Summary
Malaria overføres gjennom inokulering av sporozoittstadiet av Plasmodium av infiserte mygg. Transgenic Plasmodium har gjort det mulig for oss å forstå malariabiologien bedre og har bidratt direkte til utviklingsarbeidet for malariavaksiner. Her beskriver vi en strømlinjeformet metodikk for å generere transgene Plasmodium berghei sporozoitter.
Abstract
Malaria er en dødelig sykdom forårsaket av parasitten Plasmodium og overføres gjennom bitt av kvinnelige Anopheles mygg. Sporozoittstadiet av Plasmodium avsatt av mygg i huden på vertebratverter gjennomgår en fase med obligatorisk utvikling i leveren før klinisk malaria initieres. Vi vet lite om biologien bak Plasmodium-utviklingen i leveren; Tilgang til sporozoittstadiet og evnen til genetisk modifisering av slike sporozoitter er kritiske verktøy for å studere arten av Plasmodium-infeksjon og den resulterende immunresponsen i leveren. Her presenterer vi en omfattende protokoll for generering av transgene Plasmodium berghei sporozoitter. Vi genmodifiserer blodstadiet P. berghei og bruker dette skjemaet til å infisere Anopheles-mygg når de tar et blodmåltid. Etter at de transgene parasittene har gjennomgått utvikling i myggene, isolerer vi sporozoittstadiet av parasitten fra myggspyttkjertlene for in vivo og in vitro-eksperimentering . Vi demonstrerer gyldigheten av protokollen ved å generere sporozoitter av en ny stamme av P. berghei som uttrykker det grønne fluorescerende proteinet (GFP) underenhet 11 (GFP11), og viser hvordan det kan brukes til å undersøke biologien til malaria i leverstadiet.
Introduction
Til tross for fremskritt innen narkotikautvikling og forskning på malariaforebygging og behandling, er den globale sykdomsbyrden av malaria fortsatt høy. Over en halv million mennesker dør av malaria hvert år, med de høyeste nivåene av dødelighet sett blant barn som bor i malaria-endemiske regioner, som Afrika sør for Sahara1. Malaria er forårsaket av parasitten Plasmodium, som overføres til mennesker gjennom bitt av kvinnelige Anopheles-mygg som bærer parasitten i spyttkjertlene. Det smittsomme stadiet av Plasmodium - sporozoittene - blir avsatt i huden til vertebratvertene under et blodmåltid og reiser gjennom blodet for å infisere leverceller, hvor de gjennomgår obligatorisk utvikling (som utgjør pre-erytrocytisk malaria) før infeksjon av erytrocytene. Infeksjonen av erytrocyttene initierer blodstadiet av malaria og er ansvarlig for hele sykeligheten og dødeligheten forbundet med sykdommen 2,3.
Den obligatoriske karakteren av den pre-erytrocytiske utviklingen av Plasmodium har gjort det til et attraktivt mål for profylaktisk vaksine- og legemiddelutviklingsarbeid4. En forutsetning for å studere biologien til pre-erytrocytisk malaria, samt utvikling av vaksiner eller legemidler rettet mot leverstadiet, er tilgang til Plasmodium sporozoitter. Videre har vår evne til å generere genmodifiserte Plasmodium sporozoitter vært medvirkende til suksessen til slike forskningsbestrebelser 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-linjer som uttrykker fluorescerende eller selvlysende reporterproteiner har gjort det mulig for oss å spore deres utvikling in vivo og in vitro 10,11. Genetisk svekkede parasitter (GAPs), generert gjennom sletting av flere gener i Plasmodium, er også noen av de mest lovende vaksinekandidatene12,13.
