding C) (tabel 3) (se materialetabel). Der tilsættes 21,6 μL blanding C til hvert glas, der indeholder prøverne. Tænd RT-programmet på et fælles PCR-instrument (tabel 4).
- Udfør forforstærkningsreaktionen på is. Forbered blanding D ved at kombinere 44 μL 2x PCR-polymeraseblanding og 0,88 μL IS PCR-primer (10 μM) (tabel 5) (se materialetabel). Der tilsættes 40,8 μL blanding D til 40 μL RT-reaktionsproduktet, og foramplifikationsprogrammet køres (tabel 6).
- Rens præamplifikationsreaktionsprodukterne ved hjælp af Ampure XP-perler (se materialetabel). Fra trin 4.7 tilsættes 48 μL perler (0,6:1-forhold) i hver prøve, og prøverne blandes forsigtigt ved pipettering.
- Prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Anbring de 1,5 ml rør, der indeholder prøverne, på et magnetisk separationsstativ i 5 min. Supernatanten kasseres forsigtigt af prøverne, uden at perlerne forstyrres.
- Perlerne vaskes ved at resuspendere dem i 200 μL 80 % ethanol, og prøverne anbringes på det magnetiske separationsstativ (se materialetabellen) i yderligere 3 minutter, før den ethanolholdige supernatant kasseres.
- Lufttør prøverne i 10 minutter, og dæk røret til for at forhindre kontaminering og krydskontaminering under lufttørringen.
- Perlerne resuspenderes i 20 μL ddH2O, prøverne inkuberes ved stuetemperatur i 5 min, og de anbringes derefter på det magnetiske separationsstativ i 5 min.
- Der pipetteres 18 μL supernatant ud af hvert glas, og prøverne overføres til nye 1,5 ml centrifugeglas. Brug 1 μL af prøven til at vurdere kvaliteten af cDNA'et ved hjælp af et DNA-kvantificeringssæt, bestemme størrelsesfordelingen af hvert forbibliotek ved hjælp af en fragmentanalysator (se materialetabel) og opbevar den resterende prøve ved -20 °C.
- Konstruer et cDNA-bibliotek8 til Illumina-sekventering 16 fra forbiblioteksproduktet i trin4.13 ved hjælp af et sekventeringsbiblioteksforberedelsessæt (se materialetabel).
- Rens bibliotekerne (fra trin 4.14) ved hjælp af Ampure XP-perlerne, kvantificer de rensede biblioteker, og bestem størrelsesfordelingen for hvert bibliotek efter trin 4.13.
BEMÆRK: Pool lige nanomol af hvert bibliotek, hvilket sikrer, at ingen af dem har den samme kombination af Illumina-indeks. Ellers kan bibliotekerne samles i et forhold baseret på det ønskede sekventeringsoutput og sekventeres sammen på samme bane som Illumina-sequenceren. Generelt giver sekventering af hvert bibliotek til en dybde på 4-6 GB, hvilket giver >10 millioner kortlagte læsninger, 20x-30x dækning af Arabidopsis-genomet . Lavere sekventeringsdybder er også acceptable, men kan påvirke betydningen af differentialekspressionsanalysen.
5. RNA-seq dataanalyse
- Trim de rå aflæsninger ved hjælp af Trim-Galore17 efterfulgt af kortlægning til referencegenomet ved hjælp af hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), og fjern de PCR-duplikerede fragmenter ved hjælp af Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
- Udfør råtællingsbehandlingen og den efterfølgende analyse af de differentielt udtrykte gener (DEG) med DESeq220 ved hjælp af mindst tre biologiske replikater til hver prøve. Udfør klyngedannelse af genekspressionen med Pheatmap-pakken, og visualiser i et ekspressionsvarmekort.
