Протокол оценки и количественной оценки патологий пигментного эпителия сетчатки на мышиных моделях возрастной макулярной дегенерации

Summary

Мышиные модели могут быть полезными инструментами для исследования биологии пигментного эпителия сетчатки (RPE). Установлено, что у мышей может развиться целый ряд патологий РПЭ. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для выяснения и количественной оценки патологий RPE у мышей с использованием световой, просвечивающей электронной и конфокальной микроскопии.

Abstract

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является изнурительным заболеванием сетчатки у стареющего населения. Широко распространено мнение, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) является ключевым патобиологическим событием при ВМД. Чтобы понять механизмы, которые приводят к дисфункции RPE, исследователи могут использовать модели мышей. Предыдущими исследованиями было установлено, что у мышей могут развиваться патологии РПЭ, некоторые из которых наблюдаются в глазах людей с диагнозом ВМД. Здесь мы описываем протокол фенотипирования для оценки патологий RPE у мышей. Этот протокол включает в себя подготовку и оценку поперечных срезов сетчатки с использованием световой микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии, а также плоских креплений RPE с помощью конфокальной микроскопии. Мы подробно описываем распространенные типы патологий RPE у мышей, наблюдаемые с помощью этих методов, и способы их количественной оценки с помощью объективных методов статистического тестирования. В качестве доказательства концепции мы используем этот протокол фенотипирования RPE для количественной оценки патологий RPE, наблюдаемых у мышей с сверхэкспрессией трансмембранного белка 135 (Tmem135) и старых мышей C57BL / 6J дикого типа. Основная цель этого протокола — представить стандартные методы фенотипирования RPE с объективными количественными оценками для ученых, использующих мышиные модели ВМД.

Introduction

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является распространенным заболеванием, приводящим к слепоте, которое поражает население старше 55 лет¹. Многие исследователи считают, что дисфункция пигментного эпителия сетчатки (RPE) является ранним и важным патобиологическим событием при ВМД². RPE представляет собой монослой поляризованных клеток, которым поручено поддерживать гомеостаз соседних фоторецепторов и хориоидальных кровеносных сосудов³. Существует множество моделей для исследования связанных с заболеванием механизмов в RPE, включая модели^{клеточных культур 4,5}

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Висконсин-Мэдисон и соответствуют Заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.

1. Оценка СИЗОД мыши с помощью световой микроскопии

1. Сделайте фиксирующий буфер с конечной концентрацией 2% параформальдегида и 2% глутарового альдегида при комнатной температуре (RT) в стеклянной бутылке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола требуется не более 14 мл фиксирующего буфера на мыш....

Results

Завершение протокола фенотипирования RPE, описанного в этой статье, обеспечивает количественный анализ структурных аномалий RPE, обычно наблюдаемых в мышиных моделях AMD. Чтобы подтвердить эффективность этого протокола, мы использовали его на мышах, которые, как известно, проявляют патологии RPE, включая трансгенных мышей, которые сверхэкспрессируют WT Tmem135, управляемых куриным промотором бета-актина (Tmem135 TG)30, и мышей в возрасте C57BL / 6J ^31,32