Gnagere og ikke-menneskelige primatmalariamodeller har hjulpet oss med å forstå mekanismene for vertsparasittinteraksjoner i menneskelig malaria på grunn av likhetene i biologi og livssyklus blant Plasmodium-arter 14. Bruken av Plasmodium-arter som infiserer gnagere, men ikke mennesker (f.eks. P. berghei) tillater vedlikehold av hele parasittens livssyklus og generering av smittsomme sporozoitter for å studere malaria i leverstadiet i en kontrollert, biosikkerhetsnivå 1-innstilling. En rekke separate protokoller eksisterer allerede for generering av transgene blodstadium Plasmodium-parasitter 15, infeksjon av mygg16 og isolering av sporozoitter17. Her skisserer vi en omfattende protokoll som kombinerer disse metodene for å generere og isolere transgene P. berghei-sporozoitter, ved å bruke den nye transgene stammen PbGFP11 som et eksempel. PbGFP 11 trafikkerer den 11. β-strengen av supermappegrønt fluorescerende protein (GFP), GFP11, inn i den parasitoforøse vakuolen (PV) generert i vertshepatocytter. PbGFP 11 brukes sammen med transgene hepatocytter (Hepa1-6 bakgrunn) som uttrykker rester som utgjør GFP 1-10-fragmentet (GFP 1-10) i cytoplasma (Hepa GFP 1-10 celler). PbGFP11 rapporterer PV-lyse i vertshepatocytter gjennom selvkomplementering og reformasjon av funksjonell GFP og det grønne fluorescenssignalet18. Merk at GFP 11 er kodet som en serie på syv tandemsekvenser i PbGFP11 for å forbedre det resulterende fluorescenssignalet. Ved farging av PbGFP11 sporozoitter med cytoplasmatisk fargestoff CellTrace Violet (CTV), kan vi spore parasittene. Lysis av slike CTV-fargede intracellulære parasitter resulterer i lekkasje av CTV inn i vertscellecytoplasma og farging av vertscellen. I tillegg til å visualisere og skille lysis av Plasmodium PV og / eller parasitten i vert hepatocytter, kan dette systemet pålitelig brukes til å studere immunveiene som er ansvarlige for en av disse prosessene, gjennom genetisk eller terapeutisk forstyrrelse av molekylære komponenter av slike veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All forskning som involverer virveldyr i laboratoriet vårt ble utført i samsvar med University of Georgia retningslinjer og protokoller for dyrebruk.
1. Generasjon av P. berghei-infiserte mus
- Start blodstadiuminfeksjon hos hann eller kvinne, 6-8 uker gamle C57BL/6 (B6) mus ved hjelp av villtype P. berghei-parasitter. For å gjøre dette, overfør kryopreservert P. berghei-infisert blod (2 x 105 infiserte RBC), rekonstituert i 400 μL fosfatbufret saltvann (PBS), til en eller to donormus intraperitonealt (i.p.).
- Overfør friskt blod samlet gjennom retro-orbital blødning fra donormusene 5 dager etter infeksjon (d.p.i.) til to naive B6-mus. For å gjøre dette, samle 200 μL blod, rekonstituer med 300 μL PBS og injiser 200 μL i.p. i mottakermusene. Sørg for at parasitemi i giverne på dette tidspunktet er 2% -5%19,20.
- Overvåk parasitemi som tidligere beskrevet19,20, fra 2 d.p.i. hos mottakerne. Når parasittemi varierer fra 3% -5% (rundt 5 d.p.i.), avlive mottakermusene og samle deretter blod gjennom hjertepunktering eller retro-orbital blødning. Euthanize musene ved hjelp av karbondioksid innånding etterfulgt av cervical dislokasjon, eller i henhold til institusjonelle retningslinjer.
MERK: Når parasittemi overstiger 5%, kan transfeksjonseffektiviteten reduseres på grunn av økt forekomst av multipliserende infiserte RBC.
2. Generasjon av schizonter i kultur
- Samle blod fra de infiserte musene i trinn 1,3 (ca. 2 ml totalt fra to mus) til 5 ml Alsevers oppløsning (se materialfortegnelse) i et sterilt miljø. Utfør trinn 2.1 til 3.12 under sterile forhold.
MERK: Sterile forhold inkluderer bruk av hansker, tørking av hansker og overflater med 70% etanol, bruk av sterile forbruksvarer og materialer, og arbeid i et biosikkerhetsskap. - Sentrifuger blodet i 8 minutter ved 450 x g ved romtemperatur (RT). Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 10 ml komplette RPMI-medier (RPMI 1640 med 20 % føtalt bovint serum [FBS] og 1 % penicillin-streptomycin, v/v).
