Summary
이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
CRISPR/Cas9 기술은 인간 유전 질환 모델링, 질병 발병기전 연구 및 약물 스크리닝을 위한 제브라피쉬의 가치를 높였지만, 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)로 인한 인간 유전 질환의 정확한 동물 모델을 만드는 데 있어 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 한계가 주요 장애물입니다. 지금까지 광범위한 PAM 호환성을 가진 일부 SpCas9 변종은 제브라피쉬에서 효율성을 보여주었습니다. 최적화된 SpRY 매개 아데닌 염기 편집기(ABE), zSpRY-ABE8e 및 합성 변형 gRNA를 제브라피쉬에 적용하면 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌-구아닌 염기 전환이 가능해졌습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬에서 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 위한 프로토콜입니다. zSpRY-ABE8e mRNA와 합성 변형 gRNA의 혼합물을 제브라피쉬 배아에 주입하여 TSR2 리보솜 성숙 인자(tsr2)의 병원성 부위를 시뮬레이션하는 정확한 돌연변이로 제브라피쉬 질병 모델을 구성했습니다. 이 방법은 질병 메커니즘 및 치료법을 연구하기 위한 정확한 질병 모델을 확립하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 유발하는 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV)는 인간 게놈1에서 가장 흔한 돌연변이 원인입니다. 특정 SNV가 병원성인지 여부를 확인하고 발병기전을 밝히기 위해서는 정확한 동물모델이 필요하다2. 제브라피쉬는 인간과 높은 수준의 생리적, 유전적 상동성, 짧은 발달 주기, 강력한 생식 능력을 나타내는 우수한 인간 질병 모델로, 병원성 특성 및 메커니즘에 대한 연구와 약물 스크리닝에 유리합니다3.
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템은 제브라피시4를 포함한 다양한 종의 게놈 편집에 널리 적용되었습니다. gRNA 유도를 통해 CRISPR/Cas9 시스템은 표적 부위에서 DNA 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있으며, 이는 상동성 지향 복구(HDR) 경로를 통해 표적 부위와 기증자 DNA 템플릿의 재조합을 통해 단일 염기 치환을 가능하게 합니다. 그러나, 이 염기 치환 방법의 효율은 매우 낮은데, 이는 세포 DNA 복구 과정이 주로 삽입 및 결실(indel) 돌연변이를 동반하는 비상동 말단 결합(non-homologous end-joining, NHEJ) 경로에 의해 수행되기 때문이다5. 다행스럽게도 CRISPR/Cas9 기반 단일 염기 편집 기술은 DSB를 유도하지 않고도 보다 효율적인 단일 염기 편집이 가능한 염기 편집기를 사용하여 이 문제를 크게 완화합니다. 염기 편집기의 두 가지 주요 클래스인 아데닌 염기 편집자(ABE)와 시토신 염기 편집자(CBE)는 A· T에서 G· C와 C·G에서 T· A는 각각 6,7,8,9,10,11이다. 이 4가지 유형의 염기 치환은 인간 병원성 변이체의 30%를 차지한다12. PmCDA1, BE 시스템, CBE4max, ABE7.10 및 ABE8e를 포함한 두 종류의 기본 편집기는 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 특히 BE4max 및 ABE8e는 높은 편집 활동 13,14,15,16,17,18,19를 달성하는 것으로 보고되었습니다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes), 큰개자리 개(S. canis)를 포함한 다양한 종의 Cas9 단백질이 제브라피쉬 유전자 편집에 구현되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)가 가장 널리 사용되고 있습니다 20,21,22,23. 그러나, SpCas9는 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)가 있는 표적 부위만 인식할 수 있으며, 이는 편집 가능한 범위를 제한하고 병원성 관심 부위 근처에서 적절한 서열을 발견하지 못하게 할 수 있다24. 목표 범위를 확장하기 위해 다양한 SpCas9 변형이 유도 진화 및 구조 유도 설계를 통해 다양한 PAM을 인식하도록 설계되었습니다. 그러나 동물, 특히 제브라피쉬에서 효과적인 변종은 거의 없으며, 이는 SNV 관련 질병 연구에서 제브라피쉬의 적용을 제한합니다25,26,27,28. 최근에, 덜 엄격한 PAM 제한(NYN보다 NRN에 대한 선호도가 더 높은 SpG에 대한 NGN 및 SpRY에 대한 NNN)을 갖는 SpCas9, SpG 및 SpRY의 두 가지 변이체가 인간 세포 및 식물에서 높은 편집 활성을 나타내는 것으로 보고되었습니다 29,30,31,32. 그 후, SpG 및 SpRY뿐만 아니라 SpRY 매개 CBE 및 SpRY 매개 ABE와 같은 다수의 중재 기본 편집기도 제브라피쉬에서 작동하는 것으로 보고되었으며, 이는 SNV 관련 질병의 기계론적 연구 및 약물 스크리닝에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다 18,33,34,35. 또한, i-Silence는 ATG에서 GTG 또는 ACG36으로의 ABE 매개 시작 코돈 전환을 통해 효과적이고 정확한 유전자 녹아웃 전략으로 제안되었습니다. i-Silence 전략과 SpRY 매개 베이스 편집기 zSpRY-ABE8e의 조합은 질병 모델링을 위한 새로운 방법을 제공한다(18). 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 zSpRY-ABE8e를 사용하여 유전자 편집을 수행하여 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 모델을 구성하는 방법을 보여줍니다. 제브라피쉬 모델에 나타나는 편집 효율성과 표현형을 평가하고 분석했습니다.