Discussion

В этой статье мы представили протокол фенотипирования для оценки структурных патологий RPE мышиных моделей. Мы описали этапы, необходимые для обработки глаз для различных методов визуализации, включая световую, просвечивающую электронную и конфокальную микроскопию, а также количественную оценку типичных патологий, наблюдаемых с помощью этих методов визуализации. Мы доказали эффективность нашего протокола фенотипирования РПЭ, исследуя Tmem135 TG и 24-месячных мышей WT, так как у этих мышей наблюдаются па.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 М какодилатный буфер pH7.2	PolyScientiifc R& D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Для этого протокола необходимы два (один для H& Слайды с E-образным окрашиванием и одно для плоских креплений RPE.)
100% этанол	MDS Warehouse	2292-CASE	может использоваться для приготовления растворов разбавленного этанола в этом протоколе.
1-ходовой запорный кран, 2 замка Люэра с внутренней резьбой	Qosina	11069
1x Фосфатный буферный раствор (PBS)			В этом протоколе можно использовать предварительно изготовленный 1x PBS.
2,0 мл микропробирки	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Резонатор Встраивание Замена капсулы Электронная	микроскопия Науки	70165
24-дюймовая трубка из ПВХ с концами Люэра	Fisher Scientific	NC1376778
400 меш Позолота Тонкий стержень квадратная сетка	Электронная микроскопия науки	T400-Cu
95% этанол	MDS Склад	2293-CASE
Впитывающие пеленки с водонепроницаемым влагозащитным барьером (23 дюйма на 24 дюйма)	VWR	56616-031
Регулируемый 237 мл  Пульверизатор	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Алюминиевая фольга
BD Прецизионный скольжение 19 калибр Игла для шприца	Sigma-Aldrich
Орляковые щипцы; Изогнутый; Мелкие поперечные зазубрины; Длина 4 дюйма, ширина наконечника 1 мм Хирургический	инструмент Roboz	RS-5211	В этом протоколе известен как изогнутые щипцы.
Щетка из верблюжьей шерсти	Электронная микроскопия Науки	65575-02
Камера
углекислого газа Расходомер
углекислого газа Резервуар
Удлиненные зажимы Castaloy Зубцы	Fisher Scientific	05-769-7Q
Чугунная L-образная опорная подставка	Fisher Scientific	11-474-207
		Cell Prolifer	Доступна для скачивания: https://cellprofiler.org/releases
Прозрачный лак для ногтей	Электронная микроскопия Науки	72180
Микроскоп Colorfrost Слайды Лаванда	VWR	10118-956
Компьютер
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
протоколе использовалась дистиллированная вода H20			из системы очистки Milli-Q.
пинцет Dumont с тонким кончиком; Шаблон #55	Роботизированный хирургический инструмент	RS-4984	Известен как щипцы с тонкими наконечниками в этом протоколе, и для этого протокола необходимо 3 (два для вскрытия и один для обработки с помощью электронного микроскопа).
Держатель сетки для электронной микроскопии	Электронная микроскопия Науки	71147-01
EPON 815 Смола	Электронная микроскопия	наук 14910
Epredia Mark-It Маркировка тканей Желтый краситель	Fisher Scientific	22050460	Пожалуйста, следуйте протоколу производителя при использовании этого красителя для маркировки тканей.
Монтажный носитель Epredia	Fisher Scientific	22-110-610	Использование для монтажа H& E слайды.
Fiber-Lite Mi-150 Осветитель Серия, 150 Вт Галогенный источник света	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Источник света для препарирующего микроскопа.
		Fiji ImageJ	Доступна для скачивания: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
вытяжного шкафа
2,5% в фосфатном буфере, pH 7,4, 32%	Электронная микроскопия	наук 16537-05
JEM-1400 Просвечивающий электронный микроскоп (JEOL) с ПЗС-камерой
Лабораторный настольный шейкер			Для этих экспериментов нужны два. Один должен быть комнатной температуры, а другой — в холодном помещении с температурой 4 градуса Цельсия.
Лазерная криометка Метки	Электронная микроскопия Науки	77564-05
Цитрат свинца	Электронная микроскопия Науки	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Используйте эти покровные стекла для плоских креплений RPE, так как они имеют приподнятые края и подходят к толщине RPE.
Гематоксилин Майера	VWR	100504-406
Микродиссекционные пружинные ножницы McPherson-Vannas	Роботизированный хирургический инструмент	RS-5600	Известен как микрорассекающие ножницы в протоколе.
Метанол	Fisher Scientific	Мыши A412-4
Любая			модель мыши AMD и соответствующие элементы управления могут работать по этому протоколу.
микроножницы для препарирования; Стандартное исполнение; Изогнутый; острые точки; Длина лезвия 24 мм; Общая длина 4,5 дюйма	Роботизированный хирургический инструмент	RS-5913	Известен как изогнутые ножницы в этом протоколе.
Штативы для микротрубок
			Nikon A1RS
Нормальная сыворотка осла	SouthernBiotech	0030-01
No 11 Стерильные одноразовые лезвия скальпеля	VWR	21909-380
	Электронная микроскопия наук	19150
Параформальдегид, 32%	Электронная микроскопия	наук 15714-S
Карандаш
Чашка Петри	VWR	21909-380
Наконечники
Поликлональное антитело Anti-ZO-1	Thermo Fisher Scientific	402200
Пропиленоксид	Электронная микроскопия Sciences	20412
Бритвенное лезвие	VWR	10040-386
Неглубокий лоток для перфузии
Shandon Eosin Y Alcohol	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Черный перманентный маркер	Скобы	642736
решетка для ползунков для окрашивания	Grainger	49WF31
Квадратная крышка Стеклопакеты	Fisher Scientific	12-541B
Тарелка для окрашивания с крышкой	Grainger	49WF30	Need 15 for H& Процедура окрашивания.
Target Цельнопластиковый одноразовый шприц Luer-Slip 50 мл	Термо Научный	S7510-50	Используйте только цилиндр шприца.
Таймер	Fisher	1464917
Uranyl Ацетат	Электронная микроскопия Sciences	22400
Вакуумная печь
Vectashield Монтаж Medium	Vector Laboratories	H-1000	Использование для монтажа плоских креплений RPE.
Ксилол	Фишер Научный
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			Этот микроскоп способен генерировать сшитые 20-кратные изображения. Если световой микроскоп не обладает такой емкостью, то сделайте снимки всей сетчатки, которые немного накладываются друг на друга. Используйте Adobe Photoshop, чтобы сшить эти изображения вместе. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям программы Adobe Photoshop для сшивания изображений.
Zeiss Stemi 2000 Препарирующий микроскоп	для электронной микроскопии	65575-02