- Sentrifuge i 8 min ved 450 x g ved RT. Heng pelleten på nytt i 25 ml komplette RPMI-medier og overfør til en T75 dyrkningskolbe med filterhette.
- Plasser i en inkubator ved 36,5 ° C og 5% CO2, mens du rister forsiktig for å holde cellene i suspensjon i 16 timer.
- På 16 h tidspunkt, sjekk for schizont utvikling. For å gjøre dette, samle 500 μL av prøven, sentrifuge ved 450 x g i 8 minutter, resuspender pelleten i 10 μL komplett RPMI-media og lag et tynt blodsmør. Beis blodutstryket med Giemsa-flekk19 (se materialtabell) og bestem hyppigheten av schizonter (figur 1).
- For optimal transfeksjonseffektivitet bør 60% -70% av parasittene være i schizontstadiet. Hvis færre enn denne terskelen er bestemt, fortsett å dyrke som i trinn 2.4 og kontroller hver time for å sikre at terskelen ovenfor er overskredet før du fortsetter.
3. Transfeksjon av Plasmodium schizonts
- Klargjør en graderingssentrifugeringsbuffer ved å rekonstituere 13 ml tetthetsgradientstammedium (se materialtabell) med 1,44 ml 1,5 M NaCl og 5,6 ml 0,15 M NaCl i et 50 ml sentrifugeringsrør.
- Overfør 25 ml blodkultur til et nytt 50 ml sentrifugeringsrør. Legg forsiktig 20 ml gradient sentrifugeringsbuffer til bunnen av sentrifugeringsrøret ved hjelp av en smal glasspipette for å lage en gradientkolonne. Pass på at du ikke forstyrrer væskelagene og grensesnittene, og sørg for et klart skille mellom bufferen og mediet.
- Sentrifuge i 20 min ved 450 x g uten brems ved RT. Bruk en Pasteur-pipette, fjern forsiktig schizontlaget15 som ligger ved grensesnittet til kulturmediet og gradientsentrifugeringsbufferen, og plasser det i et nytt 50 ml sentrifugeringsrør.
- Resuspender de isolerte schizontene i komplette RPMI-medier og øk totalvolumet til 40 ml. Sentrifuge ved 450 x g i 8 min ved RT og kast supernatanten.
- Schizontene resuspenderes i 10 ml komplette RPMI-medier. Deretter overføres 1 ml av denne løsningen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør for hver transfeksjon, og sentrifuge ved 16 000 x g i 5 s for å pelletere de infiserte RBC-ene. De infiserte RBC-ene avledet fra to mus på ovennevnte måte kan brukes til opptil 10 separate transfeksjoner.
- Kombiner 100 μL av elektroporasjonsbufferen (nukleofektoroppløsning fra elektroporeringssettet; se materialtabell) ved RT med 5 μg sirkulært eller linearisert målplasmid-DNA (i opptil maksimalt 10 μL volum), som gjelder for hver transfeksjon i separate 1,5 ml mikrosentrifugerør. En "no plasmid" prøve må inkluderes som en kontroll for transfeksjon og antibiotika seleksjon.
- Fjern supernatanten etter sentrifugering fra trinn 3.5 og resuspender forsiktig de infiserte RBCene i den preparerte nukleofektoroppløsningen + plasmid-DNA (fra trinn 3.6).
- Overfør suspensjonen (nukleofektorløsning + plasmid + schizonter; maksimalt 110 μL) til elektroporeringskyvetter. Transfekt ved hjelp av et egnet nukleofektorprogram (U-033, se materialfortegnelse).
MERK: Kontroller at trinn 3.8 til 3.10 utføres på RT. - Tilsett 100 μL komplette RPMI-medier til kyvetten og overfør hele løsningen (nå 200 μL totalt volum) til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og hold på RT.
- Injiser 200 μL-oppløsningen av transfekterte parasitter i mus intravenøst (i.v.), og arbeid for å minimere tiden mellom transfeksjon og den endelige injeksjonen i mus.
MERK: Transfekterte schizonter injiseres i mus mindre enn 5 minutter etter elektroporering for å maksimere effektiviteten til protokollen.