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Protocol
본 연구는 화남사범대학 관리이용위원회의 지침을 엄격히 준수하여 수행되었다.
1. 합성 변형 gRNA 및 zSpRY-ABE8e mRNA 제조
- 이전 간행물37,38에 따라 gRNA를 설계합니다.
- zSpRY-ABE8e가 NYN PAM보다 NRN PAM에 대해 더 높은 선호도를 나타내므로(여기서, R은 A 또는 G이고, Y는 C 또는 T임)18, PAM 서열로서 NRN을 우선적으로 선택한다. 타겟 아데닌 뉴클레오티드가 고활성 편집 창(protospacer를 따라 세 번째에서 아홉 번째 뉴클레오티드)에 있는지 확인합니다.
- 양쪽 끝에서 2′-O-메틸-3′-포스포로티오에이트(MS)로 변형된 EasyEdit sgRNA(EE gRNA)를 주문합니다(그림 1).
참고: EE gRNA는 RNase가 없는 물에 용해되어 -80°C에서 보관해야 합니다. - zSpRY-ABE8e 플라스미드18을 선형화합니다.
- 6 μg의 플라스미드를 XbaI 효소(재료 표)로 37°C의 금속 수조에서 3시간 동안 선형화합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 DNA 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 선형화된 플라스미드를 정제합니다.
- 시험관 전사 키트(Table of Materials)를 사용하여 mRNA를 전사합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 선형화된 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 zSpRY-ABE8e mRNA를 전사합니다.
참고: mRNA 및 gRNA와 관련된 모든 작업에는 RNase가 없는 실험실 용품을 사용해야 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 선형화된 플라스미드를 템플릿으로 사용하여 zSpRY-ABE8e mRNA를 전사합니다.
- RNA 정제 키트(표 재료)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 mRNA를 정제합니다.
참고: 용리하기 전에 에탄올은 세포 독성을 피하기 위해 건조되어야 하며 mRNA는 즉시 사용하지 않을 경우 -80°C에서 보관해야 합니다.
2. 미세주입 유리 모세관 준비
- 마이크로피펫 풀러 시스템을 설정하고 최소 30분 동안 예열합니다.
- 램프 테스트를 실행하여 제조업체의 지침에 따라 붕규산 유리 모세관(외경 1mm, 내경 0.58mm)을 녹이는 데 필요한 열량을 결정합니다.
- 프로그램을 선택하고 키보드의 숫자를 클릭하여 매개 변수 값을 입력하십시오. 다음 매개변수를 설정하여 유리 모세관을 당깁니다: 열 = ramp 테스트 값, 당김 = 50, 속도 = 100, 시간 = 50 및 압력 = 30.
- 모세관을 설치하고 홈에 있는지 확인합니다. PULL START/STOP 을 눌러 프로그램을 실행합니다.
- 당겨진 모세관을 틈이 있는 폼에 삽입하여 보존하고 바늘을 매달린 상태로 유지합니다.