BEMÆRK: RPKM-værdierne (aflæsninger pr. kilobase pr. million kortlagte læsninger) for generne og TEs (transponerbare elementer) blev beregnet med Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) og visualiseret i en genombrowser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protoplast isolering
Denne protokol er effektiv til protoplastsortering af fluorescerende A. thaliana rodmarkørlinjer. Disse markørlinjer er udviklet ved fusion af fluorescerende proteiner med gener, der udtrykkes specifikt i målcelletyper, eller ved hjælp af forstærkerfældelinjer (figur 1). Talrige væv og organer er blevet dissekeret i celletyper, der udtrykker specifikke fluorescerende markører i modelplanter og afgrøder.
FACS-population, sorterede celler og biblioteks-QC
Ved at bruge en vildtypeplante som kontrol- og indstillingsport såsom fremadrettet spredning (FSC) og sidespredning (SSC) bestemte vi en større population af celler af interesse og en baseline for autofluorescens og sorterede med succes de fluorescensspecifikke markerede celler (figur 2). Kvaliteten af de endelige sekventeringsbiblioteker (fra trin 4.15) blev bestemt af fragmentstørrelsesfordelingsanalysen. De repræsentative resultater af RNA-seq-biblioteket af ca. 2.000 xylempol-pericykelceller, laterale rodprimordiaceller, endodermis/cortexceller og laterale rodhætteceller er vist i figur 3A-D.
Analyse af udtryksmønstre
Kvaliteten af sekventeringsdataene kan evalueres ud fra flere analyseprocedurer, såsom sekventeringsdybde, kortlægningshastighed og fastQC-rapporter. Nøjagtigheden og følsomheden af sekventeringsdataene kan påvises ved tilstedeværelsen af en række celletypeberigede gener, som kan identificeres ud fra DEG-analysen mellem isolerede celletyper og hele vævet. Gener med signifikant højere ekspressionsniveauer i visse celletyper kan identificeres som celletypeberigede gener. I mellemtiden kan genom-browservisningerne for hver celletype sammenlignes side om side for at vise ekspressionsniveauerne for kendte markørgener og teste, om ekspressionsmønsteret for markørgenerne kan rekonstrueres i celletypeekspressionsdataene. Som et eksempel blev de gener, der er beriget i en af de fire rodcelletyper, grupperet og vist i heatmap, som viste specificiteten af genekspression blandt forskellige celletyper (figur 4). YUCCA3, MYB36, WOX5 og PFA1 blev undersøgt, og ekspressionsmønstrene var som forventet ifølge tidligere rapporter21,22,23,24. Dataanalysepipelines og repræsentative rå sekventeringsdata er tilgængelige i et offentligt lager (github.com/gaolabsjtu/root_cell_types_RNAseq).
Figur 1: Den specifikke celletype markørlinje for rod- og protoplastpræparation . (A, venstre) Introduktion og billeder af forstærkerfældelinje. (A, højre) Rodens specifikke celletypemarkørlinje. B) Et billede af protoplastpræparatet inden sortering. Skalastængerne for den laterale rodstiftercelle, pericykel, endodermis / cortex, lateral rodhætte og protoplaster repræsenterer henholdsvis 25 μm, 100 μm, 100 μm, 75 μm og 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Etablering af FACS for specifikke rodcelletyper. Eksempel på et FACS-eksperiment: (A) den største population, der anvender SSC og FSC; B) GFP-positive (+) og GFP-negative (-) gates (C) brightfield- og (D) fluorescensbilleder af de sorterede celler. Skalabjælken repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Størrelsesfordeling af Smart-seq2-sekventeringsbiblioteker. Repræsentative fragmentstørrelsesfordelinger af sekventeringsbibliotekerne (fra trin 4.15) genereret fra xylempolede pericykelceller (A), laterale rodprimordiaceller (B), endodermis/cortexceller (C) og laterale rodhætteceller (D). (E) Et lille bibliotek med primer/adapter dimer peaks, som stadig kan sekvenseres efter valg af størrelse. (F) Et bibliotek med en unormal størrelsesfordeling, hvilket indikerede mislykket biblioteksforberedelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Celletypeberiget genanalyse. En DEG-analyse blev udført mellem hver celletype og hele roden; Gener med mere end fire gange opregulering i hver celletype blev identificeret som celletypeberigede gener. Disse gener blev kombineret, grupperet og visualiseret i heatmap (øverste panel) plot. De celletypeberigede gener omfattede mange kendte markørgener; typiske markørgener som YUCCA3, MYB36, WOX5 og PFA1 blev valgt til at vise i genombrowseren (nederste panel). Forkortelser: LRP = lateral root primordia; Endo/Cor = endodermis/cortex; LRC = lateral rodhætte. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponenter | Volumen (μL) |
| 10% Triton X-100 | 0.33 |
| RNase-hæmmer | 0.55 |
| DTT (0,1 m) | 0.22 |
Tabel 1: Reaktionskomponenter til fremstilling af cellelysebufferen (blanding A).