4. Utvalg av transfektede parasitter
- Kontroller parasitteminivåene hos musene som er inokulert med transfekterte schizonter daglig fra 2 d.p.i. for å verifisere infeksjon.
- Når infeksjonen er bekreftet, start legemiddelvalg ved oral administrering av legemidlet i drikkevann, tilbys ad libitum.
MERK: Pyrimetamin ble brukt som valgbar legemiddelmarkør for plasmidet. I dette tilfellet ble 17,5 mg pyrimetamin tilsatt til 250 ml rent vann (endelig konsentrasjon på 70 mg/l). I tillegg ble 10 g sukker tilsatt dette vannet for å oppmuntre til tilstrekkelig forbruk av pyrimetaminholdig vann av mus. - Overvåk parasitemi hver annen dag ved hjelp av blodutstryk laget med 5 μl blod, fra 6 dager etter initiering av pyrimetaminbehandling. Mangelen på detekterbare parasitter etter 15 dager indikerer en mislykket transfeksjon; I dette tilfellet starter du prosessen på nytt fra trinn 1.1 for et nytt forsøk.
- Når parasitemi når minst 1%, overfør parasittene til naive B6-mus for å skape parasittbestander i blodstadiet. Fortsett seleksjonen i de nylig infiserte musene til parasitemi når 2% -5%, på hvilket tidspunkt generere bestander og kryobevare dem21.
5. Infeksjon av mygg med transgene linjer
- Infiser B6-mus med 200 μL blod som inneholder de valgte parasittene (2 x 105 infiserte RBC / mus, i.v.). Bestem parasitemi hos disse musene på dagen for myggfôring og infeksjon. Parasittemi mellom 2% -5% er optimal for infeksjon av mygg. Når det er bekreftet, overfør umiddelbart infeksjonen til de kvinnelige Anopheles stephensi-myggene i henhold til trinn 5.2-5.4).
MERK: Inkubatorer som inneholder mygg for infeksjon bør opprettholdes ved 20,5 ° C, ved 80% fuktighet, og på en 12 timers lys / mørk syklus (lys på mellom 07:00 til 07:00). - Dagen før mygginfeksjon, separer hunnmyggen ved å plassere en varmekilde på toppen av buret som inneholder både hann- og hunnmygg, for eksempel en tynn plastblære eller hanske fylt med vann oppvarmet til 37 °C. Fjern hunnmyggen, som tiltrekkes av varmekilden, ved hjelp av en insektssuger og overfør disse til et eget, mindre bur for infeksjon.
MERK: Hannmygg kan skilles fra hunnmygg ved sin litt reduserte kroppsstørrelse og plumoseantenner. - Injiser de infiserte musene med en generell bedøvelse (f.eks. 2% tribromoetanol / avertin). Sørg for fullstendig anestesi ved å klemme fotputen på hver mus godt. Hvis de ikke reagerer, er de tilstrekkelig bedøvet og klar til å overføre infeksjonen til mygg.
- Plasser de bedøvede musene på toppen av hunnmyggene i bur (fra trinn 5.2) under sternal recumbency. Spre for- og bakbena manuelt for å gi størst mulig overflateareal for myggfôring. La de infiserte musene ligge over hvert bur i totalt 15 minutter, og kontroller hvert 5. minutt for å sikre at musene ikke er våkne. Når fôringen er fullført, avlive musene ved hjelp av cervikal dislokasjon, eller i henhold til den institusjonelle dyrebruksprotokollen, og kast dem trygt.
6. Innsamling av sporozoitter
- Sjekk myggmidguts for oocyster ved ca. 10 d.p.i. for å verifisere vellykket infeksjon og utvikling av Plasmodium i myggene. Isoler myggmidguts fra magen ved å fjerne det terminale buksegmentet ved hjelp av tang. Visualiser midguts under polarisert lys for tilstedeværelse av oocytter22.
- Villtype sporozoitter forventes å være tilstede i spyttkjertlene hos mygg 18-21 dager etter fôring på infiserte mus. På dag 18, dissekere 5-10 mygg for å vurdere sporozoitt tall.