3. zSpRY-ABE8e mRNA 및 EE gRNA 혼합물을 제브라피쉬 배아에 미세주입
- 주사 전날 밤에 번식 탱크를 설치하십시오. 칸막이를 삽입하고 암컷 2마리와 수컷 AB 균주 제브라피쉬(3-18개월령) 1마리를 각 수조에 넣고 뚜껑으로 덮습니다. 성별 구분에 대해서는 이전 간행물을 참조하십시오39.
참고: 더 많은 배아를 얻으려면 최소 1주일 동안 번식하지 않은 물고기를 선택하십시오. - 주사 다음날 아침, zSpRY-ABE8e mRNA 및 EE gRNA를 얼음 위에서 해동한다. mRNA와 gRNA를 각각 400ng/μL 및 200ng/μL의 최종 농도로 혼합합니다.
- RNase가 없는 팁과 튜브를 사용하여 얼음 위에서 전체 절차를 수행하고 장갑으로 다루십시오.
- 공압 마이크로 인젝터를 구성합니다. 에어 펌프의 분압 밸브를 닫고 메인 밸브를 먼저 열고 가스 실린더의 나사를 풀고 분압 밸브의 압력을 0.2MPa/29psi로 조정합니다.
- 공압 마이크로 인젝터를 켜고 모드를 TIMER로 설정하고 초기 매개변수 압력 값을 20.0psi로, TIMER 값을 0.040초로 조정합니다.
- 미세 집게를 사용하여 당겨진 유리 모세관의 바늘을 실체 현미경으로 조심스럽게 부수고 바늘이 융모막과 알의 피어싱을 용이하게 하기 위해 비스듬히 절단되었는지 확인합니다.
알림: 바늘의 절단점은 올바른 위치에 있어야 하며 계란을 뚫을 수 있을 만큼 강하면서도 계란 손상을 최소화할 수 있을 만큼 얇아야 합니다. - 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 zSpRY-ABE8e mRNA와 gRNA의 혼합물을 유리 모세관의 끝에 추가하여 모세관에 기포가 생기지 않도록 합니다. 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 부착하고 마이크로 캡을 사용하여 주입 당 2nL의 혼합물이 생성되도록 인젝터의 압력과 TIMER 값을 구성합니다.
- 번식 탱크의 칸막이를 뽑고 물고기가 10-15 분 동안 번식하도록하십시오. 여과기를 사용하여 알을 수집하고 실체 현미경으로 알의 세포 단계와 품질을 검사합니다. 편집 효율을 높이기 위해 주입 할 단일 세포 상태의 난자를 선택하십시오.
- 1.5% 아가로스 주입 플레이트에 난자를 정렬하고 현미경으로 배아의 난황이 아닌 세포에 혼합물 2nL를 주입하여 편집 효율을 향상시킵니다. 대조군으로 최소 15개의 알을 유지합니다.
- 1x E3 버퍼를 사용하여 페트리 접시에 계란을 모으고 28°C의 인큐베이터에 넣습니다. 죽은 난자를 제거하고 수정 후 48시간까지 12시간마다 배양 완충액을 교체합니다(hpf).
4. EditR을 이용한 베이스 편집의 효율성 분석
- 48hpf에서 무작위로 선택된 6개의 주입된 배아와 무작위로 선택된 6개의 대조군 배아로 구성된 3개의 풀을 각각 PCR 튜브에 수집합니다. 피펫을 사용하여 잔류 E3 완충액을 흡인합니다.
- PCR 튜브에 50mM NaOH 40μL를 추가합니다. 튜브를 95°C의 금속 수조에 20분 동안 넣은 다음 15초 동안 소용돌이칩니다.
- 4 μL의 1 M 트리스· HCl(pH 8.0)을 각 튜브에 넣고 NaOH를 중화시킨다. 실온에서 2,000 x g 에서 10초 동안 잠시 원심분리하여 튜브 벽에서 물방울을 제거합니다. 상층액을 새 PCR 튜브에 모아 -20°C에서 보관합니다.
- gRNA 표적 부위의 업스트림 및 다운스트림에 적절한 프라이머를 설계합니다. 50 μL 부피의 PCR 반응을 위한 주형으로 상기 상청액 1 μL를 사용한다. 본 연구에서 PCR에 사용된 프라이머는 보충 표 1에 열거되어 있다.