| Komponenter | Volumen (μL) |
| Oligo-dT30VN (100 μM) | 0.44 |
| dNTP'er (10 mM) | 4.4 |
Tabel 2: Reaktionskomponenter til fremstilling af blanding B.
| Komponenter | Volumen (μL) |
| SuperScript IV-buffer (5x) | 8.8 |
| Betain (5 m) | 8.8 |
| DTT (0,1 m) | 2.2 |
| MgCl2 (1 m) | 0.264 |
| TSO (100 μM) | 0.44 |
| SuperScript IV revers transkriptase (200 E/μL) | 2.2 |
| RNase-hæmmer | 1.1 |
Tabel 3: Reaktionskomponenter til fremstilling af den omvendte transkription PCR-blanding (blanding C).
| Cykle | Temperatur (°C) | Tidspunkt |
| 1 | 50 | 90 minutter |
| 2-11 | 55 | 2 minutter |
| 50 | 2 minutter | |
| 12 | 70 | 15 minutter |
| 13 | 4 | ∞ |
Tabel 4: Revers transkription (RT) PCR-indstillinger til syntetisering af cDNA fra mRNA.
| Komponenter | Volumen (μL) |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | 44 |
| IS PCR-primer (10 μM) | 0.88 |
Tabel 5: Reaktionskomponenter til fremstilling af præamplifikationsreaktionsblandingen (blanding D).
| Cykle | Temperatur (°C) | Tidspunkt |
| 1 | 98 | 5 minutter |
| 2-13 | 98 | 20 sek. |
| 67 | 30 s | |
| 72 | 3 minutter | |
| 14 | 72 | 5 minutter |
| 15 | 4 | ∞ |
Tabel 6: PCR-programindstillinger for forforstærkningsreaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Smart-seq2-baserede protokol kan generere pålidelige sekventeringsbiblioteker fra flere hundrede celler8. Udgangsmaterialets kvalitet er afgørende for nøjagtigheden af transkriptomanalysen. FACS er et kraftfuldt værktøj til fremstilling af celler af interesse, men denne procedure, især protoplasteringstrinnet, skal optimeres til planteapplikationer. Laserfangstmikrodissektion (LCM) eller manuelle dissekerede celler kan også bruges som input25,26, så protokollen, der leveres her, kan potentielt bruges i en række plantearter og celletyper med eller uden kendte markørgener.