MERK: Mygg vaskes og drepes i etanol. Deretter vaskes døde mygg to ganger med PBS for å fjerne rusk før disseksjon. - For å isolere og telle sporozoittene, fjern forsiktig myggens hode mens du legger press på mygg thorax ved hjelp av tang eller en fin dissekerende nål. Spyttkjertlene forblir festet til det fjernede hodet (figur 2).
- Fjern eventuelle ekstra myggrester fra spyttkjertlene og sett i et mikrosentrifugerør som inneholder 400 μL myggdisseksjonsmedier (Dulbeccos modifiserte Ealge-medium [DMEM] med 1% museserum, 100 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin, se materialfortegnelse).
- Forstyrr de isolerte spyttkjertlene ved å passere gjennom en 30 G nålsprøyte 15-20 ganger. Plasser 10 μL av de forstyrrede spyttkjertlene i myggdisseksjonsmedier i et hemocytometer og teller. Resuspend i ønsket konsentrasjon av myggdisseksjonsmedier eller PBS for injeksjon i mus, inokulering i cellekulturer eller langsiktig kryopreservering23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestemmelse av frekvensen og utviklingen av schizonter er avgjørende for å sikre at nok levedyktige parasitter er i det optimale stadiet for transfeksjon. Umodne schizonter kan differensieres fra fullt modne schizonter ved tilstedeværelsen av færre merozoitter som ikke fyller hele det intracellulære rommet til RBC (figur 1B). Det er viktig å merke seg at ved blodutstryk fra dyrket blod kan infiserte RBC bryte opp, noe som resulterer i observasjon av frie, ekstracellulære merozoitter i blodutstryket (figur 1). Slike merozoitter teller ikke med i vurderingen av frekvensen av schizonter i trinn 2.5.
Fjerning av spyttkjertler fra mygg kan være utfordrende hvis brukeren ikke er kjent med myggfysiologi eller småskala disseksjoner. Under isolering av spyttkjertler fra mygg, merk at translucensen av kjertlene kan brukes til å skille dem fra ugjennomsiktig myggavfall (figur 2). Tellingen av sporozoitter etter forstyrrelse av kjertlene er mest effektiv ved 400x forstørrelse, og bruk av fasekontrast gjør det lettere å identifisere sporozoittene i tellekammeret.
Vi har vist at over 90% av Plasmodium i hepatocytter muligens elimineres gjennom celle-iboende immunmekanismer23. Derfor forventer vi at parasitter i et betydelig antall hepatocytter gjennomgår lysis. Som et verktøy for å bestemme lysen av Plasmodium eller dets PV i vertshepatocytter, genererte vi transgene hepatocytter som uttrykker GFP 1-10-subenheten (Hepa-GFP1-10) og transgen P. berghei som uttrykker og trafikkerer GFP 11-underenheten til PV (Pb-GFP 11). GFP 1-10-fragmentet, som inneholder restene som utgjør GFP-kromoforen, er ikke-fluorescerende av seg selv og fluorescerer bare ved tilknytning til GFP 11, potensielt gjennom selvkomplementering. I tillegg til funksjonelt validerende transgenese i Plasmodium, indikerte genereringen av grønt fluorescenssignal i Pb-GFP 11-infiserte Hepa-GFP1-10 vertsceller lysen av PV (figur 3). Wild-type P. berghei-infiserte Hepa-GFP 1-10 celler eller Pb-GFP11-infiserte villtype Hepa 1-6 celler klarte ikke å generere noe grønt fluorescenssignal (data ikke vist). Vi anser lysis av PV for å være et sentralt foregående trinn i ødeleggelsen av leverstadiet Plasmodium. Pb-GFP11 sporozoittene ble også farget med CTV for å visualisere parasittene i hepatocytter. CTV forventes å lekke inn i vertscellen først ved lysering av selve parasitten (figur 3). Det dispergerte CTV-signalet observert i vertshepatocytten indikerer sannsynligvis lysen av parasitten i hepatocytten. Den tette overlappingen mellom CTV- og GFP-signalene forventes med samtidig lysering av både PV og parasitten. Dette systemet tillater oss å spørre de distinkte bidragene fra de enkelte vertsmolekylene i medfødte og celle-inneboende immunveier ved modulering av lysis av Plasmodium eller dets PV.