- 정확하고 특이적인 밴드를 보장하기 위해 DNA 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 이어서 이전에 기술된 바와 같이 Sanger 시퀀싱을 수행한다40.
- EditR (1.0.10) 프로그램41을 사용하여 Sanger 시퀀싱 데이터를 분석한다.
- 시퀀싱 파일(ab1 형식)을 ".ab1 파일 업로드" 상자에 업로드합니다.
- "Enter gRNA sequence" 상자에 5′-3′ 방향의 20bp gRNA 서열을 입력합니다.
- 염기서열 분석 파일(ab1 형식)을 열고 20bp gRNA 염기서열이 시작되고 끝나는 염기 위치를 확인합니다. "5′ 시작" 및 "3′ 끝" 상자에 해당 기본 위치를 입력합니다.
- Predicted Editing(예측 편집)을 클릭하여 기본 편집 효율성을 얻습니다. 무질서한 피크 또는 인델을 피하기 위해 gRNA 표적 서열 근처의 염기서열 분석 데이터의 품질을 확인하십시오.
참고: 일반적으로, 무질서한 피크는 PCR 어닐링 온도를 조정함으로써 효과적으로 제거될 수 있다.
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Representative Results
TSR2의 돌연변이는 다이아몬드 블랙팬 빈혈(DBA)을 유발하는 것으로 보고되었습니다42. 여기에서 DBA 제브라피쉬 모델은 i-Silence 전략을 사용하여 tsr2(M1V) 돌연변이로 구성되었습니다. 제브라피쉬 tsr2의 시작 코돈의 아데닌은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 성공적으로 구아닌으로 전환되었습니다(그림 3).
Sanger 염기서열 분석 결과의 EditR 분석은 tsr2 시작 코돈의 아데닌 염기에서 A/G 중첩이 있음을 보여주었습니다(그림 4).
F0 창시자가 이전에 생성된 tsr2 이형접합체 돌연변이 성인과 교배된 후, 수정 후 2일(dpf)에 현미경으로 배아 표현형을 관찰했습니다. 몇몇 배아는 대조군에 비해 눈이 작고 심낭이 부어오른 표현형을 나타냈습니다(그림 5). 배아를 0.03% 트리카인으로 마취하고, 4% 메틸셀룰로스에 고정하고, 사진을 찍었다.
그림 1: zSpRY-ABE8e 단백질에 로딩된 EE gRNA의 서열 및 2차 구조 개략도. 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 검은색 별표로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 코돈 최적화 TadA8e(zTadA8e) 및 코돈 최적화 SpRYCas9(zSpRYCas9)를 포함하는 zSpRY-ABE8e mRNA 구조의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: zSpRY-ABE8e를 사용한 제브라피쉬 tsr2 (M1V) 돌연변이의 개략도. PAM 염기서열은 빨간색으로 강조 표시되고, 편집된 염기는 파란색으로 강조 표시되며, 표적 아미노산은 굵게 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: zSpRY-ABE8e를 사용한 제브라피쉬 tsr2 (M1V) 돌연변이의 시퀀싱 크로마토그램 결과. x축은 염기서열을 나타내고, y축은 피크 높이를 나타내며, 편집된 염기는 빨간색 화살촉으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 대조군과 비교한 2dpf에서 tsr2(M1V) 배아의 표현형. (ᄀ,ᄃ) 2dpf에서 (A,B) 야생형 AB 제브라피쉬 및 (C,D) tsr2(M1V) 배아의 측면도 및 (B,D) 등쪽 보기. C의 빨간색 화살촉은 심낭 부종을 나타냅니다. 빨간색 프레임과 지름은 눈 크기를 반영합니다. 스케일 바: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 기본 편집기 zSpRY-ABE8e를 사용하여 제브라피쉬 질병 모델을 구성하는 방법을 설명합니다. 염기 치환을 위한 기존 HDR 경로와 비교할 때 이 프로토콜은 보다 효율적인 염기 편집을 달성하고 인델 발생을 줄일 수 있습니다. 동시에, 이 프로토콜은 제브라피쉬에서 최근에 제안된 i-Silence 유전자 녹아웃 전략을 구현하는 것을 포함합니다. 종합하면, zSpRY-ABE8e는 질병 연구에서 제브라피쉬 모델의 적용을 향상시킬 것입니다.