Fremstilling af plantematerialet
I planteudviklingsbiologi bruges FACS normalt til at isolere berigede cellepopulationer, der udtrykker en fluorescerende markør. De planter, der udtrykker en sådan markør, protoplasteres, og protoplasterne sorteres til sidst i rene subpopulationer baseret på ekspressionen af den celletypespecifikke markør. Derfor skal signalet fra den fluorescerende markør være stærkt og specifikt. Derudover bør forskeren kontrollere, hvilke markører der kan sorteres på forhånd. Antallet af frø, der er nødvendige, afhænger af ekspressionsniveauet, hvor markøren udtrykkes, hvor mange celler der er nødvendige til downstream-applikationer, og hvor mange replikater der sorteres. Hvis udtrykket er i en enkelt celletype med meget få celler pr. plante, er der generelt behov for et større antal planter, end hvis markøren udtrykkes i et højere antal celler. Det er bedst at empirisk bestemme antallet af frø, der kræves til individuelle markørlinjer. Det er især meningsfuldt at udføre indledende forsøg med hver markørlinje for at optimere vinduet til sortering og vide, hvor mange celler der vil være resultatet af et fast antal planter. Hvis forsøgsmaterialet er rødder, kan der for at forhindre, at rødderne synker ned i agaren, og for at lette skæringen af rene rødder lægges et passende størrelse og autoklaveret net på den mediumholdige agar før forpletteringen. Stratificering ved lav temperatur hjælper frøspiring og udvikling, så vi foreslår at stratificere frøene ved 4 ° C i 2 dage efter sterilisering eller plettering og derefter dyrke planterne lodret.
Protoplasting og FACS
Protoplasting og sortering 5-6 dage efter stratificering fungerer godt. Opløsning A og opløsning B skal filtreres ved hjælp af en 0,22 μm si. Derudover nedsætter opbevaring af opløsning B ved -20 °C over længere tidsperioder enzymernes effektivitet. Før opløsning A og opløsning B påbegyndes, skal de tøs forsigtigt op på is, hvilket tager ca. 20 minutter. Opløsning B må ikke rystes, da omrystning af opløsning B kan forstyrre enzymerne og forårsage overdreven bobledannelse. Vask af sinettet med opløsning A flere gange kan øge antallet af celler opnået i trin 2.5. Som beskrevet i trin 2.6 bør hele supernatanten ikke aspireres, da protoplasterne er i bunden nær pelleten og ikke kan ses. Før sortering er det bedst at sikre, at koncentrationen af protoplaster er ca. 105-10 6 celler / ml for at opnå bedre sorteringseffektivitet. Ved etablering af et nyt forsøg kræves det samme væv fra WT-anlægget som kontrol til opsætning af sorteringsporten. I trin 3.1 anbefales det først at vælge fluorescenskanalerne (f.eks. PE og FITC) og bruge en kontrolprøve til at bestemme den største population i henhold til SSC og FSC. Derudover foreslås det at justere portens position ved at ændre fluorescenskanalens spænding for at sikre, at styresignalet er placeret til venstre for porten (dvs. den negative gruppe er placeret under 103). Sorteringstiden skal begrænses til 30 minutter eller mindre end 60 minutter for at forhindre ændringer i genekspression, som kan opstå på grund af protoplastering eller sortering. Efter sortering skal et lille antal sorterede celler indsamles og kontrolleres for fluorescens (trin 3.4). Der bør fjernes så meget buffer som muligt fra supernatanten for at undgå enhver indvirkning på nedstrømsbibliotekets konstruktion (trin 3.3).
Opbygning af RNA-seq-biblioteket
Til konstruktion af RNA-seq-biblioteket anbefaler vi at bruge celler umiddelbart efter sortering for at reducere nedbrydningen af RNA'et. Det er ikke tilrådeligt at starte med for mange celler, da dette kan resultere i et bibliotek af dårlig kvalitet på grund af utilstrækkelige reaktioner. Antallet af PCR-cyklusser i trin 4.7 og trin 4.14 afhænger af inputmængden af RNA/cDNA. Antallet af cyklusser kan øges, når der er mindre input eller sænkes, når der er mere input. Derfor anbefales det at tage nogle af de blandede prøver fra trin 4.7 og trin 4.14 for at køre PCR i realtid med den samme forstærkningsprocedure og derefter bestemme det endelige antal cyklusser baseret på resultaterne af qPCR før den formelle forstærkning af forbiblioteket / biblioteket. Derudover skal Ampure XP-perlerne inden rensningstrin 4.8 ekvilibreres ved stuetemperatur i mindst 10 minutter og derefter hvirvles godt. Mængden af perler i rensningstrinnet bør ikke øges over forholdet 0,8: 1. Ellers vil dette øge overførslen af primerdimerer. Derudover bør man undgå overtørring af perlerne i trin 4.11 for at forhindre vanskelig resuspension. Et kvalificeret forbibliotek skal have en gennemsnitlig størrelse på ca. 1,5-2 kb og en lille mængde korte (<500 bp) fragmenter. Unormale størrelsesfordelinger eller små primer/adapter-dimertoppe i biblioteker er indikatorer for dårlig kvalitet, og disse prøver bør kasseres eller gennemgå yderligere runder af perlerensning (trin 4.15) (figur 3E-F).