Figur 1: Plasmodium berghei schizonts. Representative lysmikroskopibilder som viser P. berghei schizonter i parasitisert musblodkultur (16 timer) farget med Giemsa-flekk. Pilene indikerer fullt modne (A) eller umodne (B) schizonter. Skala barer: 5 μm . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Myggspyttkjertler og sporozoitter. Lysmikroskopibilder som viser spyttkjertler isolert fra Pb-GFP11-infiserte hunnmygg av Anopheles . (A) Bilde av et mygghode med spyttkjertlene (pilen) fortsatt intakt under disseksjon, før fjerning og videre behandling (skalastang: 1 mm). (B,C) Representative bilder av spyttkjertler ved lavere (B) og høyere (C) forstørrelser (skalastenger: henholdsvis 0,1 mm og 0,04 mm). Sporozoitter kan sees både på innsiden og utsiden av kjertelen (pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av lysis av Plasmodium og dets parasitoforøse vakuol i vertshepatocytter. Differensiell interferenskontrast (DIC) og pseudofargede immunfluorescensbilder med overlegg som viser Hepa-GFP1-10 hepatocytter infisert med Pb-GFP11 sporozoitter. Sporozoitter ble farget med CTV før infeksjonen (skala bar: 10 μm). Totalt 1 x 106 Hepa-GFP 1-10 hepatocytter ble belagt i en 35/10 mm glassbunnskulturskål og inokulert med 3 x 105PbGFP11 sporozoitter 4 timer etter plating. Bildene ble tatt med et invertert fluorescerende mikroskop ved 600x forstørrelse og 16 timer etter infeksjon. Forkortelser: DIC = differensiell interferenskontrast. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har brukt ovennevnte protokoll i vårt laboratorium for å lage flere linjer med transgene P. berghei-parasitter. Selv om den er optimalisert for P. berghei, har vi også med hell brukt denne protokollen til å generere transgene P. yoelii sporozoitter. Etter å ha injisert de transfekterte schizontene i mus, kan parasitter påvises vanligvis senest 3 d.p.i. i alle grupper, inkludert ingen plasmidkontroll. Utvelgelse startes først når parasittemi har blitt oppdaget for å sikre levedyktigheten til parasitter etter elektroporering. I tillegg, når du forbereder legemiddelvalg, kan forsuring av vannet med saltsyre, som bringer pH ned til 4, være nødvendig for at pyrimetamin skal oppløses helt. Vi forventer fullstendig clearance av parasittene fra ingen plasmidkontrollgruppe, mens musene inokulert med transfektorene forblir infisert. Clearance i kontrollmusene oppstår vanligvis 5-8 dager etter oppstart av pyrimetaminbehandling. Det er verdt å merke seg at B6-mus infisert med P. berghei kan vise tegn på eksperimentell cerebral malaria og bukke under for døden (følge humane endepunkter i henhold til institusjonelle retningslinjer for bruk av dyr), vanligvis i intervallet 6-12 d.p.i. Dette kan unngås ved å utføre legemiddelvalg av transfektantene i TCRaKO-mus25, eller ved å overføre parasittene som gjennomgår seleksjon ved 5 d.p.i. til nye B6-mottakere og fortsette seleksjonen i sistnevnte. Transgenese i Plasmodium kan verifiseres ved hjelp av en rekke tilnærminger, for eksempel genetiske skjermer, fenotypisk vurdering eller gevinst eller tap av spesifikke funksjoner.
Det er viktig å merke seg at valget av et egnet plasmid er avgjørende for vellykket transfeksjon og oppbevaring av det introduserte DNA i parasitten. Plasmider kan også vise begrenset effekt i å oppnå transgenese på tvers av forskjellige Plasmodium-arter. For eksempel pSKspGFP11-plasmidet (basert på PL0017; BEI ressurser) vi benyttet til å generere PbGFP11 kan brukes til å effektivt generere transgene P. yoelli også, men ikke P. chabaudi. For å generere pSKspGFP11 erstattet vi GFP-mutant3-sekvensen i det overordnede pL0017-plasmidet (BEI-ressurser) med syv tandemsekvenser av den 11. β-strengen av supermappe-GFP, GFP 11 (GFP11-7X)18. Selv om linearisering av plasmidene før transfeksjon tillater bedre genomisk integrasjon, viser både lineære og sirkulære plasmider lignende transfeksjonseffektivitet ved bruk av vår protokoll. Plasmodiumlinjene generert ved transfeksjon med sirkulære plasmider ser også ut til å opprettholde sine transgene egenskaper i løpet av genereringen av sporozoitter i myggene.