타겟 이탈 효과는 CRISPR/Cas9 시스템에서 흔히 발생하는 문제입니다. PAM이 없는 제한을 고려할 때, tsr2 표적18을 포함한 이전 연구에서 유의미한 off-target이 발견되지 않았더라도 zSpRY-ABE8e의 off-target 효과는 더 높을 수 있습니다. 다행스럽게도 이 문제는 엄격한 gRNA 설계 표준으로 피할 수 있으며, 이는 하나의 게놈 서열만 gRNA와 PAM과 정확히 일치하도록 보장하고 예측된 비표적 부위의 총 수를 최소한으로 유지합니다. 또한, 연구에 따르면 리보핵단백질(RNP)과 gRNA를 주입하면 mRNA와 gRNA를 주입하는 것에 비해 표적 이탈 확률이 감소하는 것으로 나타났습니다43. 또한, gRNA와 Cas9의 변형은 off-target effect를 감소시킬 수 있다44,45. 제브라피쉬에서는 표적 표현형에 대해 여러 세대의 번식을 스크리닝하여 표적 이탈 효과가 낮은 동물 모델을 얻을 수도 있습니다.
이 프로토콜에는 여전히 몇 가지 제한 사항이 있습니다. zSpRY-ABE8e에는 PAM 제한이 없지만 여전히 PAM 선호도를 나타내며 제브라피쉬에서 NRN이 NYN보다 선호됩니다. 또한 ABE는 두 가지 유형의 기본 대체만 구현할 수 있으므로 부분 모델 구성에만 적용할 수 있습니다. 제브라피쉬의 나머지 기본 대체를 구현하려면 더 많은 기본 편집기를 개발해야 합니다.
결론적으로 이 프로토콜은 zebrafish에서 zSpRY-ABE8e 단일 기본 편집기 사용에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구축할 수 있는 실현 가능하고 효율적인 방법을 제공하여 SNV 관련 질병의 발병기전 및 치료 연구에서 제브라피쉬 모델의 적용을 확장합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji(Edanz)의 Barbara Garbers 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 광둥성 핵심 지역 연구 개발 프로그램(2019B030335001), 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2019YFE0106700), 중국 국립 자연 과학 재단(32070819, 31970782), 광둥성 수생 경제 동물을 위한 병원성 생물학 및 역학 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(PBEA2020YB05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | 1.5% Agarose used to make an injection plate |
| Borosilicate Glass Capillaries | Harvard Apparatus | BS4 30-0016 | |
| Cell culture dishes | Falcon | 351029 | |
| ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit | Vazyme | C115 | Kit for Infusion clone |
| Codon optimization service | Sangon Biotech | ||
| Drummond Microcaps | Drummond Microcaps | P1299-1PAK | Length:32 mm, capacity:0.5 μL |
| EasyEdit gRNA service | GenScript | ||
| Fine Forceps | Fine Scientific Instrument | 11254-20 | Used to break meedle |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | Used to pull the glass capillaries |
| HotStart Taq PCR StarMix | Genstar | A033-101 | Used for PCR reaction |
| Intelligent artificial climate box | TENLIN | PRX-1000A | Used to culture zebrafish embryos |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | Used to fix zebrafish when photographing |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| mMACHINE kit | |||
| Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2 | Vazyme | C214-01 | Kit for site-directed mutagenesis |
| Pneumatic Microinjector | ZGene Biotech | ZGPCP-1500 PLUS | |
| pT3TS-zSpCas9 | Addgene | 46757 | |
| RNeasy FFPE kit | Qiagen | 73504 | Kit for RNA purification |
| Sanger Sequencing service | Sangon Biotech | ||
| Sodium hydroxide, granular | Sangon | A100173-0500 | NaOH used for genome extraction |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX10 | Used for photograph of phenotype |
| SZ Series Zoom Stereo Microscope | CNOPTEC | SZ650 | |
| T3 mMESSAGE | Ambion | AM1348 | Kit for in vitro transcription |
| TIANprep Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP103-03 | Kit for plasmid extraction kit |
| TIANquick Mini Purification Kit | TIANGEN | DP203-02 | Kit for purification for linearized plasmid |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Used to anesthetize zebrafish |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane | Sangon | A600194-0500 | Component of Tris·HCl used for genome extraction |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | Restriction endonuclease used for plasmid linearization |
References
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