Begrænsninger
Denne protokol kan anvendes til at isolere celler fra andre plantevæv og andre plantearter. Imidlertid er celleisoleringsprocessen stærkt afhængig af fremstillingen af protoplasterne. Nogle celletyper er vanskelige at isolere, såsom vaskulære celler og kvindelige kønsceller, som er placeret i det indre af vævet og / eller er få i antal. For celler, hvor det er vanskeligt at forberede protoplaster, er fluorescensaktiveret kernesortering (FANS)27 en valgfri metode, der kan anvendes. I mellemtiden afhænger brugen af denne protokol til at opnå specifikke celletyper ved FACS af tilgængeligheden af fluorescerende markørlinjer. Manglen på sådanne markørlinjer begrænser brugen af disse metoder i afgrøder og gartnerier. Anvendelsen af højkapacitets enkeltcelle RNA-seq-teknologi i afgrøder vil afsløre nye celletypespecifikke markørgener, som yderligere kan bruges til at udvikle celletypemarkørlinjer og udvide anvendelseskapaciteten for FACS-baserede celletype-RNA-seq- og multi-omics-undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi oprettede denne protokol i enkeltcelle multi-omics-anlægget på School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University og blev støttet af National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 32070608), Shanghai Pujiang-programmet (tilskud nr. 20PJ1405800) og Shanghai Jiao Tong University (bevilling nr. Agri-X20200202, 2019TPB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm strainer | Sorfa | 622110 | |
| Agar | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent high-sensitivity DNA kit | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP beads | BECKMAN | A63881 | |
| Betaine | yuanye | S18046-100g | |
| Bleach | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) bleach |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| Cellulase R10 | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult (Japan) | 9012-54-8 | |
| Centrifuge tube (1.5 mL) | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen |
18090050 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 100092680 | |
| FACS | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| FACS | Sony | SH800S | |
| Filter tip (1000 µL) | Thermo Scientific | TF112-1000-Q | |
| Filter tip (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| Filter tip (10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| Filter tip (100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Eclipse Ni-E | |
| Four-Dimensional Rotating Mixer | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| Hemicellulase | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' |
||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | Roche | 7958935001 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult (Japan) | 9032-75-1 | |
| Magnetic separation stand | invitrogen | 12321D | |
| Mannitol | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | aladdin | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| Micro-mini-centrifuge | Titan | Timi-10k | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' |
||
| PCR instrument | Thermal cycler | A24811 | |
| Pectolyase | Yakult (Japan) | 9033-35-6 | |
| Plant marker lines | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | invitrogen | Q32866 | |
| RNase inhibitor | Thermo Scientific | EO0382 | |
| RNase-free water | invitrogen | 10977023 | |
| Solution A | 400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl | ||
| Solution B | 1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 % (w/v)hemicellulase, 0.5 % (w/v)pectolyase and 1 % (w/v) Macerozyme R10 in a fresh aliquot of solution A | ||
| Sterile pestle | BIOTREAT | 453463 | |
| Strainer (40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV buffer (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| Test tube (5 mL) | BD Falcon | 352052 | |
| Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL) | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' |
||
| Vortex | Titan | VM-T2 |
References
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).
- Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
- Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
- Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
- Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
- Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
- Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
- Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
- Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
- De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
- Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
- Levy, S. E., Myers, R. M.
- Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
- Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
- Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
- Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
- Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139 (2016).
- Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
- Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).