Spesielt kan bare kvinnelige mygg havne og overføre Plasmodium. Etter isolering av mygg anbefales det ikke å gi de isolerte myggene en kilde til sukkervann på dette stadiet. Å sulte dem på denne måten vil øke sjansen for at mannlige mygg som kan ha blitt utilsiktet overført dør, og hunnene fôrer blodet mer effektivt fra de infiserte musene. Vi returnerer vanligvis sukkervannet 1 dag etter overføring av infeksjonen fra mus til mygg. Det er bemerkelsesverdig at tidsrammen for utvikling og modning av sporozoitt i mygg kan variere mellom transgene Plasmodium-linjer . Derfor er det viktig å vurdere sporozoitttall i spyttkjertler på flere tidspunkter etter infeksjon før en protokoll spesifikk for hver transgen linje etableres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health tilskudd AI168307 til SPK. Vi takker UGA CTEGD Flow Cytometry Core og UGA CTEGD Microscopy Core. Vi anerkjenner også bidragene fra Ash Pathak, Anne Elliot og staben til UGA Sporocore i å optimalisere protokollen. Vi ønsker å takke Dr. Daichi Kamiyama for verdifull innsikt, diskusjon og foreldreplasmidene som inneholder GFP11 og GFP 1-10. Vi vil også takke medlemmer av Kurup-laboratoriet for deres konstante støtte, tålmodighet og oppmuntring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G x 1/2" Syringe needle | Exel international | 26437 | |
| Alsever's solution | Sigma-Aldritch | A3551-500ML | |
| Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2 | Lonza | VMI-1021 | |
| Avertin (2,2,2-Tribromoethanol) | TCI America | T1420 | |
| Blood collection tubes | BD bioscience | 365967 | for serum collection |
| C-Chip disposable hematocytometer | INCYTO | DHC-N01-5 | |
| CellVeiw Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 627860 | |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000107 | |
| Centrifuge 5910R | Eppendorf | 5910R | For gradient centrifugation |
| Delta Vision II - Inverted microscope system | Olympus | IX-71 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D5879-500ml | |
| Fetal bovine serum | GenClone | 25-525 | |
| GFP11 plasmid | Kurup Lab | pSKspGFP11 | Generated from PL0017 plasmid |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldritch | 48900-1L-F | |
| Hepa GFP1-10 cells | Kurup Lab | Hepa GFP1-10 | Generated from Hepa 1-6 cells (ATCC Cat# CRL-1830) |
| Mouse Serum | Used for mosquito dissection media | ||
| NaCl | Millipore-Sigma | SX0420-5 | 1.5 M and 0.15 M for percoll solution |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems (Lonza) | Program U-033 used for RBC electroporation | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-043 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldritch | P0781-100ML | |
| Percoll (Density gradient stock medium) | Cytivia | 17-0891-02 | Details in protocol |
| PL0017 Plasmid | BEI Resources | MRA-786 | |
| Pyrimethamine (for oral administration) | Sigma | 46706 | Preparation details: Add 17.5 mg Pyrimethamine to 2.5 mL of DMSO. Vortex, if needed to dissolve completely; Adjust pH of 225 mL of dH2O to 4 using HCL. Add Pyrimethamine in DMSO to water and bring to 250 mL. Add 10 g of sugar to encourage regular consumption of drugged water. Pyrimethamine is light sensitive. Use dark bottle or aluminum foil covered bottle when treating mice. |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| SoftWoRx microscopy software | Applied Precision | v6.1.3 |
References
- WHO.
- Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K.
- Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
- Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P.
- Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
- Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
- Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7 (2020).
- Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
- Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321 (2014).
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
- Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391 (2015).
- Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
- Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198 (2017).
- Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86 (2014).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
- Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426 (2020).
- Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
- Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
- de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
- Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287 (2019).
- Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098 (2022).
- Bowers, C., et al.
- Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).
